Westfälische Wilhelms-Universität Münster Institut für Molekulare Zellbiologie

Transkript

1 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Institut für Molekulare Zellbiologie Vorlesung "Grundlagen der Biologie I" WS 2012/13 Molekulargenetik Püschel 2012

2 Vorlesung Grundlagen der Biologie I Molekulargenetik 1 Einführung: Das Dogma der Molekularbiologie Teil 1 Molekulargenetik der Prokaryonten 2 Organisation und Replikation des bakteriellen Genoms 3 Transkription I: Prokaryonten Genregulation I: Prokaryonten 4 Translation in Prokaryoten 5 Rekombinante DNA I Teil 2 Molekulargenetik der Eukaryonten 6 Organisation des Genoms und Struktur der Chromosomen I 7 Organisation des Genoms und Struktur der Chromosomen II 8 Zellzyklus, Mitose, Meiose 9 Meiose und sexuelle Fortpflanzung 10 Formale Genetik: Mendel I 11 Formale Genetik: Mendel II 12 Transkription II: Eukaryoten 13 Genregulation II: Transkriptionsfaktoren 14 Genregulation III: Spleissen 15 Genregulation IV: Translation in Eukaryoten 16 Rekombinante DNA II 1

3 Literatur zur Vorlesung Vorlesung Purves Kapitel , , Empfehlung Biologie. Markl, Jürgen (Hrsg.); Purves, William K.; Sadava, David; Orians, Gordon H.; Heller, H. Craig. Spektrum Verlag, ISBN: Der Stoff der Vorlesung deckt sich weitgehend mit dem Lehrbuch Biologie ("Purves"). Die Kapitel 11 bis 18 beihalten den Stoff der Teils Molekulargenetik. Der Inhalt diser Kapitel ist Prüfungsstoff, unabhängig davon ob er in der Vorlesung explizit diskutiert wurde. 2

4 Fragen zur Vorlesung Grundlagen der Biologie I Molekulargenetik 1) Formulieren Sie in einem Satz das zentrale Dogma der Molekularbiologie. Gibt es Ausnahmen von diesem Dogma? 2) Benennen sie die Schritte, in denen die genetische Information umgesetzt wird. Welche Makromoleküle sind an den einzelnen Schritten beteiligt? 3) Das Polynucleotid 5'-GGACCTGACAAAGTCAAGTCTT-3' ist Bestandteil einer kodierenden Sequenz. Beantworten Sie folgende Fragen: a) Wie ist die Sequenz des komplementären Stranges, in 5'->3' Richtung geschrieben? b) Wie lautet die Sequenz der entsprechenden mrna? c) Die vorliegende Sequenz ist Teil eines offenen Leserasters. Können Sie aus dieser Sequenz mit Hilfe einer Codon-Tabelle eindeutig ableiten wie die Sequenz des Proteins lautet? Begründung? 4) An welchen zellulären Prozessen sind RNA-Moleküle beteiligt? Nennen Sie mindestens 3 derartige Prozesse. 5) Nennen Sie vier Eigenschaften, die die Struktur der DNA beschreiben. 6) Definieren Sie den Begriff Gen. 7) Welche Voraussetzungen braucht eine DNA-Polymerase um DNA replizieren zu können? 8) Wodurch unterscheiden sich "leading" und "lagging strand"? 9) Beschreiben Sie die Schritte bei der Synthese des "leading" und des "lagging strand". 10) Die DNA-Helicase entwindet bei der Replikation die DNA. Benötigt sie dazu Energie? Begründung? 11) Nennen Sie drei Stichworte, die die Replikation charakterisieren. 12) Welche der folgenden Sequenzen sind Bestandteil eines prokaryotischen Promotors? a) -10 Region b) Pribnow-Box c) CAAT-Box d) GC-Box e) Shine-Dalgarno-Sequenz f) terc-sequenz g) -35 Region h) Costello-box 13) Welchen Strang der DNA benutzt die RNA-Polymerase als Template, den codogenen oder den codierenden Strang? 14) Was ist ein Sigma-Faktor und was ist seine Funktion? 15) Die Transkription kann in drei Phasen unterteilt werden. Welche sind dies und wodurch sind sie charakterisiert? 16) Wie erfolgt die Termination der Transkription in Bakterien? 17) Was ist der Unterschied zwischen virulenten und temperenten Phagen? 18) Skizzieren Sie den Aufbau des lac-operons. 3

5 19) Definieren Sie die Begriffe Induktor, Repressor, Operator und Operon. 20) Was ist der Unterschied zwischen Regulator- und Strukturgenen? 21) Beschreiben Sie die Prozesse, die zur Transkription des lac-operons führen. 22) Skizzieren Sie die Struktur des Lac-Repressors. Was ist die Funktion der einzelnen Protein-Domänen? 23) Was ist die Funktion des Lac-Repressors? 24) Was bedeutet der Begriff Katabolit-Repression? 25) Sie lassen E. coli in drei verschiedenen Nährmedien wachsen und messen die Aktivität des lac-operons. Welche Ergebnisse würden Sie bei den folgenden Medien erwarten und warum? a) Mininalmedium mit Glucose b) Mininalmedium mit Lactose c) Mininalmedium mit Glucose und Lactose 26) Welche Konsequenzen haben folgende Mutationen für die Regulation des lac-operons: a) Eine Mutation im lac-operator, die die Bindung von LacI verhindet. b) Eine Mutation in lacz, die die Bindung von Lactose verhindert. c) Eine Mutation in laci, die die Bindung des Induktors verhindert. d) Eine Mutation in laci, die die DNA-Bindung verhindert. e) Eine Mutation in der CAP-Bindungsstelle. 27) Skizzieren Sie den Aufbau des trp-operons. 28) Wie unterscheidet sich die Regulation des trp-operons von der des lac-operons? 29) Welche Sequenzen der mrna legen ein Leseraster fest? 30) Welche RNA-Moleküle sind an der Translation eines Proteins beteiligt und was ist ihre Funktion? 31) Definieren Sie die Begriffe Codon und Anticodon. 32) Beschreiben Sie die Vorgänge während der Elongationsphase der Translation. 33) Wieviel Bindungsstellen für trnas hat ein Ribosom? Was ist deren Funktion? 34) Welche der folgenden DNA-Sequenzen sind palindromische Sequenzen? a) GAACCT b) GACGTC c) TTAAGC d) GAATTC e) GGATCC f) GATC g) CGAT h) AAGTTC i) AACGTT h) GTTAAG i) TTATAA j) TTATTA 35) Was sind Restriktionsenzyme? 36) Sie haben die Aufgabe ein Plasmid mit einem Restriktionsenzym in möglichst viele Fragmente zu zerlegen. Zur Auswahl haben Sie die folgenden Enzyme: HindIII (Erkennungssequenz: AAGCTT), HaeIII (GGCC) und NotI (GCGGCCGC). Welches Enzym würden Sie auswählen und warum? 37) Was sind Plasmide? Welche Merkmale müssen Sie aufweisen, um als Klonierungsvektoren zu dienen? 4

6 38) Definieren Sie die Begriffe Euchromatin und Heterochromatin. 39) In Eukaryoten ist die DNA mit Proteinen zum Chromatin verpackt. Welche der folgenden Aussagen sind falsch und warum? a) Das Chromatin dient zum Schutz vor DNasen. b) Das Chromatin ermöglicht eine kompakte Organisation der DNA im Zellkern. c) Das Chromatin ermöglicht eine Grobkontrolle der Genexpression. d) Im Chromatin ist die DNA einmal um ein Histonoktamer gewunden. e) Das Heterochromatin enthält die aktiven rrna Gene. 40) Nennen Sie drei Elemente, die für die stabile Weitergabe von Chromosomen bei der Zellteilung notwendig sind. 41) Was ist die Funktion des Centromers? 42) Was ist die Funktion des Telomers? 43) Welche besondere Struktur zeichnet ein Telomer aus? 44) Welche Funktion hat die Telomerase? 45) Die Telomerase ist eine a) DNA-abhängige DNA-Polymerase b) RNA-abhängige DNA-Polymerase c) DNA-abhängige RNA-Polymerase d) RNA-abhängige RNA-Polymerase e) DNA-unabhängige RNA-Polymerase f) reverse Transkriptase g) inverse Transkriptase 46) Definieren Sie die folgenden Begriffe: Nucleoid, Nucleotid, Nucleosid, Nucleosom, Nucleolus, Nucleus, Nuclease. Welche dieser Verbindungen oder Strukturen sind in einer eukaryotischen Zelle zu finden? Welche dieser Verbindungen oder Strukturen enthält DNA, welche RNA? 47) Wie unterscheiden sich pro- und eukaryotische Genome? Nennen Sie mindestens 4 Merkmale. 48) Welche der folgenden Bestandteile der Zelle haben ein eigenes Genom? a) Ribosomen b) Mitochondrien c) Golgi-Apparat d) Centriolen e) Chloroplasten f) Tonoplast g) Endoplasmatisches Reticulum 49) Welche der folgenden Aussagen sind falsch und warum: a) Chloroplasten haben eine eigene Transkritpions- und Translationsmaschinerie. b) Die Erbinformation der Chloroplasten enthält alle Gene, um die vollständige Struktur dieses Organells aufzubauen. c) Die Gene der Chloroplasten werden unabhängig von denen des Zellkerns vererbt. d) Das Genom der Chloroplasten ist im Lauf der Evolution aus dem Genom des Zellkerns ausgelagert worden. 5

