SDS-PAGE und Western Blotting

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1 1 Enzymaktivierung und Pathogenabwehr Praktikumsabschnitt zum Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen WS 09/19 SDS-PAGE und Western Blotting Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese in der Gegenwart von SDS (SDS-PAGE) und Western Blotting sind Techniken, die dem selektiven Nachweis bestimmter Zielpolypeptide in oft sehr heterogenen Proteinextrakten dienen. Die Polypeptide eines komplexen Proteingemisches werden durch SDS-PAGE in einem Gel mit definierten Porengrößen nach ihren Molekulargewichten aufgetrennt. Die Polypeptide werden dann elektrophoretisch auf eine Membran übertragen ("geblottet"), und die auf der Membran gesuchten Polypeptide werden immunchemisch nachgewiesen. Der Begriff "Western" blotting wurde spielerisch in Anlehnung auf die Benennung einer analogen Technik abgeleitet, die von Edwin Southern 1975 entwickelt wurde. DNA-Fragmente eines Extrakts werden durch Agarose-Elektrophorese aufgetrennt und auf eine Membran geblottet. Die Ziel-DNA wird dann auf der Membran mit der entsprechenden markierten cdna selektiv nachgewiesen. In Anlehnung an das "Southern" Blotting entstanden die Begriffe "Northern" Blotting (elektrophoretische Auftrennung von mrna, Blotting und selektiver mrna Nachweis mit markierter cdna) und das hier aufzuführende "Western" Blotting. SDS-PAGE Hier werden alle Polypeptide eines Proteinextrakts durch Erhitzung mit dem Detergenz Na-Dodecylsulfat (SDS) unter stark reduzierenden Bedingungen entfaltet und mit einer einheitlichen, negativen Ladung überzogen. Bei der nachfolgenden Elektrophorese im Polyacrylamidgel (ebenfalls in Gegenwart von SDS) entfallen somit die sonst wirksamen Einflüsse von Gestalt und Ladung der Polypeptide auf das elektrophoretische Wanderungsverhalten die Wanderungsgeschwindigkeit der Polypeptide erfolgt ausschließlich nach dem Molekulargewicht. Die Lage der aufgetrennten Polypeptide nach der Elektrophorese kann durch Anfärbung mit verschiedenen Farbstoffen visualisiert werden. Die Elektrophorese erfolgt im Praktikum in vertikaler Richtung in einem Minisystem der Firma Biometra. Das Polyacrylamidgel wird zwischen zwei Glasplatten gegossen und besteht aus zwei Schichten mit unterschiedlicher Porenstruktur und unterschiedlichem ph-wert. Die negative geladenen Polypeptide werden zuerst in einem auf der Anodenseite befindlichen oberen, weitporigen "Sammelgel" zu einer schmalen Bande aufkonzentriert. Anschließend passieren sie ein auf der Kathodenseite befindliches unteres, engerporiges "Trenngel", in dem die Auftrennung der Polypeptide von diesem schmalen Band ausgehend nach der Größe erfolgt. Herstellung der Gele: Im Folgenden wird die Prozedur für die Herstellung eines Gels beschrieben:

2 2 Zuerst wird die Gelkammer zusammengebaut (Anweisung durch die Praktikumsassistenz). Eine Markierung 0,5 cm unterhalb der zu bildenden Geltaschen wird mit Filzschreiber angebracht. Dann wird das Trenngel gegossen. Die folgenden Komponenten werden in einem 50 ml Erlenmeyerkolben gemischt: 2,0 ml Acrylamid/Methylenbisacrylamid (30% / 0,8%) 1,5 ml 1,5 M Tris/HCl (ph 8,8) 2,4 ml H 2 O bidest 60 µl 10% (w/v) SDS 30 µl 11% (w/v) Ammoniumpersulfat (frisch ansetzen!) Die Polymerisierung des Gels wird durch die Zugabe und Untermischung von: 10 µl TEMED eingeleitet. Die gemischte Acrylamidlösung wird nun mit einer Pasteurpipette zwischen die Glasplatten der vorbereiteten Gelkammer pipettiert bis auf die angebrachte Markierung und mit etwas 50%igem Isopropanol überschichtet. Wenn das Trenngel polymerisiert ist, wird das Sammelgel gegossen. Die folgenden Komponenten werden in einem 50 ml Erlenmeyerkolben gemischt: 0,6 ml Acrylamid/Methylenbisacrylamid (30% / 0,8%) 1,5 ml 0,5 ml Tris/HCl (ph 6,8) 3,8 ml H 2 O bidest 60 µl 10% (w/v) SDS 30 µl 11% (w/v) Ammoniumpersulfat Die Polymerisierung des Gels wird durch die Zugabe und Untermischung von: 10 µl TEMED eingeleitet. Das über dem Trenngel befindliche Isopropanol wird direkt vor dem Gießen des Sammelgels abdekantiert und verbliebene Alkoholreste werden durch viermaliges Spülen mit H 2 O bidest entfernt. Dann wird die Sammelgellösung über das Trenngel mit einer Pasteurpipette geschichtet und der Kamm (für 10 Probentaschen) eingesetzt. Die Lagen der Taschen werden mit einem Filzstift markiert. (Das auspolymerisierte Gel kann durch Abdeckung mit Frischhaltefolie zum Schutz vor Austrocknung über Nacht im Kühlraum aufbewahrt werden). Zur Durchführung der Elektrophorese wird die Gelkammer in die Elektrophorese- Apparatur unter Beschickung mit Laufpuffer eingebaut (Anweisung durch die Praktikumsassistenz). Der Laufpuffer besteht aus 25 mm Tris, 192 mm Glycin und 0,1% (w/v) SDS (ph 8,3)

3 3 Auftragung der Proben: Proteinproben zum Untersuchen werden unter Zusatz von konzentriertem SDS- Probenpuffer und Erhitzung vorbereitet (s. 2A.5.2). Bis zu 15 µl der vorbereiteten Proben und gestellten Standardlösungen werden in die Taschen des Sammelgels mit einer Kolbenpipette einpipettiert. Der Auftragsplan wird mit dem Praktikumsbetreuer beschlossen. Durchführung der Elektrophorese: Nach dem Probenauftrag wird die Elektrophorese zunächst bei einer Spannung von 50 V bei nicht-limitierender Stromstärke durchgeführt. Wenn die Front des Bromphenolblau-Farbstoffs vom Probenpuffer bis zum Trenngel gewandert ist (nach ca. 30 Min), wird die Spannung auf 150 V erhöht. Die Elektrophorese wird fortgesetzt, bis der Blaumarker das Gelende erreicht hat, und dann beendet. Die Gelkammern werden aus der Apparatur genommen. Die Gele werden aus den Kammern herausgelöst und folgenderweise weiterbehandelt: mit einem Gel wird eine Commassie-Färbung (blauer Proteinfarbstoff) in einer PVC-Schale durchgeführt: Das Gel wird zuerst 2 x 5 Min mit jeweils 25 ml "starkem Entfärber" (40% Methanol (v/v) und 10% Eisessig (v/v) in Aqua dest) gewaschen. Die Waschlösungen werden als "flüssig organisch" gesammelt. Das Gel wird dann in 50 ml einer Färbelösung aus 0,25 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue in starkem Entfärber ca. 30 Min unter Schütteln inkubiert. Anschließend wird das gefärbte Gel 5 Min mit 25 ml "schwachem Entfärber" (7,5% Methanol (v/v) und 5% Eisessig (v/v) in Aqua dest) gewaschen. Die Waschlösung wird ebenfalls als "flüssig organisch" gesammelt. Dann werden 50 ml schwacher Entfärber zum Gel zugegeben und die Schale zum Entfärben ca. 30 s in einem Mikrowellenherd erhitzt (evtl. auch etwas länger oder erneut). Das entfärbte Gel kann länger in dem schwachen Entfärber in der verschlossenen Schale lange aufbewahrt werden. Die Proteine in den weiteren Gelen werden durch Elektrotransfer auf eine Nitrocellulosemembran zum immunchemischen Nachweis geblottet:

4 4 Elektrophoretischer Transfer ("Blot") Die in den SDS-PAGE-Gelen aufgetrennten Proteine werden elektrophoretisch auf eine unmittelbar darunter liegende Membran aus Nitrocellulose übertragen: Die Proteine binden irreversibel auf die Membranoberfläche. Dies erfolgt im Praktikum durch "Nassblotten" in einer Blotkammer der Firma BioRad.: Für jedes Gel werden eine größenmäßig passende Nitrocellulosemembran sowie 4 passende Stücke dickes Filterpapier zugeschnitten. Die Filterpapiere werden in einer Plastikschale in Transferpuffer inkubiert. Die Kunststoffmatten zum Festhalten der Membranen sowie deren Kassetten-Halterungen werden in Transferpuffer in einer flachen Fotoschale ausgelegt: die schwarze Seite (kathodisch!) der Kassetten-Halterung nach unten! Auf eine im Transferpuffer liegende Kunststoffmatte werden für jedes Gel zwei übereinander liegende, starke Filterpapiere gelegt. Das Gel wird aus seiner Gelkammer genommen und das Sammelgel entfernt. Das Gel wird auf das obere Filterpapier gelegt. Dann wird die Membran kurz in Aqua bidest gewässert und auf das Gel gelegt; auf das Gel kommen dann zwei weitere Filterpapiere. Nun wird die zweite Kunststoffmatte auf das Gel-"Sandwich" gelegt und beide Matten werden in ihrer Kassetten-Halterung befestigt. Die Halterungen werden in die Blotkammer eingehängt (Gele müssen auf der Kathodenseite und die Membranen auf der Anodenseite positioniert sein!) und die Kammer wird mit Transferpuffer gefüllt. Die Elektrophorese wird über Nacht bei 100 ma im Kühlraum durchgeführt. Kontrolle des elektrophoretischen Transfers Nach Beendigung der Elektrophorese wird geprüft, ob die aufgetrennten Proteine des SDS-Gels effektiv auf die Nitrocellulosemembran transferiert worden sind. Dies geschieht über Proteinfärbung des Gels einerseits und der Membran andererseits: Die Gele und Membranen werden aus der Blotapparatur genommen: Ein Gel wird mit Coomassie Blue, wie oben beschrieben, gefärbt. Durch Vergleich der Proteinmuster vor und nach dem Blotten kann auf die Effizienz des Proteintransfers geschlossen werden. Die Membranen werden reversibel mit Ponceau-Rot zur Kontrolle der Proteinübertragung auf die Membran gefärbt und dann in Blockierlösung für den anschließenden Immunnachweis überführt: die Membran wird in eine Plastikschale gelegt, kurz mit bidest. Wasser abgespült und dann mit Ponceau-Rot-Lösung bedeckt. Nach

