Theoretische Grundlagen: Enzymreaktionen S Photometrie S. 31 Immunologische Bestimmungsmethoden (S. 56) Bezug zu anderen Plätzen:

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1 144 PLATZ 9: ENZYMIMMUNTEST EINES HORMONS, BINDUNG VON TESTOSTERON AN DAS SEXHORMON-BINDENDE GLOBULIN IM PLASMA, ELEKTROLYT- VERTEILUNG UND ELEKTROLYTREGULATION IM ORGANISMUS Die Messung der Enzymaktivität, wie sie im Experiment 1.6 und 1.8 vorgenommen wird, liefert Information über die Geschwindigkeit einer Enzymreaktion unter standardisierten, optimalen Bedingungen mit Substrat in sättigender Konzentration. Einen besseren Einblick in den Mechanismus einer Enzymreaktion gewinnt man aus der Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit v von der Substratkonzentration [S] (Exp. 9.1), vom ph-wert (Exp. 9.2), von Temperatur, Ionenstärke usw. Unsere heutigen Kenntnisse über den Reaktionsmechanismus von Enzymen (vgl. Chymotrypsin, Exp. 10.1) basieren auf solchen kinetischen Untersuchungen und auf Daten über die Struktur der Enzyme (Aminosäurensequenz und Kristallstrukturanalyse). Immunologische Bestimmungsmethoden werden zum Nachweis von Stoffen verwendet, die nur in sehr geringen Mengen in biologischem Material vorkommen (z.b. Hormone). Radioimmunoassay und Enzymimmunoassay sind ebenfalls zu Routineverfahren im biochemischen und klinischchemischen Labor geworden. Als Beispiel für einen Enzymimmunoassay wird in Exp. 9.5 die Thyroxinkonzentration im Serum "in silico" bestimmt. Theoretische Grundlagen: Enzymreaktionen S Photometrie S. 31 Immunologische Bestimmungsmethoden (S. 56) Bezug zu anderen Plätzen: Aktivität und Substratspezifität von Alkoholdehydrogenase, Exp. 1.7 Aktivität von Kreatinkinase, Exp. 1.8 Titrationskurven von Aminosäuren, Exp. 2.2

2 145 EXPERIMENT 9.1: Enzymimmuntest zur Thyroxin-Bestimmung im Serum (in silico) Prinzip: Thyroxin im Serum wird mittels eines Enzymimmunoassays vom Typ ELISA (Enzyme-Linked- Immuno-Sorbent-Assay) bestimmt. Der Antikörper (AK) ist kovalent an die Innenwand von Plastikröhrchen (coated tubes) gebunden. Freies und gebundenes Antigen (AG) können somit einfach voneinander getrennt werden. Durch Ausgiessen oder Absaugen der Flüssigkeit werden die freien Antigenmoleküle entfernt, während die an die Röhrchenwandung gebundenen Antigen-Antikörper- Komplexe zurückbleiben. Gemäss dem Massenwirkungsgesetz stellt sich folgendes Gleichgewicht ein: Die enzymmarkierten Antigenmoleküle (AG* = T4-Enzym), die in konstanter Konzentration vorliegen, konkurrieren mit den zu bestimmenden unmarkierten Antigenmolekülen (AG = T4) um die in konstanter Menge vorliegenden Bindungsstellen des Antikörpers. Die Menge des unmarkierten Antigens bestimmt, wieviel enzymmarkiertes Antigen gebunden wird. Je mehr unmarkiertes Antigen in der untersuchten Probe vorhanden ist, desto weniger enzymmarkiertes Antigen kann gebunden werden. Das bei diesem Test zur Markierung des Antigens verwendete Enzym ist eine Peroxidase (POD) ähnlicher Art, wie sie bei der Glucose-Bestimmung (Exp. 1.3) verwendet wird. Der immunologischen Reaktion folgt eine Indikatorreaktion, mit der die gebundene Enzymaktivität erfasst wird. Dabei wird die Peroxidase-Aktivität im wandfixierten Enzym-Antigen-Antikörperkomplex (AG*-AK-Komplex) nach Zugabe der Substrate (Wasserstoffperoxid und Chromogen) photometrisch bestimmt.