7 50) Zur Klärung der Verwandtschaftsverhältnisse von Homo sapiens sapiens und Homo sapiens neanderthalensis wurden mitochondriale DNA-Sequenzen isoliert und bestimmt. Weswegen eignen sich diese wesentlich besser zur Gewinnung von DNA- Sequenzinformation aus fossilen Proben als Sequenzen des nucleären Genoms? 51) Skizzieren Sie den Aufbau eines Retrovirus. Woraus besteht das Genom des Virus und wofür kodiert es? 52) Wie erfolgt die Replikation eines Retrovirus? 53) Was ist eine Reverse Transkriptase? 54) Was ist ein Retrotransposon? 55) Welche Ereignisse charakterisieren die einzelnen Phasen einer Mitose? 56) Wie ändert sich der DNA-Gehalt einer Zelle während des Zellzyklus? Wie die Chromosomenzahl? 57) Welche Ereignisse charakterisieren die einzelnen Phasen einer Meiose. 58) Wodurch unterscheidet sich die erste meiotische Teilung von einer mitotischen Zellteilung? 59) Erläutern Sie die Begriffe Synapsis, synaptonemaler Komplex, Cross-over und Chiasma. 60) Wie unterscheiden sich die Produkte von Mitose und Meiose? Nennen Sie mindestens drei Unterschiede. 61) Wodurch kommt es bei der Meiose zur Neuordnung des genetischen Materials? 61) Wie verändern sich DNA-Gehalt und Chromsomenzahl während der Meiose? 62) Fehler bei der Verteilung von Chromosomen in der Meiose haben schwere Erbkrankheiten zur Folge. Ein Beispiel dafür sind Turner's Syndrom (Geschlechtschromosomen XO) und Klinefelter's Syndrom, (Geschlechtschromosomen XXY). Wie nennt man die Störung der Meiose, die für eine Fehlverteilung der Chromosomen verantwortlich ist? Wieviel Chromosomen enthalten diese Chromosomensätze? Welches Geschlecht haben Individuen mit diesen Chromosomensätzen? 63) Für die Gene A, B, C wurden folgende Rekombinationsfrequenzen ermittelt: A/B: 2%, A/C: 5%, B/C: 7%, Stellen Sie mit Hilfe dieser Angaben eine Genkarte auf und begründen Sie Ihr Ergebnis. 64) Weibliche Calico-Katzen zeigen oft dreifarbig geflecktes Fell. Die schwarzen und orangene Fellfarbe wird durch ein X-chromosomales Gen bestimmt, für das zwei Allele bekannt sind, die für unterschiedliche Farben verantwortlich sind. Erläutern Sie warum ein dreifarbig geflecktes Fell nur bei weiblichen Katzen auftritt. 65) Definieren Sie die Begriffe Allel, homozygot und heterozygot. 66) Formulieren Sie die Mendelschen Gesetze. 67) Was besagt die Uniformitätsregel? 6

8 68) Was besagt die Spaltungsregel? 69) Was bedeutet der Begriff Reziprozität? Gilt dieses Prinzip für alle Erbgänge? 70) Wie spalten sich bei einem monohybriden dominant-rezessiven Erbgang die Phenotypen in der F2 auf? Wie würden sie sich bei einem dihybriden Erbgang aufspalten? 71) Erläutern Sie mit Hilfe eines Punnetschen Quadrats die in der F1 auftretenden Phenotypen bei der folgenden Kreuzung: WWvv x WwVv Die Allele W und V sind dominant über die Allele w und v. 72) Das Gen gbr bestimmt die Federfarbe einer seltenen Papageienart. Expression des dominanten Allels Gbr führt zu grünen Federn, des rezessiven Allels gbr zu blauen Federn. Bei der Kreuzung eines Männchens mit grünen Federn und eines Weibchens mit blauen Federn zeigten die Nachkommen güne und blaue Federn im Verhältnis 1:1. Was können Sie daraus über den Genotyp des Männchens schliessen? 73) Definieren Sie die Begriffe Mutation, Wildtyp und Polymorphismus. 74) Eine Mutation in einer codierenden Sequenz hat die Insertion von 3 Basenpaaren zur Folge. Welche Konsequenzen hat dies? 75) Können Mutationen ausserhalb der codierenden Sequenz Folgen für die Expression eines Gens haben? Begründung? 76) Welche Folgen haben die folgenden Mutationen (Bearbeitung mit Hilfe einer Codontabelle): a) CGA -> GGA b) CGA -> TGA c) CCA -> CCG d) CCC -> CGCC 77) Was unterscheidet die Transkription in Pro- und Eukaryoten? 78) Welches Enzym synthetisiert die mrna in Eukaryoten? 79) Was ist eine TATA-Box? 80) Was ist die Funktion eines Promotors, was die eines Enhancers? 81) Welche Funktionen haben allgemeine Transkriptionsfaktoren? 82) Was ist TFIID? 83) Eukaryotische Gene, die von der RNA Polymerase II transkribiert werden, können folgende Sequenzelemente enthalten: Enhancer, "Hormone-responsive Element" und Promotor. Was ist die Funktion dieser Sequenzen für die Kontrolle der Genexpression? 84) Eukaryotische Transkriptionsfaktoren sind modular aufgebaut. Welche Funktion können Protein-Domänen dabei übernehmen? Skizzieren Sie die Struktur eines eukaryotischen Transkriptionsfaktors. 85) Wie wird die Transkription eines eukaryotischen Gens durch camp reguliert? 86) Was bewirken Histon-Acetyltransferasen? Nennen Sie eine Beispiel für ein Protein mit Histon-Acetyltransferase Aktivität. 7

9 87) Wie stellt man sich die Wirkung von Enhancern vor? 88) Wodurch unterscheiden sich Pro- und Eukaryoten in der Regulation der Transkription? 89) Wie wird das 3'-Ende eines Transkriptes der Polymerase II erzeugt? 90) Was ist eine Polyadenylierung? 91) Definieren Sie die Begriffe Intron und Exon. 92) Warum ist kein Energieaufwand beim Spleissen von Transkripten notwendig? 93) Was ist ein Lariat? 94) Welche Schritte folgen in Eukaryoten auf die Transkription zur Erzeugung einer reifen mrna? 95) Wodurch unterscheiden sich die mrnas von Eubakterien und Eukaryoten? 96) Wodurch unterscheidet sich die Translation in Eubakterien und Eukaryoten? 97) Was ist ein Signalpeptid? 98) Wie wird ein Membranprotein bei der Translation in die Membran inseriert? 99) Welche Faktoren sind während der Translation für die Insertion eines Membranproteins in die Membran notwendig? 100) Ist das Signalpeptid Bestandteil des reifen Proteins? Was ist seine Funktion? 101) Auf welchem Prinzip beruht die PCR? 102) Aufgrund welchen Prinzips kann man in einem Southern-Blot ein spezifisches Gen nachweisen? 8

10 Einführung 1 Das Dogma der Molekularbiologie Replikation DNA Transkription RNA Translation Protein 2

11 Phosphat Gruppe Nucleotide O O=P-O O Zucker (Deoxyribose) 5 CH2 C 4 O C 3 C 2 C 1 N Base (A, G, C, T) 3 RNA DNA Purine Pyrimidine Purine Pyrimidine Adenin Uracil Adenin Thymin Guanin Cytosin Guanin Cytosin 4

12 Röntgenstrukturanalyse Strahlungsquelle Kristall 5 Basenpaarungen komplementärer Basen H-Brücken G C A G T C T A DNA: Polymer aus vier Bausteinen (A, G, C, T) Doppelhelix mit komplementären und antiparallelen Strängen 6

13 Was ist ein Gen? Die Definition änderte sich mit der Entwicklung der Genetik: 1) Ein Gen = Ein Merkmal (ein vererbbares Kennzeichen eines Organismus) 2) Ein Gen = Ein Protein (ein DNA-Abschnitt, der die Information für die Synthese eines Proteins trägt ) 3) Ein Gen = Eine Transkriptionseinheit (ein DNA-Abschnitt, der als ganzes transkribiert wird und die Information für ein Protein oder eine RNA enthält ) 7 Drei Reiche des Lebens Eubakterien Eukaryonten Archaea Chloroplasten Mitochondrien Endosymbiontentheorie 8

14 Organisation und Replikation des bakteriellen Genoms Wie wird DNA repliziert? Welche Enzyme sind notwendig? Wie arbeiten sie zusammen? 9 Replikation 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' Komplementarität der DNA-Stränge ermöglicht Replikation der Erbinformation 10

15 -DNA-Polymerasen benötigen zur Synthese: 3'-OH Ende Template 5' 3' OH C dgtp PP 5' G-3' OH C 11 Replikation in E. coli 1) Initiation 2) Elongation 3) Termination 12

16 Das Genom der Prokaryoten ist zirkulär oric bp E. coli terc Das Genom hat einen Origin of Replication 13 1) Initiation DNA Replikation ist bidirektionell 5' 3' 5' Replikationsgabel 5' 3' Replikationsblase 5' Initiation der Replikation: Replikationsursprung (Origin of replication) 14

17 2) Elongation RNA-Polymerase (Primase) synthetisiert einen RNA-Primer -> 3'OH-Ende 5' 3' OH nt 5' 15 DNA Replikation ist diskontinuierlich lagging strand (Folgstrang) Okazaki-Fragmente Bewegung der Replikationsgabel leading strand (Leitstrang) 16

18 DNA Replikation ist diskontinuierlich leading strand: kontinuierliche Synthese ine Initiation durch Primase lagging strand: Synthese in Fragmenten (Okazaki Fragmente) wiederholte Initiation durch Primase 17 DNA Polymerasen in Prokaryoten (E. coli) DNA-Polymerase I DNA-Polymerase III DNA-Reparatur, DNA-Replikation eine Untereinheit mit 5'->3' Exonuklease und 3'->5' Exonuklease DNA-Replikation, Core-Enzym aus 3 Untereinheiten 3'->5' Exonuklease 18

19 Synthese des "lagging strand" 1) Synthese des RNA-Primers durch eine RNA-Polymerase (Primase) 2) Verlängerung des RNA-Primers durch DNA-Polymerase III 3) Entfernen des RNA-Primers und Auffüllen der Lücke durch DNA- Polymerase I 4) Verknüpfung der Fragmente durch DNA-Ligase 19 Replikationskomplex Helicase lagging strand (Folgstrang) SSB ATP SSB Helicase leading strand (Leitstrang) ADP DNA-Polymerase 20

20 DNA-Polymerase III besteht aus mehreren Untereinheiten!-Untereinheit: Katalytischer Core "-Untereinheit: Dimerisation #-Untereinheit: Prozessivität, ("Clamp") $-Komplex (5 Proteine): Assemblierung #-Ring auf DNA ("Clamp-loader") 21 DNA-Polymerase Holoenzym #! " # $ "! 2!-Untereinheiten: katalytischer Core 2 "-Untereinheiten: Dimerisation 2 #-Untereinheiten: Clamp 1 $-Komplex: "Clamp-loader" 22

