Fluorescence-Correlation-Spectroscopy (FCS)

Transkript

1 Fluorescence-Correlation-Spectroscopy ()

2 Überblick

3 Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie: Entwicklung in den 70er Jahren sehr empfindliche Methode ( sehr geringer Konzentrationen) deswegen sensible Komponenten nötig keine Streumethode aus der erhält man Diffusionskoeffizienten und Konzentrationen daraus auch: hydrodynamischer Radius

4 Fluoreszenz Fluoreszenz Label Diffusion Was ist Fluoreszenz? ein Molekül wird durch Licht in einen höheren elektron. Zustand angeregt Im angeregten el. Zustand regt sich das Molekül auf den Schwingungs- Grundzustand ab danach kehrt es wieder in den elektronischen Grundzustand zurück dabei nimmt es irgendeinen Rotationsbzw. Schwingungszustand ein Folge: breites Anregungsspektrum, breites Emissionsspektrum, λ Em > λ Exc S 1 angeregter Zustand S 0 Grundzustand Absorption Schwingungsrelaxation Fluoreszenz Fluorescein Spektrum, Quelle: Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy

5 fluoreszierendes Label Fluoreszenz Label Diffusion das zu messende Partikel muss fluoreszieren oft: Label (z.b. kovalent gebunden) Beispiele: Fluorescein, Rhodamine, Q-Dots, Alexa, Cyanine, Nilrot (Lösungsmittel-abhängig),... fluoreszierende Proteine (Green Fluorescent Protein)

6 Diffusion Fluoreszenz Label Diffusion Stokes-Einstein Gleichung: Diffusion einer Kugel in einem Medium Diffusionskoeffizient gegeben durch: D = k BT 6πηr Dynamik steht in Verbindung mit Partikelgröße T, η r Diffusion

7 Mikroskop Strahlengang Bauteile Herzstück der -Apparatur: konfokales Mikroskop Pinhole: geringe Schärfentiefe aber hohe Auflösung nur ein kleiner Teil der Probe wird untersucht Lasereinheit: 458, 488, 514, 543, 633nm Detektion durch APDs APDs Detektion, Pinhole, Filter LASER Ar +, HeNe Konfokal- Mikroskop, Probe Abbildung: Komponenten von Confocor 2

8 Strahlengang Mikroskop Strahlengang Bauteile durch konfokalen wird das Detektionsvolumen mit dem Laser beleuchtet den Strahlteiler passiert nur Licht mit größerer Wellenlänge als Laser fluoreszierendes Teilchen, das durchs Detektionsvolumen diffundiert, wird angeregt und emittiert Licht dieses wird zeitabhängig detektiert Excitation Objectiv Illuminated volume (laser profile) to detector Abbildung: Schema des Strahlengangs beam splitter

9 Bauteile Mikroskop Strahlengang Bauteile konfokaler nötig, um ein sehr kleines Volumen (d.h. nur wenige Partikel gleichzeitig) beobachten zu können Laser: nur wenig Fluoreszenzlicht gelangt zum Detektor, starke Anregung nötig. Durch die scharfe Wellenlänge kann gut zwischen Anregung und Emission unterschieden werden. verschiedene Wellenlängen für unterschiedliche Farbstoffe Avalanche Photo Diodes (APDs): schnelle Detektion notwendig (Bereich 1 µs), 2 APDs vorhanden für verschiedene Wellenlängenbereiche

10 Detektionsvolumen Detektionsvolumen Fit-Gleichung r xy nm, r z 6 r xy Volumen: 1 femtoliter es wird die Autokorrelation von der Fluoreszenzintensität im Detektionsvolumen bestimmt aus Form der beiden Volumina folgt für 3D-Diffusion die Fit-Gleichung: N [ ] 1 + T t 1 T e τ T 1 (1+ t τ ) 1+( r 0 z0 ) 2 t τ Abbildung: Ausgeleuchteter Bereich und Detektionsvol. in der Probe mit: N: Anzahl der Partikel im Det-Vol, T : Triplett-Anteil, τ T : Triplett-Zeit, τ: Diff.-Zeit, r 0 z0 : Dimensionen des Det.-Vol.

11 Fit-Gleichung Detektionsvolumen Fit-Gleichung 1+ 1 N [ ] 1 + T t 1 T e τ T 1 (1+ t τ ) 1+( r 0 z0 ) 2 t τ viele Farbstoffe zeigen einen Triplett Abfall (einige µs), muss oft mit berücksichtigt werden diffusionsbedingter Teil der Autokorrelationsfunktion Anzeil der Teilchen pro Volumen Konzentration Die Diffusionskonstante ergibt sich aus: D = r τ G (t) M e s s d a te n S u lfo rh o d a m in G 1 0 E -8 A u to k o rre la tio n -F it D iffu s io n s z e it: c a. 3 5 µs 0, E 7 1 E 9 t in µs

12 ... ein Beispiel Beispiel Eichen Voraussetzung Datenverarbeitung Ort autocorrelation e+04 1e Daten (Fluorescein) ohne Triplett-Abfall τ=25 μs mit Triplett-Abfall τ=37 μs ohne Triplett Abfall ab 10 μs, τ=36 μs e+04 1e+05 t [μs] Autokorrelationskurve von Fluorescein Fits mit und ohne Triplett-Anteil: Resultierende Diffusionszeiten unterscheiden sich

13 Eichen Beispiel Eichen Voraussetzung Datenverarbeitung Ort Die Größe des Detektionsvolumens kann sich mit der Zeit ändern (Temperatur, Spiegel-, Linsen, Fasereinstellungen). Deswegen: Eichung durch Farbstoff mit bekanntem Diffusionskoeffizienten. Vorgehen: des Farbstoffs Fit ergibt τ und r 0 z 0 aus bekanntem D folgt r 0 (wegen D = r τ ) somit kann auch z 0 bestimmt werden

14 Was brauche ich? Beispiel Eichen Voraussetzung Datenverarbeitung Ort flüssige, fluoreszierende Probe (Volumen min. 0,1 ml) Lösungsmittel: am besten Wasser (wegen Brechungsindex), organisch auch möglich geeignete Konzentration des fluoreszierenden Partikels: 10 6 mol mol l l möglichst wenige verschiedene fluoreszierende Komponenten (Verunreinigungen oft auch ein Problem) Probe vorher evtl. mit einem Fluoreszenzspektrometer vermessen (Anregung/Emission)

15 Wie werte ich aus? Beispiel Eichen Voraussetzung Datenverarbeitung Ort Systemspezifisch: Welche Diffusion, 2D/3D? Triplett-Abfall? wie viele Komponenten? passt die Konzentration des Labels? (Höhe der Autokorrelation, je höher, desto besser aber weniger Signal) Diese Punkte entscheiden über die zu verwendende Fit-Formel. Vom Confocor2 erhält man schon die autokorrelierten Messdaten.

16 Wo steht die? Beispiel Eichen Voraussetzung Datenverarbeitung Ort früher: PCI bzw. PCII jetzt: EPI (Prof. Weiss) im NWI auch vorhanden: Leica SP5 (, FRET, FLIM, LSM)