3 Der bisher verwendete T4-ELISA der Firma Boehringer Mannhein wird nur noch für ein vollautomatisch arbeitendes Analysegerät hergestellt. Ein Ersatz-ELISA steht nicht zur Verfügung. Der T4-Immuntest wird deshalb mit einer Animation im Bipweb in silico, d.h. virtuell, dargestellt (siehe Bipweb, Exp. 9.5). Der Tests wird "in silico" durchgeführt Im virtuellen Test werden die selben Arbeitsschritte durchgeführt und die gleichen Materialien eingesetzt wie im realen Testverfahren. Material/Reagenzien: - Plastikröhrchen mit Thyroxin-Antikörpern (aus Kaninchen) beschichtet (coated tubes) - Inkubationslösung (Thyroxin-POD-Konjugat in Pufferlösung, ph 8.6) - Substratlösung (H 2 O 2 und Chromogen in Pufferlösung, ph 5.0) - Standard- und Probenlösungen Die Konzentration der Standardlösungen ist auf den Originalfläschchen angegeben. Sie ist je nach Lieferung der Vertreiberfirma etwas verschieden. a: 0 µg/dl b: 3-4 µg/dl c: 7-8 µg/dl d: µg/dl e: µg/dl 146 Ausführung:

4 Pipettieren Standard Probe Standardlösung a 0.02 ml Standardlösung b 0.02 ml Standardlösung c 0.02 ml Standardlösung d 0.02 ml Standardlösung e 0.02 ml Patientenprobe 0.02 ml Inkubationslösung 1a 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml Bei rascher Zugabe der Inkubationslösung zu den Röhrchen erfolgt ausreichende Vermischung mit dem Probematerial. 2. Inkubieren 30 min bei Raumtemperatur. 3. Aussaugen des Röhrcheninhalts (Pasteurpipette an Wasserstrahlpumpe verwenden). 4. Waschen des Röhrchens mit Leitungswasser aus der Spritzflasche: bis zum Rand füllen und ca. 10 min stehen lassen, aussaugen (Pasteurpipette an Wasserstrahlpumpe verwenden). 5. Pipettieren von 1 ml Substratlösung in konstanten Zeitintervallen (30 s) in die 6 Röhrchen, anschliessend mit Parafilm verschliessen. Mischen durch Kippen der Röhrchen. Nicht schütteln, wegen Schaumbildung! 6. Exakt 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. 7. Pipettieren von 0.1 ml Stoppreagens in gleichen Zeitintervallen (30 Sekunden) wie Substratlösung, sofort mischen durch Kippen der Röhrchen. Messung: Photometer bei einer Wellenlänge von 405 nm gegen Luft auf Null abgleichen. Inhalt der Teströhrchen vor der Messung durch Kippen gut mischen. Extinktionsbestimmung der Standards a-e sowie der Probe (Werte in umstehende Tabelle eintragen).

5 148 Auswertung: Graphische Ermittlung einer Eichkurve durch Auftragen der gemessenen Standard-Extinktionen (E a-e ) gegen die entsprechenden Standard-Konzentrationen (a-e): x-achse = Konzentration y-achse = Extinktion Probenkonzentration aus der experimentell ermittelten Eichkurve ablesen. Umrechnungsfaktor: µg/dl x = nmol/l Konzentration µg/dl Extinktion 405 nm a b c d e Probe Pat.1... Probe Pat.2... S S Wie kann gezeigt werden, dass die AG-AK-Bindung reversibel ist? Worin unterscheidet sich der Enzymimmuntest vom Radioimmuntest?