21 Topoisomerasen Gyrase ATP ATP Topoisomerase I 23 DNA-Replikation ist: 1) Semikonservativ 2) Bidirektional 3) Diskontinuierlich 24

22 Transkription I: Prokaryonten Wie wird DNA transkribiert? Welche Kontrollelemente sind notwendig? Welche Enzyme sind notwendig? Wie wird das ganze reguliert? Was ist ein Operon? 25 5' 3' codierender Strang codogener Strang 3' 5' DNA 5' 3' Template Strang 3' 5' 5' 3' mrna 26

23 RNA-Polymerase: DNA-abhängige RNA-Polymerase RNA-Polymerasen kopieren den codierenden Strang Initiation codierende Region Termination Promotor RNA-Polymerase 5' 3' Transkript = mrna Promotor: Sequenzen, die es der Polymerase erlauben den Anfang des Gens zu erkennen Terminator: Sequenzen, die es der Polymerase erlauben das Ende des Gens zu erkennen 27 Initiation CAC DNA +1 AC mrna ATG Promotor AUG codierende Region Transkript mrna DNA 28

24 -35 Region -10 Region Initiation TCTTGACA TATAAT------CAT ATG Promotor kodierende Region 29 Der Sigma-Faktor erlaubt die Erkennung der Promotor-Region RNA-Polymerase - Untereinheiten:! # #' Core-Enzym!, #, #' % % % Holoenzym 30

25 Initiation der Transkription 12 bp ' 3' % 3' 5' Template Strang -55 offener Promotor-Komplex Elongation 5' 3' % Template Strang 3' 5' % Transkript 5' 3' Template Strang 3' 5' 32

26 Termination Zwei Mechanismen der Termination in E. coli 1) Rho-unabhängige Termination: "Stem-Loop"-Struktur der mrna, bei der Mehrzahl der E. coli Gene zu finden 2) Rho-abhängigen Termination: Bindung des Rho-Protein an die mrna führt zur Termination 33 Prokarotische Gene - Alle Gene durch die gleiche RNA-Polymerase transkribiert - %-Faktor : Erkennung von Promotoren - Termination: RNA-Pol. terminiert an einer definierten Position 34

27 polycistronische mrna in Prokaryoten Initiation kodierende Region Termination Promotor Transkript -10-Region: Pribnow-Box oder TATA-Box -35-Region 35 36

28 Genregulation I: Prokaryonten Wie wird Transkription reguliert? Was ist ein Operon? 37 Enzyme des Lactose-Stoffwechsels #-Galactosidase Lactose-Permease Transacetylase lacz lacy laca in Lactose-freiem Medium nicht exprimiert Lactose als einzige C-Quelle: Induktion der Enzyme von einem Promotor transkribiert: P lac P lac lacz lacy laca 38

29 Das Lac-Operon P i laci P lac O lac lacz lacy laca P i P i : Promotor des Lac-Repressor O lac laci Gen für Lac-Repressor O lac : Operator Regulatorgen P lac lacz lacy laca P lac : Promotor des lac-operons Strukturgene 39 P i laci P lac O lac lacilaci lacilaci lacz lacy laca laci laci laci laci lacilaci lacilaci 40

30 P i laci P lac O lac lacz lacy laca laci LacZ LacY LacA laci laci laci lacilaci lacilaci Induktor 41 Das Lac-Operon P i laci P lac O lac lacz lacy laca P i : Promotor des Lac-Repressor Lac-Repressor O lac : Operator P lac : Promotor des lac-operons Regulationseinheit in Bakterien, die aus Promotor, Operator und Strukturgenen besteht, die gemeinsam reguliert werden. Folge von Strukturgenen als polygenische (= polycistronische) mrna trankribiert 42

31 Das Lac-Operon Jacob-Monod-Modell In Abwesenheit des Induktors (Lactose) bindet der Lac-Repressor an den Operator und reprimiert das Lac-Operon Die RNA-Polymerase wird daran gehindert die Strukturgene zu transkribieren Der Induktor bindet an den Lac-Repressor -> Konformationsänderung Der Repressor ist nicht mehr in der Lage den Operator zu binden -> RNA-Polymerase kann die Transkription initiieren 43 Lac-Repressor Dimere bilden eine funktionelle Einheit zwei Dimere -> Tetramer modularer Aufbau DNA-Bindungsdomäne flexibler Linker Induktor-Bindung Tetramerisierung 44

32 P i laci O lac P lac O lac lacz lacy laca ca. 90 bp +1 ca. 400 bp P i laci O lac P lac O lac lacz Zwei intakte Operatoren für vollständige Repression notwendig 45 tetramerer Lac-Repressor kann zwei Operator-Sequenzen gleichzeitig binden, für vollständige Repression notwendig -> DNA-Schleife Olac lacilaci lacilaci P lac O lac laci Pi lacz 46

33 Katabolit-Repression des lac-operons durch Glucose Katabolit-Repression: Glucose-Repression der Lactose Verwertung. In Anwesenheit von Glucose wird das lac-operon nicht transkribiert Signal: camp (Adenosin-3'-5'-Monophosphat) 47 Katabolit-Repression des lac-operons durch Glucose camp bindet an CAP (catabolite activator protein) = CRP (camp receptor protein) camp-bindung -> Konformationsänderung CAP camp erkennt DNA-Sequenz 5' des lac Operators P i laci O lac CAP P lac O lac lacz CAP camp fördert die Bindung der RNA Polymerase an den Promotor des lac Operons 48

34 Katabolit-Repression des lac-operons durch Glucose Glucose ATP Adenylat-Cyclase camp PP Glucose: inaktive Cyclase geringe camp-konzentration - : aktive Cyclase hohe camp-konzentration 49 RNA-Polymerase laci O lac CAP P lac lacz O lac 50

35 P i laci CAP P lac O lac lacz lacy laca CAP Glucose Lactose 51 Glucose Glucose + Lactose Lactose [camp] [camp] [camp] CAP inaktiv CAP inaktiv CAP aktiv Repressor aktiv Repressor inaktiv Repressor inaktiv lac Operon nur aktiviert wenn Glucose fehlt UND Lactose vorhanden ist 52

36 Operons ermöglichen koordinierte Regulation von Genen positive Kontrolle: Aktivierung des Promotors durch CAP camp negative Kontrolle: Repression des Promotors durch lac-repressor 53 DNA-Bindungsdomäne : Helix-Turn-Helix-Motiv ein Monomer bindet jeweils eine Hälfte der Bindungsstelle Bindung des Induktors -> Konformationsänderung -> Bindung an die Erkennungssequenz verhindert 54

37 P i trpr P trp O trp trpe trpd trpc P i P i : Promotor des Trp-Repressor O trp trpr Gen für Trp-Repressor trp : Operator Regulatorgen P trp trpe trpd trpc trpb trpa P trp : Promotor des trp-operons Strukturgene 55 P i trpr P trp O trp trpe trpd trpc TrpE TrpD TrpC 56

38 P i trpr P trp O trp trpe trpd trpc TrpE TrpD TrpC Tryptophan (Korepressor) 57 P i trpr P trp O trp trpe trpd trpc 58

39 P i trpr P trp O trp trpe trpd trpc Trp 59 Lac-Operon Trp-Operon Lac Repressor Induktor: Allolactose Induktion Induktor verhindert Bindung an Operator Trp Repressor Korepressor: Tryptophan Repression Korepressor induziert Bindung an Operator 60

40 Translation in Prokaryoten Wie wird genetische Information übersetzt? Welche Kontrollelemente sind notwendig? Welche Enzyme sind beteiligt? 61 5' ccatgaccgagcggcccgagatgcaggccatcaagtgatt ggtactggctcgccgggctctacgtccggtagttcactaa M T E R P E M Q A I K * V - 3' ORF DNA- und Proteinsequenz sind kolinear Ein Triplett (Codon) -> eine Aminosäure Start und Stop Codon legen Anfang und Ende der kodierenden Region fest Open Reading Frame (ORF) (offenes Leseraster) 62

41 5'-AUG UGG UAG -3' 3'-UAC UCC AUC -5' 5'-AUG UGG UAG -3' M T * 3'-UAC UCC AUC -5' H P L 63 3 Leseraster 5' tgccattgctgcaggtcgacggatccggggaattcccggggatcccgtcg acggtaacgacgtccagctgcctaggccccttaagggcccctagggcagc 5' 3 Leseraster 64

42 RNA übernimmt drei verschiedene Rollen bei der Proteinbiosynthese (Translation) 1) mrna: Anweisung für die Art und Reihenfolge der Aminosäuren 2) trna: entziffert mrna und trägt die Aminosäuren 3) rrna: bildet zusammen mit Proteinen die Ribosomen, die Proteinsynthesemaschine 65 Anticodon 3' 5' C G G mrna 5' G C C 3' Codon 66

43 Aminoacyl-tRNA-Synthetase Vernüpfung von Aminosäure und trna, mindestens 20 verschiedene Enzyme eines für jede Aminosäure trna Aminosäure ATP Aminoacyl-tRNA 67 Prokaryotische Ribosomen 50S-Untereinheit: 23 S, 5 S rrna 50 S 30S-Untereinheit: 16 S rrna 60% RNA 40 % Protein 30 S 70 S 68

44 Translation: Initiation, Elongation und Termination Shine-Dalgarno-Sequenz Initiation Sequenz im 5'-nichtcodierenden Bereich der mrna Ribosomen-Bindungsstelle ATTCCTCCACUAG AGGAGGU 16 S rrna 3' 5' AUG 3' mrna 69 Die drei Phasen der Translation werden durch Initiationsfaktoren Elongationsfaktoren und Terminationsfaktoren gesteuert Initiationsfaktoren verhindern die vorzeitige Bindung der 50 S Untereinheit Elongationsfaktoren sorgen für den geordneten Ablauf der Elongation 70

