Foodstuffs Determination of vitamin B6 by HPLC. Produits alimentaires Détermination de la vitamine B6 par CLHP

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1 VORNORM ÖNORM ENV Ausgabe: Normengruppe N Ident (IDT) mit ENV 14164:2002 ICS Lebensmittel Bestimmung von Vitamin B6 mit HPLC Foodstuffs Determination of vitamin B6 by HPLC Produits alimentaires Détermination de la vitamine B6 par CLHP Die Europäische Vornorm ENV hat den Status einer Österreichischen Vornorm. Die VORNORM ÖNORM ENV besteht aus diesem nationalen Deckblatt sowie der offiziellen deutschsprachigen Fassung der ENV 14164:2002. Medieninhaber und Hersteller: Österreichisches Normungsinstitut, 1020 Wien Copyright ON Alle Rechte vorbehalten; Nachdruck oder Vervielfältigung, Aufnahme auf oder in sonstige Medien oder Datenträger nur mit Zustimmung des ON gestattet! Verkauf von in- und ausländischen Normen und technischen Regelwerken durch: Österreichisches Normungsinstitut (ON), Heinestraße 38, A-1020 Wien Tel.: (+43 1) , Fax: (+43 1) , sales@on-norm.at, Internet: Fortsetzung VORNORM ÖNORM ENV Seite 2 und ENV Seiten 1 bis 12 Fachnormenausschuss 205 Lebensmitteluntersuchungsverfahren Preisgruppe 12

2 Seite 2 VORNORM ÖNORM ENV Nationales Vorwort Diese ÖNORM wurde als Vornorm herausgegeben, weil die europäische Entwicklung auf diesem Fachgebiet noch in Fluss ist und weitere praktische Erfahrungen abgewartet werden sollen. Es wird gebeten, Erfahrungen und Vorschläge schriftlich dem Österreichischen Normungsinstitut mitzuteilen.

3 EUROPÄISCHE VORNORM EUROPEAN PRESTANDARD PRÉNORME EUROPÉENNE ENV Februar 2002 ICS Deutsche Fassung Lebensmittel - Bestimmung von Vitamin B6 mit HPLC Foodstuffs - Determination of vitamin B6 by HPLC Produits alimentaires - Détermination de la vitamine B6 par CLHP Diese Europäische Vornorm (ENV) wurde vom CEN am 15.November 2001 als eine künftige Norm zur vorläufigen Anwendung angenommen. Die Gültigkeitsdauer dieser ENV ist zunächst auf drei Jahre begrenzt. Nach zwei Jahren werden die Mitglieder des CEN gebeten, ihre Stellungnahmen abzugeben, insbesondere über die Frage, ob die ENV in eine Europäische Norm umgewandelt werden kann. Die CEN Mitglieder sind verpflichtet, das Vorhandensein dieser ENV in der gleichen Weise wie bei einer EN anzukündigen und die ENV auf nationaler Ebene unverzüglich in geeigneter Weise verfügbar zu machen. Es ist zulässig, entgegenstehende nationale Normen bis zur Entscheidung über eine mögliche Umwandlung der ENV in eine EN (parallel zur ENV) beizubehalten. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Dänemark, Deutschland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, Österreich, Portugal, Schweden, Schweiz, Spanien, der Tschechischen Republik und dem Vereinigten Königreich. EUROPÄISCHES KOMITEE FÜR NORMUNG EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMITÉ EUROPÉEN DE NORMALISATION Management-Zentrum: rue de Stassart, CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten. B-1050 Brüssel Ref. Nr. ENV 14164:2002 D

4 Vorwort Dieses Dokument wurde vom CEN /TC 275 Lebensmittelanalytik Horizontale Verfahren erarbeitet. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschäftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Länder gehalten, diese Europäische Norm bekanntzugeben: Belgien, Dänemark, Deutschland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Luxemburg, Niederlande, Norwegen, Österreich, Portugal, Schweden, Schweiz, Spanien, die Tschechische Republik und das Vereinigte Königreich. Diese Europäische Vornorm wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittelanalytik Horizontale Verfahren erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN geführt wird. Die Anhänge A, B, C und D sind informativ. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschäftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Länder gehalten, diese Europäische Vornorm bekanntzugeben: Belgien, Dänemark, Deutschland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Luxemburg, Niederlande, Norwegen, Österreich, Portugal, Schweden, Schweiz, Spanien, die Tschechische Republik und das Vereinigte Königreich. 2