6 149 EXPERIMENT 9.2: Bestimmung von [Na + ] und [K + ] in Erythrozyten und Blutplasma mit dem Flammenphotometer Intra- und extrazelluläre Elektrolytkonzentrationen sind verschieden. Die Na +, K + -ATPase der Erythrozytenmembran pumpt gegen ein Konzentrationsgefälle Na + aus der Zelle heraus und K + in die Zelle hinein. Die ungleiche Verteilung von Na + und K + ist nur gewährleistet, solange die Zelle genügend ATP produziert. Von der Norm abweichende Na + - und K + -Konzentrationen im Plasma können bei verschiedenen Störungen auftreten (Krankheiten der Niere, des Verdauungstrakts, endokrine Störungen u.a.m.). Elektrolytkonzentrationen ausserhalb des relativ engen Normalbereichs können zu gefährlichen Komplikationen führen (z.b. von Seiten des Reizleitungssystems des Myokards). Die Plasmakonzentrationen von Na + und K + werden deshalb im klinischen Labor routinemässig bestimmt. Prinzip der Flammenphotometrie: Wird ein Gas genügend stark erhitzt, so kann ein Elektron aus einer inneren Elektronenschale in eine äussere, bei Normaltemperatur nicht besetzte Schale springen. Derart angeregte Elektronenzustände sind kurzlebig. Wenn das Elektron auf seine angestammte Schale zurückfällt, wird die freiwerdende Energie als Licht ausgestrahlt. Die Wellenlänge des ausgestrahlten Lichts charakterisiert das Element, die Intensität die Menge der angeregten Atome. Für Na + ist 8 = 589 nm und für K + ist 8 = 770 nm. Im Flammenphotometer wird die Lösung eines Gemisches von Metallionen in eine Flamme gesprüht. Die winzigen Tröpfchen verdampfen sofort und ein Teil der zu Atomen reduzierten Metallionen wird zur Emission von Licht angeregt. Das ausgestrahlte Licht wird mit Hilfe einer Linse konzentriert. Mit geeigneten Filtern wird das von einem einzelnen Element ausgestrahlte Licht herausgefiltert und in einer Photozelle in einen Strom umgewandelt. Der Galvanometerausschlag ist der Lichtintensität und damit der Ionenkonzentration proportional. Das Galvanometer hat eine Skala mit willkürlichen Einheiten von O bis 100. Es muss mit Lösungen bekannter Konzentration geeicht werden. Der Galvanometerausschlag ist in einem für das Gerät charakteristischen Bereich linear proportional zur Ionenkonzentration. In diesem Bereich genügen zur Eichung zwei Standardlösungen mit Konzentrationen über und unter der gesuchten Konzentration. Beispiel: Ablesung im Galvanometer: 35 = unbekannte K + -Konzentration 20 = 60 µm K + -Standard 40 = 120 µm K + -Standard Lineare Interpolation gibt 105 µm K + für die unbekannte Lösung. Im folgenden Experiment wird Frischblut in Plasma und Blutzellen getrennt. Das Blut enthält Natriumcitrat als Gerinnungshemmer, wodurch die Natriumkonzentration um 77 mm erhöht wird und die Resultate entsprechend zu korrigieren sind. Um die optimalen Messbereiche des Flammenphotometers zu erreichen, müssen Zellen und Plasma für die Bestimmung je 30 x und 600 x verdünnt werden.