5 5 kurzem Schwenken der Schale färben sich an die Membran gebundene Proteine rot. Das Proteinmuster auf der Membran soll photographisch aufgezeichnet werden. Die Lage von Markerproteinen kann mit einem Bleistift nachgezeichnet werden. Die Ponceau-Lösung wird abdekantiert und zum weiteren Gebrauch aufbewahrt; Reste der Ponceau-Färbung können leicht durch Spülung mit bidest. Wasser entfernt werden. Die Membran wird nun für den immunchemischen Nachweis in ein 50 ml Falconröhrchen eingeführt. Immunchemischer Nachweis Proteine, die an die Nitrocellulose-Membran nach dem Elektrotransfer gebunden sind, können immunchemisch selektiv nachgewiesen werden. Alle Inkubationsschritte erfolgen unter Drehen des 50 ml Falconröhrchens mit der Membran mit einem Rotationsmixer; es sind stets Handschuhe zu tragen: Blockieren: Zur Absättigung ( Blockierung ) proteinfreier Zonen wird die Membran in dem 50 ml Falconröhrchen mit 15 ml Blockierlösung versetzt und (mindestens) eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absättigung der proteinfreien Membranoberfläche mit Milchproteinen gewährleistet, dass keine Antikörper unspezifisch an die Membranoberfläche binden können, was zu einer unspezischen Nachweisreaktion führen würde (und zum Verlust des Antikörpers). Behandlung mit primärem Antikörper: Die Blockierlösung wird abdekaniert und mit 10 ml verdünntem Antiserum gegen das gesuchte Protein in Blockierlösung versetzt. Die Membran wird dann 90 min lang bei Raumtemperatur mit dieser Antiserumverdünnung inkubiert. Anschließend wird nicht-gebundener Antikörper durch drei 10-minütige Waschschritte mit je 10 ml Blockierlösung entfernt. Vorhandene primäre Antikörper und ihre Anwendungsverdünnungen sind: - Anti-PAL (Petersilie), in Kaninchen hergestellt (1:2000) - Anti-CHS (Arabidopsis thaliana, C-terminus), in Ziege hergestellt (1:200) Die spezifischen Primärantikörper, die durch die nachfolgende Bindung mit dem Sekundärantikörper-Konjugat zur Nachweisreaktion führen werden, binden nur an das gesuchte Zielprotein.

6 6 Behandlung mit sekundärem Antikörper: Die Membran wird dann mit 10 ml verdünntem sekundärem Antikörper (1:2000) versetzt. Der sekundäre Antikörper ist gegen den primären Antikörper gerichtet und mit dem Enzym Meerrettich-Peroxidase kovalent gekoppelt ( konjugiert ). Die Membran wird dann 90 min lang bei Raumtemperatur mit dieser Konjugatverdünnung inkubiert. Anschließend wird zweimal 10 min mit je 100 ml Blockierlösung und wiederum zwei mal 10 min mit je 100 ml TBS gewaschen. Die vorhandenen sekundären Antikörper (jeweils mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelt) sind: - Anti-Kaninchen-IgG, in Ziege hergestellt - Anti-Ziege-IgG, in Esel hergestellt Die sekundären Antikörper binden spezifisch an den artspezifischen konstanten Teil des primären Antikörpers. Die durch die konjugierte Peroxidase bewirkte Nachweisreaktion kann also nur dort stattfinden, wo der Primärantikörper und somit das Zielprotein auf der Membran befindlich sind. Proteinnachweis: Die Membran wird aus dem Falconröhrchen genommen und Oberflächenflüssigkeit wird abgetupft. Zur Detektion der gebundenen Antikörper mittels der Peroxidase- Reaktion werden zu der Membran in einer passenden Plastikschale ca. 3 ml des flüssigen Substrats für die Peroxidase (3,3,5,5 -Tetramethylbenzidine: TMB) gegeben. Die Membran wird in dieser Lösung geschwenkt, bis sich sichtbare dunkle Bereiche von Reaktionsprodukt bilden (kann sehr schnell geschehen). Zum Abstoppen der Reaktion wird die TMB-Lösung abdekantiert und die Membran mit H 2 O bidest gewaschen. Nach 5 min wird die Membran an der Luft getrocknet und im Dunkeln zwischen Papier (oder Aluminiumfolie) aufbewahrt. Der Zeitpunkt des Abstoppens der Reaktion soll mit dem Praktikumsbetreuer beschlossen werden. Zu lange Behandlung mit dem TMB-Reagenz führt zu unspezifischen Farbreaktionen. Reagenzien: Acrylamid/Methylenbisacrylamid (30% / 0,8%) Fertigmischung: z.b. Rotiphorese Gel 30 (37,5:1 von Roth (3029.1)) 1,5 M Tris/HCl (ph 8,8) - 18,2 g Tris in 70 ml Aqua bidest lösen