5 1 Anwendungsbereich Diese Europäische Vornorm legt ein Verfahren zur Bestimmung von Vitamin B 6 in Lebensmitteln mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) fest. Vitamin B 6 ist der Massenanteil der Gesamtmenge an Pyridoxin, Pyridoxal und Pyridoxamin einschließlich ihrer phosphorylierten Derivate, die als Pyridoxin bestimmt werden. Die β-glycosilierten Formen werden nicht berücksichtigt. 2 Normative Verweisungen Diese Europäische Vornorm enthält durch datierte oder undatierte Verweisungen Festlegungen aus anderen Publikationen. Diese normativen Verweisungen sind an den jeweiligen Stellen im Text zitiert, und die Publikationen sind nachstehend aufgeführt. Bei datierten Verweisungen gehören spätere Änderungen oder Überarbeitungen nur zu dieser Europäischen Vornorm, falls sie durch Änderung oder Überarbeitung eingearbeitet sind. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe der in Bezug genommenen Publikation (einschließlich Änderungen). EN ISO 3696, Wasser für analytische Zwecke - Anforderungen und Prüfungen (ISO 3696:1987). 3 Kurzbeschreibung Pyridoxal, Pyridoxamin und Pyridoxin werden durch saure Hydrolyse aus Lebensmitteln extrahiert und anschließend enzymatisch mit saurer Phosphatase dephosphoryliert. Bei der Reaktion mit Glyoxylsäure in Gegenwart von Fe 2+ als Katalysator wird Pyridoxamin zu Pyridoxal umgewandelt, das dann unter Einwirkung von Natriumborhydrid im basischen Medium zu Pyridoxin reduziert wird. Pyridoxin wird dann quantitativ in der Probenlösung durch HPLC mit Fluoreszenzdetektion bestimmt [1], [2]. Es ist auch möglich, Pyrodoxin, Pyridoxal und Pyridoxamin einzeln quantitativ zu bestimmen und die verschiedenen ermittelten Gehalte zu summieren. In diesem Fall sind alle Risiken von Störungen mit der Matrix zu verifizieren und die analytischen Bedingungen anzupassen. Dieses Verfahren wird in dieser Vornorm nicht beschrieben, weil es nicht validiert worden ist. Die angepassten Bedingungen sind in den Literaturhinweisen [1] bis [4] zu finden. 4 Chemikalien 4.1 Allgemeines Falls nicht anders angegeben, werden bei der Analyse nur analysenreine Chemikalien und Wasser von mindestens Qualität 1 nach EN ISO 3696 oder doppelt destilliertes Wasser verwendet. 4.2 Reagenzien und Lösungen Saure Phosphatase, aus Kartoffel (sie kann von Boehringer 1) bezogen werden). Enzymaktivität: 2 U/mg Natriumacetat Trihydrat, Massenanteil w(ch 3 COONa 3H 2 O) 99,0 % Eisessig, w(ch 3 COOH) 99,8 % Glyoxylsäure, w(c 2 H 2 O 3 H 2 O) 97,0 % Eisen(II)-sulfat Heptahydrat, w(feso 4 7H 2 O) 99,5 % 1) Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Norm und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produkts durch CEN. Gleichwertige Produkte dürfen verwendet werden, wenn sie nachweisbar zu identischen Ergebnissen führen. 3