7 150 Lösungen: 1) Frischblut, bereits zentrifugiert und in Plasma und gepackte Zellen getrennt. 2) Standardlösungen: Na 360 = 360 µm NaCl K 240 = 240 µm KCl Na 180 = 180 µm NaCl K 120 = 120 µm KCl Na 90 = 90 µm NaCl K 60 = 60 µm KCl 3) Waschlösungen für Erythrozyten: 97.2 mm MgCl 2, 2.5 mm Tris-Chlorid, ph Verdünnen des Plasmas: ml Plasma und 7.25 ml bidestilliertes Wasser in RG pipettieren, mischen (Parafilm, Daumen) = Plasma-30 und ml Plasma ml H 2 0 = Plasma Verdünnen der gewaschenen Zellen: - Aus zeitlichen Gründen sind die gepackten Erythrozyten mit isotoner MgCl 2 -Waschlösung 3 mal gewaschen. Genau 0.25 ml der gepackten Zellen mit einer 0.5 ml Glaspipette in ein RG mit 7.25 ml H 2 0 pipettieren. Pipette mehrmals aufsaugen und ausblasen, mischen = Zellen ml Zellen ml H 2 0 = Zellen Messung am Flammenphotometer: Die Messungen dürfen nicht selbständig, sondern nur im Beisein Assistierender oder Co- Assistierender ausgeführt werden! Einstellen, Justieren und Überwachen des Flammenphotometers ist Sache des Kurspersonals. Natriumfilter einrasten, mit Standard Na 180 das Galvanometer auf 40 Skalenteile einstellen. Messen in der Reihenfolge: Na 90, H 2 O, Na 180, H 2 O, Na 360, H 2 O, Plasma 900, H 2 O, Zellen 30, H 2 O, Detergens, H 2 O. Diese Reihe 3 x hintereinander durchmessen und Werte in Tabelle eintragen. Kaliumfilter einrasten, mit Standard K 120 das Galvanometer auf 40 Skalenteile einstellen. Messen in der Reihenfolge: K 60, H 2 O, K 120, H 2 O, K 240, H 2 O, Plasma 30, H 2 O, Zellen 600, H 2 O, Detergens, H 2 O. Diese Reihe 3 x hintereinander durchmessen und Werte in Tabelle eintragen. Nach dem Messen sofort wieder Wasser einsaugen. Das Gerät darf nicht länger als einige Sekunden "trocken laufen". Spülen mit Detergens ist nötig, um den Nebulisator sauber zu halten. Einmal verstopft, kann er kein Aerosol mehr erzeugen.

8 151 Natrium Messung Na 90 Na 180 Na 360 Plasma 900 Zellen Mittel: mm in Plasma und Zellen* * Berechnet durch Interpolation zwischen den beiden nächstliegenden Standardwerten. Die gemessene Natriumkonzentration wird durch das bei der Blutentnahme zugegebene Natriumcitrat um 77 mm erhöht und ist entsprechend zu korrigieren. Kalium Messung K 60 K 120 K 240 Plasma 30 Zellen Mittel: mm in Plasma und Zellen* * Berechnet durch Interpolation zwischen den beiden nächstliegenden Standardwerten. S Wie wird die Konzentration von Natriumionen und Kaliumionen im Plasma reguliert? S Die Na + -Konzentration im Plasma dient als ungefähres Mass der Plasma-Osmolarität. Weshalb? S Wie verändert sich die extrazelluläre K + -Konzentration, wenn das Citratblut während einigen Stunden aufbewahrt wird? S Wie gross sind die Na + /K + -Konzentrationen in der interstitiellen Flüssigkeit?