45 Synthese: N-Terminus -> C-Terminus 5' 3' N NH 2 - C -COOH 1. Aminosäure = 1. Codon 71 Rekombinante DNA I Wie können wir genetische Information manipulieren? Welche Werkzeuge haben wir dafür? 72

46 Expression von rekombinantem Insulin in Bakterien Protein DNA Sequenz Expression in Bakterien 73 Expression von rekombinantem Insulin in Bakterien Protein DNA Sequenz Expression in Bakterien ATG TAG Insulin 74

47 Eco RI ist eine Endonuclease, die eine palindromische Sequenz erkennt 5' ----GAATTC---- 3' ----CTTAAG G -OH P- ----CTTAA AATTC---- G---- "klebrige (sticky) Enden" 75 m 5' ----GAATTC---- 3' ----CTTAAG---- m Methylierung der Erkennungssequenz GAATTC durch die EcoRI-Methylase blockiert die Hydrolyse durch Eco RI 76

48 "Chromosom" F-Plasmid ("extrachromosomales" autonomes genetisches Element) ca. 100 kb 77 Klonierungsvektoren Plasmide: episomale (= extrachromosomale Elemente) autonom replizierende zirkuläre DNA-Moleküle F-Plasmid: enthält Gene für Übertragung von DNA-Molekülen zwischen Bakterien R-Plasmid: enthält zusätzlich Gen für Antibiotika-Resistenz Klonierungsvektor: Origin of replication Selektierbarer Marker (Antibiotika-Resistenz) Region zur Insertion fremder DNA 78

49 Transposon: ein mobiles genetisches Element, das an beliebigen Stellen eines Genoms inserieren kann Transposon 79 replikative Transposition das Transposon wird kopiert, die Zahl der Transposons nimmt zu nicht-replikative Transposition das Transposon wird als Einheit bewegt, die Zahl der Transposons bleibt konstant 80

50 Bakterielle Transposons Insertionssequenzen (IS-Elemente) (1-2 kb) Transpoase kodierende Region 5 bis 10 bp direct repeat 9-50 bp inverted repeat IS 5 nicht-replikative Transposition 81 Bakterielle Transposons Beispiel: Tn9 (zusammengesetztes Transposon) Transposon IS IS Antibiotika- Resistenzgen duplizierte 5 bp 82

51 Klonierungsvektor EcoRI pbr bp Ori amp R 83 EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI Restriktionsverdau Ligation EcoRI 84

52 Verdau eines Genoms mit EcoRI Restriktionsfragmente EcoRI Transformation 85 Restriktionskarten EcoRI HindIII HindIII EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI HindIII HindIII 86

53 EcoRI HindIII HindIII EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI HindIII HindIII + 1: Grössen- Standard 2: unverdaut 3: EcoRI 4: HindIII 87 Expressionsvektor MCS pet-3 Ori p T bp amp R p T7 : Promotor, T7 Phage MCS: Multiple cloning site 88

54 Verdau eines Genoms mit EcoRI Restriktionsfragmente EcoRI Transformation 89 Bakteriophagen virulente Phagen: Infektion hat immer Zellyse zur Folge temperente Phagen: neben lytischer Vermehrung Lysogenisierung als alternativer Vermehrungsweg 90

55 Der lytische Replikationszyclus des E. coli Bacteriophagen T4 Lyse der Zelle Infektion Replikation 91 & Phage E. coli Genom integrierter & Phage (Prophage) 92

56 Der Bacteriophage & hat zwei Möglichkeiten Infektion Replikation Integration ins Wirtsgenom lytischer Zyklus lysogener Zyklus Lyse Replikation zusammen mit Bakterien-Genom 93 Verdau EcoRI Restriktionsfragment rekombinante &-Phagen Infektion 94

57 5'... CCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGGGGGAAC TGTGGACCACCTTCGAGAGATGGATCACA 95 5' 96

58 Organisation des Genoms und Struktur der Chromosomen Wie ist das Genom von Eukaryoten organisiert? Was unterscheidet es von Bakterien? Wie sind Chromosomen aufgebaut Wie wird die Erbinformation bei der Zellteilung weitergegeben? Der Zellkern Heterochromatin: inaktives Chromatin Euchromatin: aktives Chromatin Kernmembran Chromatin Heterochromatin Euchromatin Nucleolus: Ribosomen Kernporenkomplex

59 Eukaryotische DNA ist in Chromosomen verpackt 1) Genom in Chromosomen unterteilt 2) Zellteilung: DNA wird kondensiert Das Genom der Eukaryoten ist linear 1 Chromosom: eine DNA-Doppelhelix Telomer Centromer Telomer

60 Mitose Tochterzellen Interphase Zellzyklus DNA-Synthese Replikation 1 Chromosom Mitose 2 Chromatide

61 Metaphasen Chromosom Centromer DNA-Sequenz, bindet Kinetochor dadurch Verknüpfung mit Spindelapparat Kinetochor Spezialisierter Proteinkomplex Spindelapparat Mikrotubuli, mit Kinetochor verknüpft Chromatid Cohesin Verbindung der Schwesterchromatiden Chromosomensatz: 2n (diploide Zelle) Jedes autosomale Gen kommt in 2 Kopien vor Mensch: 23 Chromosomenpaare, 2n = 46 Chromosomen 1-22: Autosomen, X, Y: Geschlechtschromosomen

62 Für die stabile Vererbung von Chromosomen sind 3 Elemente notwendig: - "Origins of Replication" Initiation der Replikation - Centromer: Verteilung bei der Zellteilung - Telomere: Schutz der Enden Chromatin Nucleosom: DNA + Histon-Oktamer

63 Histon-Oktamer: je zwei Kopien von Histon H2A Histon H2B Histon H3 Histon H4 zusammen mit 146 bp DNA R K RK K RK KK K KR R H3 Acetylierung Phosphorylierung Methylierung Lysin - (CH2) 4 -NH (CH2) 4 -NH-COCH 3 flexibler N-Terminus Globuläre Domäne R: Arginin K: Lysin S: Serin

64 R K RK K RK KK K KR R H3 Acetylierung Phosphorylierung Methylierung Lysin - (CH2) 4 -NH (CH2) 4 -NH-CH 3 flexibler N-Terminus Globuläre Domäne R: Arginin K: Lysin S. Serin Organisation des Chromatins Interphase Verpackung in Nucleosomen ("Beads on a string") Mitose Verpackung in Nucleosomen ("Beads on a string") 30 nm Faser 30 nm Faser Chromatin-Schleifen Chromatin-Schleifen Euchromatin Heterochromatin (Centromere, Telomere) Chromosomen

65 DNA Replikation in Eukaryoten erfolgt in Abschnitten: Replikons Replikation in Eukaryoten: Chromatin Organisation der DNA zu Chromosomen Eukaryotische Genome: in mehrere Chromosomen unterteilt Chromosom: eine lineare DNA mit mehreren Origins of replication (Replikons) Chromosomen: DNA durch Histone und andere Proteine zum Chromatin verpackt Centromere und Telomere: Stabilität und Vererbung von Chromosomen

66 Telomere schützen die Chromosomen vor: Rekombination Fusion mit anderen Chromosomen Erkennung als beschädigte DNA Telomere enden mit einer t-loop Struktur 5' 3' 3' 5' D-Loop 5' t-loop D: displacement t: telomere

67 5' 3' 3' 5' Tetrahymena: nt ----TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG (TTGGGG)n Telomerase Polymerase mit zwei Untereinheiten: Protein (TERT: Telomerase Reverse Transkriptase) RNA (TER: Telomerase RNA)

68 5' 3' 3' 5' 3' 5' RNA AACCCCAAC ----TTGGGGTTGGGGTTG Tetrahymena 5' 3' 3' 5' 3' 5' AACCCCAAC GGTTGGGGTTGGGGTTG Tetrahymena

69 Telomerase RNA: Template zur Synthese des 3'-Überhangs der Telomere AACCCCAAC GGTTGGGGTTG AACCCCAAC GGTTGGGGTTGGGGTTG TERT: RNA-abhängige DNA-Polmerase Die Grösse der Genome verschiedener Organismen E. coli 4,5 Mb (4,5 x 10 6 ) S. cerevisiae 12,1 Mb D. melanogaster 165 Mb C. elegans 97 Mb Amphibien Mb H. sapiens 3300 Mb Pflanzen Mb

70 Organisation des Genoms Sequenzklassen im Genom der Eukaryoten - "single copy" Sequenzen - repetitive Sequenzen Single copy Sequenzen 1) Protein-kodierende Gene 2) Gene für rrna, trna, andere "kleine" RNAs 3) nicht-kodierende RNAs (ncrnas) 4) nicht transkribierte Sequenzen

71 Genstruktur: Eukaryonten Exon Intron Exon Transkription AUG STOP Primärtranskript: pre-mrna Spleissen mrna Genstruktur: Eukaryonten Exon Intron Exon Intron = Abschnitt des Primärtranskriptes, das durch Spleissen entfernt wird und nicht Bestandteil der reifen mrna ist Exon = Abschnitt des Primärtranskriptes, das Bestandteil der reifen mrna ist

72 Repetitive Sequenzen - wiederholte Sequenzelemente: ähnlich aber nicht identisch - hochrepetitive Sequenzen (auch Satelliten-DNA genannt) Hunderte von Repeats an einigen Stellen des Genom konzentriert wie Centromere (GAAAAA AG TC T) Repetitive Sequenzen - mittelrepetitive Sequenzen z.b. Telomere z.b. Gene für trna z.b. Transposons Transposon: mobiles genetisches Element Insertion an beliebigen Stellen des Genoms

73 Transposon: mobiles genetisches Element Insertion an beliebigen Stellen des Genoms Chr 1 Transposon Chr 5 Chr 1 Chr 5 Transposon: mobiles genetisches Element Insertion an beliebigen Stellen des Genoms nicht-replikative Transposition Transposon als Einheit bewegt, Zahl Transposons konstant

74 Transposon: Beispiel: P-Element, Drosphila Transpoase: Rekombinase, vermittelt Transposition Beispiel: Sleeping Beauty, künstliches Transposon Transposon: mobiles genetisches Element Insertion an beliebigen Stellen des Genoms Chr 1 Chr 5 replikative Transposition Transposon kopiert, Zahl Transposons steigt