6 4.2.6 Natriumhydroxid, w(naoh) 98,0 % Natriumborhydrid, w(nabh 4 ) 97,0 % Kaliumdihydrogenphosphat, w(kh 2 PO 4 ) 99,0 % Orthophosphorsäure, w(h 3 PO 4 ) 84,0 % Natriumoktansulfonat, w(c 8 H 17 NaO 3 S) 98,0 % oder Natriumheptansulfonat, w(c 7 H 15 NaO 3 S) 98,0 % Acetonitril (HPLC-Reinheitsgrad), w(c 2 H 3 N) 99,8 % Natriumacetat-Lösung, Stoffmengenkonzentration c(ch 3 COONa 3H 2 O) = 2,5 mol/l 170,1 g Natriumacetat-Trihydrat (4.2.2) werden in 500 ml Wasser gelöst Natriumacetat-Lösung, c(ch 3 COONa 3H 2 O) = 0,05 mol/l (ph 4,5) 6,8 g Natriumacetat-Trihydrat (4.2.2) werden in 1 l Wasser gelöst. Der ph-wert wird mit Eisessig (4.2.3) auf ph = 4,5 eingestellt Eisensulfat-Lösung, c(feso 4 7H 2 O) = 0,0132 mol/l 36,6 mg Eisen(II)-sulfat-Heptahydrat (4.2.5) werden in 10 ml Natriumacetat-Lösung (4.2.13) gelöst Natriumhydroxid-Lösung, c(naoh) = 0,2 mol/l 800 mg Natriumhydroxid (4.2.6) werden in 100 ml Wasser gelöst Natriumborhydrid-Lösung, c(nabh 4 ) = 0,1 mol/l 378 mg Natriumborhydrid (4.2.7) werden in 100 ml Natriumhydroxid-Lösung (4.2.15) gelöst Glyoxylsäure-Lösung, c(c 2 H 2 O 3 H 2 O) = 1 mol/l (ph 4,5) 4,7 g Glyoxylsäure-Monohydrat (4.2.4) werden in 30 ml Natriumacetat-Lösung (4.2.12) gelöst. Der ph-wert wird mit Natriumacetat-Lösung auf 4,5 eingestellt, und die Lösung wird in einem Messkolben mit Wasser auf 50 ml aufgefüllt Salzsäure, c(hcl) = 0,1 mol/l Mobile Phase für HPLC 940 ml Wasser, 40 ml Acetonitril (4.2.11), 160 mg Natriumoktansulfonat oder Natriumheptansulfonat (4.2.10) und 6,8 g Kaliumdihydrogenphosphat (4.2.8) werden in ein Becherglas gegeben. Nach dem Schütteln wird der ph-wert mit Orthophosphorsäure (4.2.9) auf 2,5 eingestellt. Die Lösung wird in einen 1-l-Messkolben überführt und bis zur Marke mit Wasser aufgefüllt. Die Lösung wird durch einen Filter mit einer Porenweite von 0,45 µm filtriert. 4.3 Vitamin B 6 -Standardsubstanz Pyridoxinhydrochlorid, w(c 8 H 11 NO 3 HCl) 99 % 4

7 4.4 Stammlösung Vitamin B 6 -Stammlösung, Massenkonzentration ρ(c 8 H 11 NO 3 HCl) 0,5 mg/ml Eine präzise abgewogene Menge der Vitamin-B 6 -Standardsubstanz (4.3), z. B. ungefähr 50 mg, wird in einem festgelegten Volumen, z. B. 100 ml, Wasser gelöst. Die Stammlösung ist bei Lagerung bei 4 C im Dunkeln 4 Wochen haltbar Überprüfung der Konzentration 0,5 ml Vitamin B 6 -Stammlösung (4.4.1) wird mit 0,1 mol/l Salzsäure (4.2.18) auf 20 ml verdünnt, und dann wird die Extinktion in einer 1-cm-Küvette mit einem UV-Spektralphotometer (5.2) bei 290 nm gegen Salzsäure (0,1 mol/l) gemessen. Die Massenkonzentration ρ der Stammlösung, in Mikrogramm je Milliliter, wird nach Gleichung (1) berechnet. ρ = A M 8,6 w F (1) Dabei ist: A Absorptionswert der Lösung bei 290 nm; M w die Molmasse der Vitamin B 6 -Standardsubstanz, in Gramm je Mol; F der Verdünnungsfaktor, d. h. 40; 8,6 der molare Extinktionskoeffizient ε von Pyridoxinhydrochlorid in 0,1 mol/l Salzsäure bei 290 nm [4], [5], in mmol -1 cm -1. Weitere Informationen über molare Extinktionskoeffizienten in anderen Lösungen als 0,1 mol/l Salzsäure (ph ~ 1) sind in Anhang D angegeben. 4.5 Standardlösungen Intermediäre Vitamin B 6 -Standardlösung, ρ(c 8 H 11 NO 3 HCl) 10 µg/ml 1 ml der Vitamin-B 6 -Stammlösung (4.4.1) wird in einen 50-ml-Messkolben pipettiert und bis zur Marke mit Wasser aufgefüllt. Diese Lösung wird an jedem Analysentag hergestellt Vitamin B 6 -Standardmesslösungen für die HPLC, ρ(c 8 H 11 NO 3 HCl)~0,1µg/ml bis 1µg/ml Unter Verwendung der intermediären Vitamin B 6 -Standardlösung (4.5.1) wird eine Reihe von geeigneten Standardlösungen mit Konzentrationen im Bereich von z. B. 0,1 µg/ml bis 1 µg/ml Pyridoxinchlorid hergestellt. Diese Lösungen werden an jedem Analysentag hergestellt. 5 Geräte 5.1 Allgemeines Die üblichen Laborgeräte, Laborglasgeräte und folgende: 5.2 UV-Spektralphotometer Geeignet zur Messung der Extinktion bei vorgegebenen Wellenlängen. 5