9 Die für die klinische Medizin sehr bedeutsame Na + /K + -Verteilung in die verschiedenen Körperflüssigkeitsräume soll für eine 70 kg schwere Person abgeschätzt werden. Das Gesamtkörperwasser beträgt beim Erwachsenen Mensch etwa 60% des Körpergewichtes (KG). Davon entfallen rund 2/3, also ca. 40% des KG, auf die intrazelluläre Flüssigkeit. Die extrazelluläre Flüssigkeit setzt sich aus der interstitiellen Flüssigkeit, rund 16% des KG, und aus der intravasalen Flüssigkeit (Plasma), rund 4% des KG, zusammen. Mit den gemessenen Na + -Konzentrationen soll in der unten stehenden Tabelle der Na + -Bestand in den verschiedenen Körperkompartimenten berechnet werden. Berücksichtigen Sie, dass die Elektrolyte in der interstitiellen Flüssigkeit im Gleichgewicht mit den Elektrolyten im Plasma stehen. Die K + - Konzentration ist in verschiedenen Zellen des Organismus leicht verschieden. Für die Berechnung des K + -Bestandes soll deshalb die durchschnittliche intrazelluläre K + -Konzentration von 120 mm verwendet werden. 152 Plasma Interstitielle Flüssigkeit Intrazelluläre Flüssigkeit Total Volumen (liter): [Na + ], mmol/l: Na + -Bestand: (mmol) [K + ], mmol/l: K + -Bestand: (mmol) [Ca 2+ ], mmol/l: [Mg 2+ ], mmol/l: [Eisen], mmol/l: unterschiedlich Da Na + im wesentlichen auf die extrazelluläre Flüssigkeit beschränkt ist, Wasser dagegen die Schranken zwischen den Körperflüssigkeiten passieren kann, und da der Körper immer bestrebt ist, die Iso-Osmolarität aufrecht zu erhalten, führen Störungen des Körper-Natriumbestandes immer zu einer Störung des extrazellulären Volumens (Ödem, Exsikkose = Austrocknung der Gewebe). Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass nur etwa... % des Körpergehaltes an K + (Wert von Tabelle berechnen und einfüllen) in der extrazellulären Flüssigkeit vorhanden ist. Die Bestimmung der K + - Konzentratiom im Plasma ist deshalb ein schlechtes Mass für den gesamt Körpergehalt an K +, denn er ist abhängig von der gesamten Zell- und Muskelmasse des Körpers. Änderungen des Plasmakaliums um 1 mm bedeuten eine Veränderung des K + -Bestandes von etwa 200 mmol. Bei Plasmawerten unter 3 mm muss der Kaliummangel durch Verabreichung von mmol K + pro Änderung der Plasmakonzentration von 1 mm ersetzt werden. Solche Überlegungen sind im klinischen Alltag wichtig für die parenterale Verabreichung und den Ersatz von Flüssigkeit, Elektrolyten und Nährstoffen. S Obwohl die Elektrolyte in der interstitiellen Flüssigkeit im Gleichgewicht stehen mit den Elektrolyten im Plasma, ist die Konzentration von Ca 2+, Mg 2+ und Eisen im Plasma höher als in der interstitiellen Flüssigkeit. Erklärung?

10 EXPERIMENT 9.3: Bindung von Testosteron an das Sexhormon-bindende Globulin im Plasma Im Plasma werden Androgene sowie mit etwas geringerer Affinität Östrogene zu mehr als 95 % an das Sexhormon-bindende Globulin (SHBG, auch Testosteron-Östrogen-bindendes Protein genannt) gebunden transportiert. Die Sexhormone werden mit wesentlich geringer Affinität auch an Albumin gebunden. Testosteron liegt nur zu etwa 2 % in freier Form vor. Das Sexhormon-bindende Globulin wird in der Leber gebildet. Seine Synthese wird durch Östrogene erhöht (Frauen weisen eine doppelt so hohe Plasmakonzentration des SHBG auf wie Männer) und durch Testosteron erniedrigt. Die Plasmakonzentration von SHBG steigt im Alter an und ist bei gewissen Lebererkrankungen (Leberzhirrose) und bei Überfunktion der Schilddrüse (Hyperparathyreoidismus, siehe Exp. 9.1) erhöht. Im Plasma werden ebenfalls Cortisol an ein spezifisches Corticosteroid-bindendes-Globulin (auch Transcortin genannt) und die Schilddrüsenhormone T3 und T4 ans Tyroxin-bindende-Globulin gebunden transportiert. Im Gegensatz zum Cortisol ist für Aldosteron kein Bindungsprotein im Plasma bekannt. 153 Prinzip: Radioaktiv markiertes Testosteron wird mit Humanplasma inkubiert. Anschliessend wird an Protein gebundenes Testosteron von freiem Testosteron mit Gelchromatographie getrennt. Moleküle werden dabei aufgrund ihrer unterschiedlichen Grösse getrennt. Das an Protein gebundene radioaktive Testosteron eluiert zuerst, das freie niedrigmolekulare Testosteron eluiert mit dem Salzvolumen der Säule. Säule: 30 x 0.9 cm gepackt mit Sephadex G-50. Lösungen: S Plasmaprobe (0.6 ml) S [ 3 H]-Testosteron in Ethanol (spezifische Aktivität 65 Ci/mmol) S Elutionspuffer: 50 mm Na-Phosphat ph 7 S Trichloressigsäure 50 % Ausführung (unter Anleitung der Assistierenden): 1. Inkubation: Zu 0.6 ml Plasma (im Probenröhrchen enthalten) 20 µl [ 3 H]-Testosteron zugeben, mischen und 20 min bei Zimmertemperatur stehenlassen. 2. Gelfiltration: - Hahn am Puffervorratsgefäss schliessen, Schliffstopfen oben von der Säule abnehmen und über dem Sephadex verbleibenden Puffer mit Pasteurpipette sorgfältig abheben.

