Instrumentelle Methoden Teil 2: Kapillarelektrophorese

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1 Instrumentelle Methoden Teil 2: Kapillarelektrophorese

2 Gliederung Prinzip Gerätetechnik Kapillaren Injektionsmethoden Detektionsmethoden Kapillarelektrophoretische Modi Beispielgerät

3 Prinzip der Kapillarelektrophorese Kapillarelektrophorese: Trägerfrei in einem offenen Rohr (Kapillare) CE (capillary( electrophoresis) Kapillarlängen: cm Innendurchmesser der Kapillare: µm cm µm

4 Prinzip der Kapillarelektrophorese Trennmedien: Wäßrige Puffersysteme Stromtransport, konstanter ph-wert Beispiele: Phosphat- und Citratpuffer bei saurem ph Borat- und TRIS-Puffer bei basichen ph Auch zwitterionische Puffer Trennung bei elektrischer Feldstärke von mehreren hundert V/cm Resultierender Strom ist gering (im Bereich von 100 µa) Detektion: on-column UV-Absorption direkt durch die transparente Kapillare

5 fused-silica Silica-Kapillare Hochspannungs- versorgung 2 Elektroden Pufferreservoirs On-Column Column-Detektor Moderne Geräte: Probengeber Fraktionssammler Hydrodynamischen Injektionssystem Kapillarthermo- statisierungseinheit Gerätetechnik

6 Kapillaren UV transparente Materialien: fused-silica amorpher Quarz Borsilikatglas Teflon Geringer Durchmesser: Effiziente WärmeableitungW Mechanische Stabilität: t: Außenoberfl enoberfläche der Kapillare mit Polyimidschicht geschützt Entfernen für f Detektion nötig (Skalpell oder Flamme)

7 Hydrodynamische Injektion Vakuum auf der Detektionsseite Druck auf der Einlassseite Gravitationskraft durch Anheben der Einlassseite Elektrokinetische Injektion Injektionsmethoden

8 Injektionsmethoden Trenneffizienz der Kapillarelektrophorese Geringes Injektionsvolumen keine Bandenverbreiterung Gesamtvolumen der Kapillare wenige µl Probenvolumen einige nl Reproduzierbare Injektionsvolumina wichtig Routineanalytik Probenvolumen V i bei der hydrodynamischen Injektion V i = 4 p Π r 8 η L t Abhängig von: Druckdifferenz p, Injektionszeit t, Kapillarlänge L, Viskosität η,, Kapillarradius r

9 Injektionsmethoden Elektrokinetische Injektion Aufgebrachtes Probenmenge nimmt mit der Mobilität der Proben-Ionen zu Injizierte Probenmenge hängt von der Probenmatrix ab Hydrodynamische Injektion Unhabhängig ngig von der Mobilität t der Probenmatrix Electrode Electrode

10 Detektionsmethoden Absorptions-Detektor I Lambert-Beersche Beersche-Gesetz = log = ε c I UV-Detektor Diodenarray-Detektor Detektor (DAD) Photodiodenarray-Detektor (PDA) Empfindlichkeit: mol Anwendungen: Proteine, aromatische Verbindungen 0 A d Indirekte UV-Detektion (Proben ohne Absorption im UV-Bereich) Puffer + Elektrolyt mit UV-Absorption Negatives Signal Empfindlichkeit: mol Anwendungen: Organische und anorganische Ionen, Zucker UV-Detektion Detektorzelle Kapillare Negatives Signal

11 Fluoreszenz-Detektor Detektionsmethoden Molekülanregung lanregung Abgabe der Anregungsenergie durch spontane Emission (Fluoreszenz) Signalintensität ist direkt proportional der Intensität der eingestrahlten Anregungsenergie Lampenanregung: Empfindlichkeit: mol Anwendungen: derivatisierte Aminosäuren, DNA, Peptide, Protein Laserinduzierte Fluoreszenz: Hohe Empfindlichkeit: mol Anwendungen: DNA-Fragmente, derivatisierte Aminosäuren Kapillare Fluoreszenz

12 Detektionsmethoden Massenspektrometrie-Detektor Empfindlichkeit: mol Anwendungen: Proteine, Peptide, drug-monitoring z.b. ESI-MS (Electrospray( Ionization)

13 Detektionsmethoden Eingesetzt werden auch: Leitfähigkeitsdetektor Elektrochemischer Detektor Brechungsindexdetektor Detektor für Radioisotope

14 Elektrophoretische Wanderung Zunehmende Spannung und damit wachsende Feld- stärke E führt zu Erhöhung der elektrophoretischen Wanderungsgeschwindigkeit v EPH der Ionen LEFF v EPH = µ EPH E = t Elektrophoretische Mobilität µ EPH, effektive Kapillarlänge L EFF Migrationszeit t M Wanderndes Ion im elektrischen Feld unterliegt Kräftegleichgewicht + K R E +z M K B - EFF, K R = Reibungskraft K B = Beschleunigungskraft v EPH