7 7 - ph auf 8,8 mit HCl einstellen - auf 100 ml mit Aqua bidest auffüllen 0,5 M Tris/HCl (ph 6,8) - 6,06 g Tris in 70 ml Aqua bidest lösen - ph auf 6,8 mit HCl einstellen - auf 100 ml mit Aqua bidest auffüllen 10% (w/v) SDS - 10 g SDS in 80 ml Aqua bidest lösen, auf 100 ml mit Aqua bidest auffüllen 11% (w/v) Ammoniumpersulfat (frisch ansetzen!) mg Ammoniumpersulfat in 1 ml Aqua bidest lösen - in Eis aufbewahren TEMED (N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin; z.b Roth ) SDS-Laufpuffer (25 mm Tris, 192 mm Glycin und 0,1% (w/v) SDS, ph 8,3) - 3 g Tris und 14,4 g Glycin in 800 ml Aqua bidest lösen - dazu 10 ml 10% SDS zugeben und auf 1 l mit Aqua bidest auffüllen (ph stellt sich von alleine auf 8,3 ein) Starker Entfärber (45% (v/v) Methanol und 10% (v/v) Eisessig) - 112,5 ml Methanol, 25 ml Eisessig und 112,5 ml Aqua dest mischen Schwacher Entfärber (7,5% (v/v) Methanol und 5% (v/v) Eisessig) - 75 ml Methanol, 50 ml Eisessig und 875 ml Aqua dest mischen SDS-PAGE Protein-Färbelösung (0,25 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue in starkem Entfärber - 0,2 g Serva Blau R und 0,05 g Serva Blau G in starkem Entfärber unter Rührung lösen. Nach Abkühlen filtrieren Transferpuffer (0,05 M Tris, 0,192 M Glycin und 20% (v/v) Methanol) - 3 g Tris, 14,4 g Glycin in 600 ml Aqua bidest lösen - dazu 200 ml Methanol und auf 1 l auffüllen Ponceau-Rot-Lösung (Boehringer ) - 0,2 % (w/v) Ponceau-S in 3 % (v/v) Essigsäure

8 8 0,1 M Tris/HCl, ph 7,5-12,11 g Tris in 80 ml Aqua bidest lösen - ph auf 7,5 mit HCl stellen - auf 1l mit Aqua bidest aufüllen TBS (Tris buffered saline: 20 mm Tris/HCl, ph 7,5 und 500 mm NaCl) - 29,22 g NaCl in 200 ml 0,1 M Tris/HCl, ph 7,5 und 600 ml Aqua bidest lösen - Auf 1 l mit Aqua bidest auffüllen Blockierlösung (0,05 % (v/v) Tween 20 und 2,0 % Magermilchpulver in TBS) - 2 g Magermichpulver in 100 ml TBS lösen und mit 50 µl Tween 20 versetzen - (bei 4 o C aufbewahren) 3,3,5,5 -Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for Membranes (Sigma TO ml) - (Wird gestellt, 4 C) Liste der verwendeten Gefahrstoffe mit Hinweisen auf die besonderen Gefahren (R-Sätze) und mit Sicherheitsratschlägen (S-Sätze) Acrylamid/Bisacrylamid: krebserzeugend, erbgutverändernd, giftig R: /25-48/23/24/25 S: Ammoniumpersulfat: brandfördernd, sensibilisierend, gesundheitsschädlich R: /43 S: Essigsäure: entzündlich, ätzend R: S: Isopropanol: leichtentzündlich R: 11 S: 7-16 Methanol: leichtentzündlich, giftig R: 11-23/25 S: Natriumdodecylsulfat (SDS): gesundheitsschädlich, reizend R: 22-36/38 S: Salzsäure (HCl): ätzend, reizend R: S: 26-36/39-45

9 TEMED: leichtentzündlich, gesundheitsschädlich, reizend R: 11-20/22-34 S: /37/

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