75 Retrotransposon Transposons, die sich durch Reverse Trankription verbreiten Chr 1 Transkript DNA Chr 5 Integration in Genom Aufbau eines Retrovirus Glykoproteine RNA-Genom Lipidhülle Virus-Kern LTR gag pol env LTR

76 Aufbau eines Retrovirus gag (gruppenspezifisches Antigen): Bestandteile des Viruskerns pol (polymerase): Reverse Transkriptase, Integrase env (envelope): Glykoproteine der Membranhülle Retroviren: RNA-Viren RNA Genom in DNA umgeschrieben RNA Genom Reverse Transkription Integration integrierter Pro-Virus Transkription durch RNA-Polymerase der Zelle neue virale Genome mrna zur Produktion viraler Proteine

77 Retroviren: RNA-Viren in doppelsträngige DNA umgeschrieben (Reverse Transkriptase) integrieren in das Wirtsgenom Einige repetitive Sequenzen entstehen durch reverse Transkription Das Dogma der Molekularbiologie DNA RNA Protein

78 Das Genom enthält nicht nur kodierende Sequenzen Nur 5-10% des Genoms der Eukaryoten sind kodierende Sequenzen!! Rest: Single Copy Sequenzen (z.b. Introns, Kontrollelemente) Repetitive Sequenzen Wieviel Gene gibt es? Organismus H. pylori E. coli S. cerevisiae C. elegans D. melanogaster H. sapiens Reis Vorhergesagt Zahl der proteinkodierenden Gene ca ca

79 Immunoglobuline: V-D-J Rekombination V (ca. 100) D (ca. 30) J (6) C variable Region konstante Region Antigen schwere Kette leichte Kette Immunoglobulin: 2x schwere Kette + 2x leichte Kette Purves: Kap. 18 (S. 456) Campbell: Kap. 43 Immunoglobuline: V-D-J Rekombination vor V-D-J Rekombination V (ca. 100) D (ca. 30) J (6) C nach V-D-J Rekombination VDJ Purves: Kap. 18 (S. 456) Campbell: Kap. 43

80 V (ca. 100) D (ca. 30) J (6) C vor V-D-J Rekombination nach V-D-J Rekombination Hypermutation Transkript Protein Purves: Kap. 18 (S. 456) Campbell: Kap. 43 Extrachromosomale Gene mtdna ctdna

81 Mitochondrien und Chloroplasten: mehrere Kopien ihres Genoms Mitochondrien: 2-10 Kopien (10 kb - 2 Mb) Chloroplasten: Kopien ( kb) darunter Gene für: trnas, rrna, Proteine -> eigene Translation Das Genom kodiert nur für kleinen Teil der Proteine der Organellen Zellzyklus, Mitose, Meiose Wie sind eukaryontische Gene aufgebaut? Wie werden die Chromosomen auf die Tochterzellen verteilt? Was ist der Unterschied von Mitose und Meiose?

82 M Mitose G 2 Tochterzellen Interphase Zellzyklus G 1 S DNA-Synthese Prophase Chromatin kondensiert zu Chromosomen Bildung Mitosespindel Prometaphase Kernhülle zerfällt Spindelfasern binden Kinetochor Metaphase Chromosomen in Metaphasenplatte Anaphase Trennenung der Schwesterchromatiden -> entgegengesetzte Pole Telophase Neubildung des Zellkerns Dekondensierung der Chromatiden

83 Cohesin Komplex Interphase Prophase Metaphase Cohesin Komplex Separase Metaphase Anaphase

84 Mitose Prophase Prometaphase Metaphase Anaphase Telophase Cytokinese Chromatin kondensiert zu Chromosomen Bildung Mitosespindel Kernhülle zerfällt Spindelfasern binden Kinetochor Chromosomen in Metaphasenplatte Trennenung der Schwesterchromatiden -> entgegengesetzte Pole Neubildung des Zellkerns Dekondensierung der Chromatiden Zellteilung Kontraktiler Ring (aus Aktin und Myosin) trennt die Zellen Synthese der neuen Zellwand (durch Phragmoplast) trennt die Zellen

85 Interphase G1 S G2 M G1 DNA-Gehalt pro Zelle 4x 2x n=2 x = 2 n=2 x = 4 n=2 n=2 n=2 x = 2 1x x = DNA-Gehalt n = Chromosomensatz (diploid, n=2) Zeit Kontrolle des Zellzyklus Zellteilung nicht vor Verdopplung der Zellmasse nicht vor Ende der Replikation (Replikation einmal und nur einmal )

86 zentraler Regulator koordiniert alle Prozesse des Zellzyklus: 1. Cyclin-abhängige Proteinkinasen (Cdk) Cdk Kontrolle des Zellzyklus 2. Cycline Cyclin Kontrolle des Zellzyklus zentraler Regulator koordiniert alle Prozesse des Zellzyklus: Cyclin Cdk Cdk Cyclin Cdk inaktiv Cdk/Cyclin Komplex aktiv

87 Kontrolle des Zellzyklus Synthese von neuem Cyclin Interphase Cyclin Abbau von Cyclinen Cdk Cdk Cdk Cyclin Cyclin Mitose Konzentration M G 1 S G 2 M G 1 S G 2 M Zeit Menge Cyclin Cyclin Aktivität Cdk/Cyclin Cdk Cyclin

88 Kontrollpunkt für DNA-Integrität M Mitose Interphase G 2 Kontrollpunkt für nicht-replizierte DNA S Zellzyklus DNA-Synthese Tochterzellen G 1 G 0 Wachstumsfaktoren (Mitogene) Kontrollpunkt für DNA-Integrität Kontrolle des Zellzyklus Kontrolle an spezifischen Punkten des Zellzyklus G1: Restriktionspunkt Entscheidung zur Replikation entscheidender Kontrollpunkt in tierischen Zellen G2: Entscheidung zur Zellteilung

89 Meiose und sexuelle Fortpflanzung haploide Zellen n = 23 Gameten Meiosis Keimbahn Befruchtung Ovar n = 46 Testis diploide Zellen Mitose Zygote

90 Interphase Meiose 1 Meiose 2 G1 S G2 DNA-Gehalt pro Zelle 4x 2x n = 2 n = 2 n = 1 n=2 n=1 1x n = 1 x = DNA-Gehalt n = Chromosomensatz (diploid, n=2) Zufällige Segregation homologer Chromosomen Gameten Kombinationen

91 Zufällige Segregation homologer Chromosomen n mögliche Chromosomenkombinationen n = haploide Chromosomenzahl Mensch: 2 23 = > 8,4 x 10 6 mögliche Kombinationen Interphase Prophase I

92 Metaphase I Anaphase I

93 Anaphase II Rekombination in der Meiose

94 Rekombination 1) homologe Rekombination: Austausch von DNA-Abschnitten zwischen gleichen oder ähnlichen Sequenzen 2) nicht-homologe = integrative Rekombination: Einbau eines DNA-Abschnitts in ein anderes DNA-Molekül unhabhängig von Sequenzhomologien (Beispiel: Transposon) Homologe Rekombination Voraussetzung Strangbrüche Einzelstrang-DNA Bereiche Cross-over "Branch migration"

95 Cross-overs führen zu neuen Allelkombinationen A a B b A a B b A a b B Chiasma Meiose I (Reduktionsteilung) Prophase I: wesentlich länger als bei der Mitose Synapsis: paarweise Anordnung homologer Chromosomen Chiasmata als Folge von homologer Rekombination Metaphase I: Metaphasenplatte: Tetrade homologer Chromosomen voneinander unabhängige Anordnung der Chromosomen Anaphase I: Wanderung homologer Chromosomen Schwesterchromatiden bleiben an Centromeren verbunden Telophase I und Cytokinese

96 Prophase II Metaphase II Anaphase II Telophase II analog zur Mitose aber: haploider Chromosomensatz Cytokinese Mitose: es entstehen 2 Tochterzellen, die genetisch identisch zueinander und zur Elternzelle sind Meiose: es entstehen 4 Tochterzellen, die sich genetisch voneinander und von der Elternzelle unterscheiden Meiose I: homologe Chromosomen werden getrennt Mitose: Schwesterchromatiden werden getrennt

97 Cohesin Komplex Interphase Prophase I Cohesin Komplex Prophase I Metaphase I

98 Cohesin Komplex Metaphase I Anaphase I Cohesin Komplex Separase Metaphase II Anaphase II

99 Cross-over während Prophase I synaptonemaler Komplex hält homologe Chromosomen zusammen Synapsis paarweise Anordnung homologer Chromosomen Chiasma Struktur in Meiose zeigt Cross-over an Homologe Rekombination in der Meiose Homologe Rekombination -> neue Allelkombinationen Cross-over -> Austausch von Blöcke zwischen homologen Chromosomen Ergebnis: Erhöhung der genetischen Diversität

100 Mitose ist eine konservativer Prozess der den Status Quo aufrechterhält Meiose erzeugt dagegen Variation 1) Zufällige Verteilung mütterlicher und väterlicher Chromosomen 2) Neue Allelkombinationen durch homologe Rekombination zwischen Chromosomen Geschlechtschromosomen p pseudoautosomale Region X-chromosomale Vererbung q Duchenne's Muscular Distrophy Atrophie der Muskeln X Y Lebenserwartung: 20 Jahre

101 Geschlechtsbestimmung Mensch XX XY homogametisch heterogametisch heteromorphe Chromosomen Geschlechtsbestimmung Drosophila X:A = 1 X:A = 0,5 2n Ameisen 1n

102 XX XY XXY X0 Drosophila Mensch X-Chromosomen Inaktivierung Barr Körperchen Zum Ausgleich der Genexpression: ein X-Chromsom inaktiviert Früh in der Entwicklung wird zufallsbedingt das maternale oder das paternale X inaktiviert

103 X-Chromosomen Inaktivierung X-Chromosomen Formale Genetik: Mendel Wie berechnet man die Vererbung von Genen? Wie kann man diese Gesetze nutzen? Gelten die Mendelschen Gesetze immer? Was bedeutet genetische Analyse?