15 Elektrophoretische Wanderung Beschleunigungskraft KB K B = z F E N A Reibungskraft KR (Stokesches( Gesetz K R = 6 π η r v Wanderungsgeschwindigkeit: v EPH = z F E 6 π η r N A z = effektive Ladung des Ions F = Faraday-Konstante N A = Avogadrozahl η = dynamische Viskosität r = Stokescher Radius des Ions Für die elektrophoretische Mobilität µeph ergibt sich damit: µ EPH = 6 z F π η r N A

16 Elektrophoretische Wanderung Anlegen von Spannung (10 bis 30 kv) Trennung aufgrund verschiedener Wanderungsgeschwindigkeiten der Probe im Trennpuffer Berechnung der Mobilität µ EPH im elektrischen Feld E µ EPH = L t M EFF E L U Elektrisches Feld fällt f über gesamte Länge L der Kapillare ab (L GES Moleküle durchwandern aber nur effektive Länge L (L EFF ) (bis zum Detektor) in der Migrationszeit (t M ) = L EFF t M GES GES ) Elektrophoretische Trennungen nur möglich m bei unterschiedlicher Mobilität t der Ionen

17 Elektroosmotischer Fluss (EOF) Negativ geladene Kapillarwand (fused( silica) Hydratisierte Kationen akkumulieren nahe der Kapillarwand Elektroosmotischen Fluß (EOF) in Richtung der Kathode bei Anlegen eines elektrischen Feldes

18 Elektroosmotischer Fluss (EOF) Trennungsprinzip Interaktionen der Analyten mit dem EOF Kationen wandern zur Kathode (negativer Pol) Anionen wandern zu Anode (positiver Pol)

19 Elektroosmotischer Fluss (EOF) Unbehandelte Kapillaren (uncoated( uncoated) Elektrophoretische Geschwindigkeit Zusätzlich: Elektroosmotischer Fluss (EOF) Gesamtgeschwindigkeit: Vektorielle Summe aus elektrophoretischer (v EPH ) und elektroosmotischer (v( EOF )Geschwindigkeit Diffuse Doppelschicht Zeta-Potenital

20 Elektroosmotischer Fluss (EOF) Ladungsunterschiede an der Innenseite der Kapillare (diffuse Doppelschicht) resultieren in Zeta- Potential (ζ) Zeta-Potential und damit der EOF ist abhängig von der Dissoziation der Silanolgruppen und dadurch vom ph- Wert der Elektrolytlösung Basischer ph EOF höher h her als Wanderungsgeschwindigkeit der Ionen Auch Anionen werden durch den EOF zur Kathode transportiert Saurer ph EOF geringer als Wanderungsgeschwindigkeit der Ionen

21 Elektroosmotischer Fluss (EOF) Flussprofil des EOF ist stempelförmigen Bei konstantem Fluss trägt der EOF nicht zu Peakverbreiterung bei Wanderungsgeschwindigkeit (v( EOF ) des EOF: ε E ζ v EOF = 4 π η Dielektrizitätskonstante tskonstante ε, Zeta-Potential ζ,, Viskosität η

22 Elektrischer Stromfluß Elektrischer Stromfluss führt f zu Joulescher Wärmeentwicklung Wärmeabfuhr nur über Kapillarwand resultierender Temperaturgradient Maximale Trenneffizienz kleiner Temperaturgradient Verringerung Kapillarinnendurchmesser Flüssigk ssigkühlung der Kapillare Temperaturgradient verursacht Viskositätsgradienten tsgradienten Auswirkung aufs Flussprofil Langsamere Wanderung im Bereich hoher Viskosität (Kapillarwand) Schnellere Wanderung im Bereich geringer Viskosität (Kapillarmitte)

23 Kapillarzonenelektrophorese (CZE) Trennung nach Unterschied in Größe und Ladung Zunächst wird die Probe (AB) in die Kapillare injiziert Unter Einfluss des elektrischen Feldes wird die Probe in diskrete Zonen (A und B) unterteilt, die ihrerseits Analyten mit der gleichen elektrophoretische Mobilität enthalten Puffer, ph-wert, elektrische Feldstärke bleiben konstant

24 Kapillarzonenelektrophorese (CZE)

25 Peakverbreiterung Peakverbreiterung Verursachung durch longitudinale Diffusion Eingangsprofil sei unendlich schmal örtliche Varianz der Konzentrationsverteilung durch die Einstein- Gleichung bestimmt 2 σ = 2 D t z 2 σ z Diffusionskoeffizient D; Zeit t Varianz und damit mit Peakverbreiterung nimmt mit der Zeit t zu

26 Peakshape Elektrodispersion zusätzlicher Peakverbreiterung Elektrische Feldstärke nicht in gesamter Trennkapillare konstant gestört durch lokale Leitfähigkeitsunterschiede Mobilität t von Analyt-Ion und Puffer-Ion nicht ähnlich Konzentration Puffer-Ion ist nicht sehr viel größ ößer als Analyt- Ion (> Faktor 100) Mobilität t des Proben-Ion ua < Puffer-Ion uce Peak-Tailing ua > uce Peak-Leading (Fronting)