11 - Mit einer Pasteurpipette die bereitgestellte Probe (0.5 ml) auftragen. - Quetschhahn am unten an der Säule angebrachten Schlauch öffnen und, sobald Probe bis zur Säulenoberfläche eingelaufen ist, wieder schliessen. - Zum Nachspülen ca. 0.2 ml Puffer auftragen und wie Probelösung einlaufen lassen. Quetschhahn wieder schliessen. - Sorgfältig mit Puffer bis zum Schliff auffüllen, Schliffstopfen aufsetzen und Hahn des Vorratsgefässes und Quetschhahn öffnen. Durchflussgeschwindigkeit durch vertikales Verschieben des Puffervorratsgefässes auf ungefähr 1 ml/min einstellen. Total 20 Fraktionen von etwa 1.5 ml mittels Fraktionensammler in Reagenzröhrchen auffangen (Fraktionensammler auf 5 min Sammelzeit einstellen). 3. Bestimmung der Radioaktivität: In der Kapelle von jeder Fraktion 0.3 ml in ein Zählfläschchen geben (nummeriert 1-20), mit 3 ml Szintillationslösung versetzen, schliessen und mischen. Jede Probe während 0.5 min im Szintillationszähler zählen. Probenpuffer als Blindwert verwenden.. Blindwert abziehen. Radioaktivität pro ml (cpm/ml) berechnen. 4. Identifizierung der Protein enthaltenden Fraktionen: In 20 beschriftete RG 0.5 ml Wasser vorlegen, je 0.3 ml von den Fraktionen 1 bis 20 sowie 0.2 ml Trichloressigsäure (50 %) zugeben und mischen. Das Ausmass der Fällung von Proteinen abschätzen, Werte (1 bis 4) für jedes Röhrchen vermerken und für die graphische Darstellung in die Auswertevorlage im bipweb eintragen. 5. Graphische Darstellung des Elutionsprofils: Für die graphische Darstellung Werte in die Auswertungsvorlage im bipweb eintragen. Es wird Radioaktivität (cpm/ml) sowie Proteinkonzentration gegen RG-Nummer aufgetragen. Anteil [ 3 H]-Testosteron abschätzen, der unter den verwendeten Bedingungen im Plasma an Protein gebunden ist. 154 S Wie liesse sich zeigen, ob das Sexhormon-bindende Globulin zur α-, β- oder γ-globulinfraktion des Plasmas gehört? S Die normale Testosteronkonzentration im Plasma liegt bei etwa 6 µg/liter (Bereich 3-10 µg/liter), wovon nur 2 % in freier Form vorliegen. Die Dissoziationskonstante des Sexhormon-bindenden Globulins für Testosteron beträgt ~2 x 10-9 M. Daraus lässt sich die Gesamtkonzentration des Sexhormon-bindenden Globulins berechnen. Wie gross ist sie etwa?