104 Verwendung reiner Linien: Linien, die homozygot für das betrachtete Merkmal sind Quantitative Behandlung der Daten: Statistik Fellfarbe von Mäusen Mehrere Gene bestimmen die Fellfarbe Die wichtigsten sind: A: Agouti B: Brown C: Albino D: Dilute A: agouti a: non-agouti (schwarz) Diese Gene bestimmen Synthese (B, C) und Verteilung des Pigments (A, D)

105 Fellfarbe von Mäusen A: Agouti a: non-agouti A: agouti a: non-agouti (schwarz) Fellfarbe von Mäusen C: Wildtyp (Agouti) c: Albino

106 Allele C c alternative Formen eines Gens gleiche Position (Genort) homologer Chromosomen -> alternative Ausprägungen eines Merkmals Homozygotie Eine Linie ist homozygot für ein Genpaar: zwei identische Allele an einem Genort CC oder cc Heterozygotie Eine Linie ist heterozygot für ein Genpaar: zwei unterschiedliche Allele an einem Genort Cc

107 Dominantes Allel Ein dominantes Allel bestimmt allein die Ausprägung des Phenotyps bestimmt Phenotyp im homo- und heterozygoten Zustand Y dominant über y -> identischer Phenotyp von YY und Yy Rezessives Allel Rezessives Allel exprimiert Phenotyp nur im homozygoten Zustand CC Cc cc CC x cc -> Genotyp Cc Phenotyp agouti CC cc

108 1. Mendelsches Gesetz Bei der Gametenbildung trennen sich die beiden Mitgleider eines allelischen Paares und werden Bestandteil getrennter Gameten. Die Gameten enthalten damit nur je eines der Allele CC cc Gameten: C C c c

109 CC X cc P C c Cc F1 F1: Cc 1. Mendelsches Gesetz Bei der Gametenbildung trennen sich die beiden Mitgleider eines allelischen Paares und werden Bestandteil getrennter Gameten. Die Gameten enthalten damit nur je eines der Allele Uniformitätsregel Bei der Kreuzung reiner Linien sind die Nachkommen in der F1 Generation alle gleich

110 Cc X Cc F1 C c C c F2 Cc X Cc F1 C c C c CC Cc Cc cc F2 F2 :

111 Cc X Cc F1 C c C c CC Cc Cc cc F2 F2 : Cc X Cc F1 C c C c CC Cc Cc cc F2 F2 3:1 :

112 X F1 Cc Cc C c C CC Cc F2 c Cc cc F2 : % 25% 1. Mendelsches Gesetz Bei der Gametenbildung trennen sich die beiden Mitgleider eines allelischen Paares und werden Bestandteil getrennter Gameten. Die Gameten enthalten damit nur je eines der Allele Uniformitätsregel Bei der Kreuzung reiner Linien sind die Nachkommen in der F1 Generation alle gleich Spaltungsregel Bei der Kreuzung von Individuen der F1-Generation spalten sich die Merkmale in definierten Zahlenverhältnissen auf

113 Genotyp Phenotyp YY Yy yy F1 yy 1:2:1 3:1 X P C R C R C W C W F1 C R C W intermediärer Phenotyp unvollständige Dominanz

114 Intermediärer Erbgang X C R C W C R C W C R C W C R C R C R C W F1 F2 1:2: C R C W C R C W C W C W F2 1. Mendelsches Gesetz Bei der Gametenbildung trennen sich die beiden Mitgleider eines allelischen Paares und werden Bestandteil getrennter Gameten. Die Gameten enthalten damit nur je eines der Allele Uniformitätsregel Bei der Kreuzung reiner Linien sind die Nachkommen in der F1 Generation alle gleich Spaltungsregel Bei der Kreuzung von Individuen der F1-Generation spalten sich die Merkmale in definierten Zahlenverhältnissen auf Aufspaltung der Merkmale in der F2 dominant-rezessiver Erbgang: 3 : 1 (dominantes : rezessives Merkmal) intermediärer Erbgang: 1: 2 : 1

115 Rückkreuzung X cc R F1 F1 1:1 : Rückkreuzung Cc X cc R c c C c Cc cc Cc cc F1 F1 1:1 :

116 X R Rückkreuzung CC cc c c C Cc Cc F1 C Cc Cc F1 Reziprozität Ausprägung des Merkmals ist unabhängig davon ob der männliche oder der weibliche Elternteil ein bestimmtes Allel vererbt. P X X CC cc cc CC F1 Cc cc

117 2. Mendelsche Gesetz Verschiedene Allelpaare segregieren bei der Gametenbildung unabhängig voneinander und können neu kombiniert werden Beispiel Brown (B) AA BB aa bb AA;BB agouti aa;bb black AAbb cinnamon aa;bb brown

118 AA;BB X aa;bb P a;b a;b A;B A;B Aa;Bb Aa;Bb Aa;Bb Aa;Bb F1 F1 F1 Aa;Bb X Aa;Bb Gameten: A;B A;b a;b a;b

119 A;B A;b a;b a;b A;B A;b a;b F2 a;b A;B A;b a;b a;b A;B A;b a;b AA;BB AA;Bb Aa;BB Aa;Bb AA;bB AA;bb Aa;bB Aa;bb aa;bb aa;bb aa;bb aa;bb F2 a;b aa;bb aa;bb aa;bb aa;bb

120 2. Mendelsche Gesetz Verschiedene Allelpaare segregieren bei der Gametenbildung unabhängig voneinander und können neu kombiniert werden Das 2. Mendelsche Gesetz trifft nur für Gene zu, die nicht gekoppelt sind, also z.b. auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert sind! Carl Correns Hugo De Vries Erich von Tschermak-Seysenegg Zur Geschichte der Genetik: Thomas Hunt Morgan Drosophila melanogaster Geschlechtsgebundene Vererbung

121 I Hämophilie A in europäischen Königshäusern Ausgangspunkt : Königin Victoria I.1: Victoria II.3: Alice von Hessen II.9: Leopold von Albany 1 2 weiblich männlich II III Geschlechtschromosomen X-chromosomale Vererbung Hämophilie A: Faktor VIII Defizienz X Y hemizygot: Gen nur in einer Kopie pro diploiden Genom vorhanden

122 Mutation = Veränderung der Sequenz eines Gens oder eines Chromosoms im Vergleich zum Wildtyp Wildtyp = Genotyp oder Phenotyp, der in der Natur oder in einem Standard-Stamm im Labor zu finden ist. Polymorphismus = verschiedene Varianten eines Gens oder Merkmals in einer Population Polymorphismus: A, B, C C A B Mutation: 1 Organismus

123 SNP ("snip") Single Nucleotide Polymorphism AAGCCTA AAGCTTA DNA Sequenzvariation im Mittel alle bp (humanes Genom) Mutation 1) Genom-Mutation: Veränderung des Genoms, z.b. Änderung der Zahl der Chromosomen Beispiel: Trisomie 21 (Down's Syndrome)

124 Mutation 1) Genom-Mutation: Veränderung des Genoms, z.b. Änderung der Zahl der Chromosomen 2) Chromosomen-Mutation: Veränderung der Form und Strukur von Chromosomen 3) Gen-Mutation: Veränderung in der Sequenz eines Gens oder seiner Kontrollsignale Genetische Analyse Mutagenese (Strahlung, Chemisch, Transposon) F0 Mutanten Gen

125 F0 Nachkommen Mutante mit Entwicklungsdefekt Klonierung des Gens X A

126 b + b vg + vg grau schwarz b + vg + ; b + vg + x b vg; b vg normal Stummelflügel (vestigial) P b + vg + ; b vg x b vg; b vg F1 b + b vg + vg grau schwarz b + vg + ; b + vg + x b vg; b vg normal Stummelflügel (vestigial) b + vg + b vg b + vg + ; b vg x b vg; b vg P F1 b + vg + wt b vg schwarz vestigial b + vg b vg + wt vestigial schwarz wt b vg F2 17% Rekombination (391 von 2300)

127 b + b vg + vg grau schwarz Kreuzung zur Genkartierung normal (linkage map) Stummelflügel b + vg + b vg b + vg + b vg 17 cm b + vg b vg + 1 cm (centimorgan) = 1% Rekombinationshäufigkeit wt schwarz vestigial wt vestigial schwarz wt b vg % Rekombination A a A a B b B b C c C c Gameten Rekombination AB 50 % AB AB ab 48,5 % 48,5 % 97% AB ab ab 50 % ab Ab ab 1,5 % 1,5 % 3% Ab ab 100 %

128 A a B b C c Rekombination AB ab 48,5 % 48,5 % 97% AC ac 46 % 46 % 92% Ab ab 1,5 % 1,5 % 3% Ac ac 4 % 4 % 8% 100 % 100 % A a B b C c 3 cm 8 cm AB ab Ab ab 48,5 % 48,5 % 1,5 % 1,5 % AC ac Ac ac 46 % 46 % 4 % 4 % 1 cm (centimorgan) = 1% Rekombinationshäufigkeit

129 A a B b C c 3 cm 5 cm Genkarte 8 cm AB 48,5 % AC 46 % BC 47,5 % ab 48,5 % ac 46 % bc 47,5 % Ab ab 1,5 % 1,5 % Ac ac 4 % 4 % Bc bc 2,5 % 2,5 % Genkarte Additivität der Rekombinationsfrequenzen nur bei geringen Abständen! Grund: Doppel Cross-over A a B b C c A a b B C c 3 cm 5 cm 7 cm

130 Identifikation des mutierten Gens Ko-Segregation der Mutation mit einer bekannten DNA-Sequenz nach einer Test-Kreuzung X A B C unbekanntes Gen genetische Karte physikalische Karte Autosomal dominanter Erbgang weiblich männlich

131 Autosomal dominanter Erbgang weiblich männlich x,d,f f x,d,f f x,d f x,d x d x,d f f x,d x,d Mutante Wild typ x Mutation d, f Marker 10% der Population Multiple Allele: Agouti Phenotyp Gensymbol Genotyp Yellow A Y A Y A Agouti A AA non-agouti a aa black-and-tan a t a t a t