27 Auflösung R zweier Peaks Auflösung Migrationszeiten t 1 und t 2 zweier aufeinanderfolgender Peaks; gemittelte Standardabweichung σ t R t Einsetzen der entsprechenden Beziehungen liefert: = = N 4 Theoretische Trennstufen N, Mobilität u 2 t 4 σ t 1 u u 2 1 R u

28 Puffersystem Anforderungen an den Puffer Selektivität t für f r die zu trennenden Ionen ph-wertstabilit Wertstabilität,, Pufferkapazität t (Reproduzierbarkeit) Geringe UV-Absorption bei der Detektionswellenlänge nge Anpassung der Mobilität t zwischen Probe- und Pufferion Das Gegenion sollte eine geringe Mobilität t besitzen (kleine Ströme) Reproduzierbare Herstellung des Puffers Stabilität t des Puffers

29 Optimierung Trennungsoptimierung Variation folgender Parameter: ph-wert Ionenstärke Temperatur Kapillarbelegung Pufferzusätze

30 Elektropherogramm

31 Kapillaraffinitätselektrophorese (CAE) Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen einem Rezeptor und Liganden Bestimmung von Bindungskonstanten und -stöchiometrie Unterschied in der Mobilität t zwischen Protein und dem gebildeten Komplex Ligand trägt eine Ladung Molekulargewicht des Komplexes unterscheidet sich wesentlich von der des Proteins

32 Micellarelektrokinetische Chromatographie MEKC Hybridtechnik aus Elektrophorese und Chromatographie Zusatz von Micellenbildnern (Detergenzien)) zum Puffersystem pseudostationäre Phase aus geladenen Micellen Trennung basierend auf Verteilung der Analyte zwischen Lösung und Micelleninneren

33 Elektropherogramm Neutralmoleküle le erhalten elektrophoretische Mobilität t u i u i ' ki 1+ k = umc ' i Abhängig von Mobilität t der Micelle u MC und dem Kapazitätsfaktor tsfaktor k i Kapazitätsfaktor tsfaktor k i ist Verhältnis der Analytaufenthalts- zeit in der mobilen zur pseudostationären Phase k ' i = t o t i 1 t 0 t t i MC

34 Elektropherogramm Auflösung R zweier Komponenten R = N { 4 Effizienz α α Selektivität t0 1 ' k 2 tmc ' 1+ k t 2 0 ' 1+ k1 tmc Re tention Verbesserung der Auflösung durch: Steigende Micellbildnerkonzentration Vergröß ößerung des Zeitfensters des Migrationsbereichs Wahl unterschiedlicher Micellbildner Änderung in der Zusammensetzung der wässrigen w Phase

35 Kapillargelelektrophorese (CGE) Trennung nach unterschiedlichen Masse/Ladungsverhältnissen DNA-Moleküe und SDS-denaturierte Proteine besitzen bei unterschiedlichen Massen sehr ähnliche Masse/ Ladungsverhältnissen Gelmedium bewirkt einen Siebeffekt und behindert die elektrophoretische Wanderung der größeren Moleküle stärker als die der kleineren Vergleich mit klassischen Gelelektrophorese Vorteile Schnellere Trennzeiten Online-Detektion Geringer Arbeits- und Geräteaufwand Nachteile Keine präparative Probensammlung Keine parallele Trennung mehrerer Proben Nicht zweidimensional durchführbar

36 Isoelektrische Fokussierung (CIEF) Trennung der Analyten nach ihrem isoelektrischen Punkt Injektion der Probe in einem Ampholytgemisch in die Kapillare Eine starke Säure wird an der Anode platziert (Anolyt( Anolyt), eine starke Base dient als Kathodenpuffer (Katholyt( Katholyt). Anlegen der Spannung ph-gradient Ampholyt- Ionen wandern entsprechend ihrem pi. Bei pi = ph endet die elektrophoretische Wanderung. Anode + Diffusion E-Feld Kathode + Ladung des - - Verd. H 3 PO 4 Analytmoleküls ph = pi ph-gradient Verd. NaOH

37 Isotachophorese (ITP) Trennung nach Größe und Ladung Zwei Elektrolyte: Leitelektrolyt (LE) und Endelektrolyt (TE) Mobilität t Leitelektrolyt > Mobilität t aller Analyt-Ionen Mobilität t Endelektrolyt < Mobilität t aller Analyt-Ionen Anlegen konstanten Stroms Bildung eines Feldstärken rken- gradients Probenaufgabe der Proben-Ionen (A, B) an der Grenzfläche der beiden Elektrolyte Feldstärkengradient verhindert Diffusion scharfer Zonengrenzen

38 Gerät schematisch

39 Beckmann PACE

40 Quellen F. Lottspeich/H. Zorbas,, Bioanalytik H.Engelhardt, W.Beck,, T. Schmitt, Kapillarelektrophorese Altria,, Kevin; Oliver J. Schmitz; P.W. Atkins, Physikalische Chemie

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