132 Multiple Allele: Agouti AA x aa -> AA x a t a t -> Genotyp Aa Aa t Phenotyp agouti agouti a t a t x aa -> a t a black-and-tan A > a t > a Multiple Allele Allelische Serie Satz von Allelen A Y > A > a t > a Dominanz und Rezessivität definiert sich im Kontext eines Paares von Allelen a t ist dominant über a aber rezessiv gegenüber A

133 Yellow x Agouti Yellow : Agouti = 1 : 1 Schlussfolgerung: heterozygot Yellow dominant über Agouti Yellow x Yellow Yellow : Agouti = 2 : 1

134 Yellow x Yellow A Y A A Y A Embryo: A Y A Y : A Y A : AA = 1 : 2 : 1 Neugeborene: A Y A : AA = 2 : 1 Yellow : Agouti = 2 : 1 1. Schlussfolgerung: der Genotyp A Y A Y ist embryonal letal! 2. Schlussfolgerung: der Genotyp A Y A Y ist rezessiv letal! Pleiotropie: Mutation hat Auswirkungen auf mehrere, scheinbar unzusammenhängende Merkmale Das mutierte Gen codiert für ein Protein, das an mehreren Prozessen beteiligt ist A Y : 1) Fellfarbe 2) Embryonale Letalität

135 Agouti: sekretiertes Protein steuert Melanin-Synthese und Fettstoffwechsel A a Wildtyp Null-Mutante A Y Mutante in nicht-kodierender Region -> Expressionsmuster verändert Bb;Cc X Bb;Cc

136 B;C B;c b;c b;c B;C B;c b;c b;c BB;CC BB;Cc Ba;CC Bb;Cc BB;cC BB;cc Bb;cC Bb;cc bb;cc bb;cc bb;cc bb;cc bb;cc bb;cc bb;cc bb;cc F2 schwarz : braun: albino = 9 : 3 : 4 Epistase agouti : non-agouti: albino = 9 : 3 : 4 Erwartung nach Mendel: 9 : 3 : 3 : 1

137 Epistase Epistase: Interaktion zwischen nicht-allelischen Genen, bei der ein Gen die phenotypische Ausprägung des anderen Gens verhindert. Die Wirkung eines Gens hängt also von der Aktivität eines anderen Gens ab. Der Genotyp cc ist epistatisch gegenüber BB Der Nachweis einer epistatischen Beziehung: genetische Hierarchie von Genen C B

138 Agouti C (Tyrosinase) Rezeptor B (Tyrp1) Melanocyt Abweichungen vom Mendelschen Erbgang bei monohybriden Erbgängen sind Anzeichen für: Letalität Abweichungen vom Mendelschen Erbgang bei dihybriden Erbgängen sind Anzeichen für: - Koppelung der Gene (die Gene liegen auf einem Chromosom) - Epistase

139 Imprinting (genomische Prägung) Ausprägung mütterlich und väterlich vererbter Allele unterscheidet sich, obwohl Sequenzen identisch sind Nachkommen igf2 igf2 Expression + - Angelmann und Prader-Willi Syndrom Chr. 15 Deletion! * *! Prader-Willi Syndrom Angelmann Syndrom

140 DNA Methylierung de novo Methylierung CG GC DNMT CH 3 CG GC CH 3 DNMT: DNA Methyltransferasen DNA Methylierung Erhaltungs Methylierung Replikation CH 3 CG GC CH 3 CH 3 CG GC CG GC CH3 DNMT: DNA Methyltransferasen

141 CH 3 CG GC CG GC CH 3 DNA Methylierung Erhaltungs Methylierung Replikation DNMT CH 3 CG GC CH 3 CH 3 CG GC CH 3 DNMT: DNA Methyltransferasen Transkription II: Eukaryoten Wie werden eukaryotische Gene transkribiert? Was ist der Unterschied zu Bakterien? Wie funktioniert die RNA Polymerase? Was ist die Rolle des Chromatins?

142 Eukaryoten haben drei RNA Polymerasen RNA Polymerase I RNA Polymerase II RNA Polymerase III 28S-, 18S- und 5,8S-rRNA proteinkodierende Gene regulatorische RNAs (mirna) Gene für: 5S-rRNA, trnas und andere "kleine" RNAs Struktur von RNA Polymerase II Promotoren Enhancer // Proximale Promotor-Elemente Core Promotor Haushaltsgene regulierte Gene

143 Struktur von RNA Polymerase II Promotoren Initiator BRE um Position -35 TATA-Box um Position -25 BRE BRE: TFIIB recognition element Aber: nur ein kleiner Teil der Gene hat TATA-Box oft bei regulierten Genen Struktur von RNA Polymerase II Promotoren 1) variabler als bei Prokaryoten 2) Core Promotor: basale Transkription 3) Proximale Promotor-Elemente 4) Enhancer

144 Struktur von RNA Polymerase II Promotoren Promoter-Region: generelle Transkriptionsfaktoren (TFII) ermöglichen Initiation der Transkription durch RNA Polymerase II TFIID TATA-Box Initiation der Transkription durch Polymerase II Schrittweiser Aufbau des Initiatiationskomplex TFIID bindet an die TATA-Box TBP: TATA Bindeprotein Untereinheit von TFIID TFIID TATA-Box

145 TFIID + TFIIB: Plattform für Bindung weiterer TFIIs und RNA Polymerase II Schrittweiser Aufbau des Initiatiationskomplex TFIIB bindet an Promotor TFIIB TFIID TATA-Box TFIID + TFIIB: Plattform für Bindung weiterer TFIIs und RNA Polymerase II TFIID Pol II TATA-Box

146 TFIID + TFIIB: Plattform für Bindung weiterer TFIIs und RNA Polymerase II Zuletzt bindet TFIIH TFIIH TFIID Pol II TATA-Box TFII's und RNA-Polymerase II: geschlossener Initiationskomplex (Prä-Initiationskomplex) TFIIH TFIID Pol II TATA-Box

147 TFIIH: DNA-Helicase Aktivität, entwindet DNA des Promotors: offener Initiations-Komplex TFIIH TFIID Pol II TATA-Box TFIIH: Protein-Kinase Aktivität: Phosphorylierung des C-Terminus der RNA-Polymerase P P P P P P P C IIE TFIIH TFIID Pol II TATA-Box

148 Phosphorylierung des C-Terminus -> Dissoziation des Initiationskomplexes -> Elongation P P P P P P P C IIE TFIIH TFIID Pol II TATA-Box Elongation: TFIID bleibt an TATA-Box gebunden -> neue Initiation Elongationskomplex TFIIH P P P P P P P C Pol II TFIID ATA-Box

149 Initiation an Pol II Promotoren 1) TFIID erkennt die TATA-Box -> Plattform für Polymerase II 2) TFIIH phosphoryliert C-Terminus der Polymerase II 3) Phosphorylierung -> Polymerase II löst sich von TATA-Box -> Synthese der mrna Unterschiede zu Prokaryoten 1) RNA-Polymerase in Bakterien ausreichend für Initiation in Eukaryoten: allgemeine Transkriptionsfaktoren notwendig 2) Promotor in Eukaryoten nicht ausreichend für effiziente Initiation

150 Genregulation II: Transkriptionsfaktoren Wie werden eukaryotische Gene reguliert? Was sind Transkriptionsfaktoren? Welche Rolle hat das Chromatin bei der Regulation? Struktur von RNA Polymerase II Promotoren TATA-Box Proximale Promotor-Elemente z.b. bei regulierten Genen

151 CRE: camp-responsive Element CRE ist ein Promoter-Element - > camp-induzierte Transkription CRE TATA-Box Initiator Der Aufbau von CREB CREB: CRE binding protein DNA-Bindungsdomäne basisch N C Aktivierungsdomäne Glu-reich: sauer Dimerisierungsdomäne Leucine-Zipper

152 Der Aufbau von CREB DNA-Bindungsdomäne Aktivierungsdomäne Dimerisierungsdomäne N C S P Phosphorylierung durch PKA (Protein Kinase A)

153 Ligand Rezeptor Adenylat-Cyclase ATP camp Second Messenger Protein-Kinase A (PKA) ADP ATP CREB CREB-P Co-Aktivatoren: CBP CREB-Bindeprotein: CBP P P TFIID

154 CREB -> Rekrutierung von CBP Co-Aktivatoren: CBP CBP -> Rekrutierung von RNA Polymerase II P CBP P PolII TFIID Co-Aktivatoren: CBP CBP: Histon-Acetyl-Transferase (HAT) Histon-Acetylierung verändert die Chromatin-Struktur -> Aktivierung des Gens P CBP P PolII TFIID

155 Chromatin-Remodeling Komplex CRE P P CBP TATA Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac AcAc Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Chromatin-Remodeling Komplex CRE P P CBP TATA Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac AcAc Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac

156 Aktivierungsdomänen der Transkritionsfaktoren Rekrutieren Co-Aktivatoren (z.b. CBP) Co -Aktivatoren interagieren mit - RNA Polymerase II - allgemeinen Transkriptionsfaktoren - Chromatin Funktion als -> Gerüstprotein -> Enzym Alles zusammen fördert Assemblierung der Transkriptionsmaschinerie am Promotor Vergleich Regulation durch camp in Pro- und Eukaryoten Bakterien direkte Regulation bindet Transkriptionsfaktor Eukaryoten indirekte Regulation aktiviert Kinase

157 CREB und Lernen Synapse -> camp -> CREB -> Transkription -> Genprodukte -> Verstärkung der Synapse Wirkung von Steroidrezeptoren Hsp90 Hsp90 hält Rezeptor in Abwesenheit von Hormon im Cytoplasma Ligand: Steroid-Hormon Kernpore HRE TFIID

158 Chromatin-Remodeling Komplex Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac AcAc Ac Ac Ac Ac HRE TATA Ac Ac Ac Ac Chromatin-Remodeling Komplex Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac AcAc Ac Ac Ac Ac HRE TATA Ac Ac Ac Ac

159 Struktur von RNA Polymerase II Promotoren Enhancer Promotor Enhancer aktivieren Transkription über grosse Distanzen Struktur von RNA Polymerase II Promotoren Enhancer Promotor Enhancer binden spezifische Transkriptionsfaktoren

160 Struktur von RNA Polymerase II Promotoren Enhancer binden spezifische Transkriptionsfaktoren Stimulation Transkription? nein nein ja Rekrutierung von Co-Aktivatoren Komplex aus Co-Aktivatoren und allgemeinen Transkriptionsfaktoren Enhancer // Promotor Mediatorkomplex P P TFIID PolII

161 Struktur von RNA Polymerase II Promotoren Enhancer // Promotor Promotor: Startpunkt der Transkription: (Initiationspunkt und Richtung) abhängig von Orientierung Enhancer: Stärke der Expression unabhängig von Position und Orientierung Transkriptionsmaschinerie Repressoren der Transkription wirken z. B. durch: Rekrutierung von Histon-Deacetylasen (HDAC) Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac AcAc Ac Ac Ac Ac TATA Ac Ac Ac Ac

162 Transkriptionsmaschinerie Repressoren der Transkription wirken z. B. durch: Histon-Methyltransferasen (HMT) Me Me Me Me Me Me Me Me MeMe Me Me Me Me Me Me Me Me R K RK K RK K KR KK R H3 Acetylierung: Aktivierung der Genexpression Methylierung: Repression der Genexpression

163 DNA Methylierung MBP: Methyl CpG Binding Protein HMT: Histon Methyl Transferase HMT CH 3 CH 3 CH 3 CG 1) Nucleosomen entfernen (Hindernis) 2) Nucleosomen aufbauen (Schutz vor falscher Initiation, crpytische TATA Boxen) P C P P P P P P Pol II

164 HDAC P P P P P P HMT C Me Me Me Me P Pol II HAT Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Transkriptionsmaschinerie RNA Polymerasen Allgemeine Transkriptionsfaktoren (TFIID, TFIIB, TFIIH etc.) Sequenzspezifische Transkriptionsfaktoren (CREB) Co-Aktivatoren (CBP) Histonacetylasen/Histondeacetylasen Histonmethyltransferasen Chromatin-Remodeling Komplexe

165 Genregulation III: Spleissen Wie entsteht die reife mrna? Genstruktur: Eukaryonten Exon Intron Exon prä-mrna AUG Transkription STOP mrna Spleissen

166 Genstruktur: Eukaryonten Cap mrna A eukaryotische mrna enthalten modifizierte 5' und 3' Enden 5' Ende: Cap 3' Ende: Poly(A)-Ende Kurz nach Beginn der Synthese wird das 5'-Ende der mrna modifiziert: Capping: mg-ppp-mrna Cap: 7-Methylguanosin über eine 5'-5'-Triphosphat-Brücke

167 Termination 3' Ende der mrna durch Endonuclease gebildet -----AAUAAA-----(10-30 nt) ----CAUUCACCUCUGUGUUUGUGUCUGC -----AAUAAA-----(10-30 nt) ----CAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 1) Nucleotide 3' des Polyadenylierungssignals: pre-mrna von einer Endonuclease geschnitten 2) An das 3'-Ende der pre-mrna Adenylat-Reste angeheftet: Polyadenylierung Prozessierung eukaryotischer mrna 1) 5'-Ende: Capping (mg-ppp-) 2) 3'-Ende: Endonuclease 3) Polyadenylierung des 3'-Endes 4) Splicing zur Entfernung der Introns

168 Erkennungssequenzen für das Splicing Exon Donor 5' splice site 3' splice site b ---NN GU // A YYYYYYYNCAG N Intron Akzeptor Exon Y: Pyrimidin (C oder T) ---AGG prä-mrna 1. Transesterreaktion 2'-OH Exon 1 Exon 2 NN P GU A AG P 2'-OH P NN GU A AG P G NN-OH U P 3' A AG P Exon 1 Exon 2 Lariat

169 2. Transesterreaktion G NN-OH U P 3' A Branch point AG P G U P NN A AG P Exon 1 Exon 2 NNP Spleissreaktion: Zwei-Schritt-Reaktion koordinierte Lösung und Bildung von Phosphodiester-Bindungen: 2 Transester-Reaktionen Zahl der Ester-Bindungen bleibt gleich -> keine Energiezufuhr (ATP)

170 Elongation CE: Capping Enzym 7mG CE mrna P C P P P P P P Pol II TFIID Elongation CE: Capping Enzym SF: Splicing Faktoren SF mrna 7mG SF SF P P P P P P P C Pol II

171 Elongation SF mrna 7mG CE: Capping Enzym SF: Splicing Faktoren 3' PF: 3' Ende Prozessierungs Faktoren P C 3' PF P P P P P AAUAAA P Pol II Elongation Pol II CTD als flexible Plattform für: CE: Capping Enzym SF: Splicing Faktoren 3' PF: 3' Ende Prozessierungs Faktoren P C P P P P P P Muster der Phosphorylierung Pol II

172 PABP: Poly(A) binding protein AAAAAAAAAAAAA eif4g 7mG eif4e eif: Initiationsfaktoren Genregulation IV: Translation in Eukaryoten Wie werden mrnas translatiert? Wie kommen Proteine in die Zellmembran? Was ist RNA Interferenz?

173 Eukaryotische Ribosomen 60S-Untereinheit 40S-Untereinheit 60 S 40 S 80 S Initiation ternärer Komplex aus Intitiator-tRNA Inititationsfaktor eif2 und der kleinen 40 S Untereinheit eif2 Met 40 S

174 Initiation eif2 AUG 40 S Met mrna Initiation beginnt am 5'-Ende der mrna und erfolgt in der Regel am ersten AUG Translation in Eukaryoten im Prinzip wie bei Bakterien aber: Initiationskomplex erkennt Cap bewegt sich in 5'->3' Richtung zum ATG also: keine interne Initiation!

175 Unterschiede in der Translation von Pro- und Eukaryoten Prokaryoten Eukaryoten Ribosomen 70 S 80 S Transkription und Translation gekoppelt getrennt Initiation intern 5'-Ende Cap-abhängig Translation 1) zytosolische Proteine: Zytosol 2) Membran- und sezernierte Proteine: rauhes ER

176 Membranprotein Hydrophob Sezernierte Proteine und Membranproteine enthalten ein Signalpeptid Met-Gly-Leu-Gly-Leu-Leu-Leu-Pro-Leu-Leu-Leu-Leu-Trp-Thr-Arg Signalpeptid hydrophobe Aminosäuren

177 sezernierte Proteine Signalpeptid Transmembrandomäne integrales Membranprotein Signal Recognition Particle = SRP mrna SRP-Rezeptor Lumen des ER

178 mrna SRP-Rezeptor Lumen des ER mrna SRP-Rezeptor Lumen des ER

179 Translokationskanal SRP-Rezeptor Lumen des ER Translokationskanal Lumen des ER

180 Peptidase entfernt Signalpeptid Lumen des ER Lumen des ER

181 Lumen des ER Membranproteine und sekretierte Proteine Signalpeptid vom Signal Recognition Particle (= SRP) gebunden Peptid durch Membrankanal in das ER geschleust Peptidase entfernt das Signalpeptid

182 RNA Interferenz Transkription durch RNA Pol. II Cap (A) n Vorläufer Dicer pre-microrna (pre-mirna) mirna (ds, ca. 22 bp) RISC (RNA-induced silencing complex) 5' mrna Cap (A) n 3' Repression der Translation RNA Interferenz exogene sirna (small interfering RNA) Dicer exogene shrna mirna (ds, ca. 22 bp) (small hairpin RNA) RISC (RNA-induced silencing complex) 5' Cap 3' (A) n Cap Abbau der mrna (A) n

183 Rekombinante DNA II Wie können wir genetische Information manipulieren? Welche Werkzeuge haben wir dafür? Was sind Phagen, Transposons, Plasmide? cdna kodierende Sequenz für Insulin kodierende Sequenz für Insulin Expressionsvektor für Bakterien

184 Polymerase Kettenreaktion (Polymerase chain reaction) Thermostabile DNA-Polymerase Taq Polymerase: DNA Polymerase von Thermus aquaticus DNA-Primer (20-30 nt lange chemisch synthetisierte Oligonucleotide) PCR ermöglicht die Amplifikation von DNA-Sequenzen aus geringsten Mengen DNA Aufgabe: Amplifikation eines DNA-Fragments

185 Denaturierung Polymerase Kettenreaktion (Polymerase chain reaction) 100 o C Temperatur Annealing Extension Denaturierung 30 Zyklen Zeit

186 Klonierung mittels PCR Insulin cdna kodierende Sequenz für Insulin kodierende Sequenz für Insulin Expressionsvektor für Bakterien DNA-Sequenzierung Denaturierung -> Einzelstränge Template + Primer + DNA-Polymerase, dntps dideoxy-nucleotid

187 Sequenzierung nach der Sanger-Methode CCCG '3-GGGCATGTGGGCTGAGGCAGGCTTGCCCA-5' CCCGTACA '3-GGGCATGTGGGCTGAGGCAGGCTTGCCCA-5' CCCGTACACCCG '3-GGGCATGTGGGCTGAGGCAGGCTTGCCCA-5' CCCGTACACCCGAC '3-GGGCATGTGGGCTGAGGCAGGCTTGCCCA-5' CCCGTACACCCGACT '3-GGGCATGTGGGCTGAGGCAGGCTTGCCCA-5' Terminatoren: A, G, C, T -> Abbruch der DNA-Synthese Expression von rekombinantem Insulin in Bakterien mrna in cdna umschreiben mit Reverser Transkriptase cdna-klon PCR Klonierung Sequenzierung Expression

188 RFLP: Restriction fragment length polymorphism EcoRI Allel A EcoRI 3 kb EcoRI EcoRI Allel B EcoRI 1 kb 2 kb Hybridisierung Denaturierung + markiert Probe 32 P

189 Hybridisierung 60 o C AA BB AB EcoRI Allel A EcoRI 3 kb EcoRI EcoRI Allel B EcoRI 1 kb 2 kb EcoRI EcoRI Probe

190 A B Anwendung der PCR: Fingerprinting VNTR: repetitive Sequenzen (variable number of sequence repeats) (AC) n

191 SNP ("snip") Single Nucleotide Polymorphism AAGCCTA AAGCTTA DNA Sequenzvariation im Mittel alle bp (humanes Genom)