3 Vorteile und Anwendungsbereich der Agarose-Gelelektrophorese von Nucleinsäuren. ( )

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1 1 Wie isoliert man genomische DNA aus Bakterien / Pflanzen / Lymphocyten von Tieren? Wie kann man die Menge grob messen? (S ) Aufschluss: homogenisation, Dentergens zu Zerstören der Membran, Verdau von Zellwänden und Bindegewebe durch Enzyme, (ev. RNAse und/oder DNAse-Hemmer hinzu) 2-Phasen-Extraktion: Nach Zugabe von Nukleonharz und anschl. Zentrifugation 3 Bereiche: unten: organische Phase (Lipid, Detergens) mittig: Protein (denaturiert) bildet Haut oben: wässrige Phase mit Nukleinsäuren und allen anderen hydrophilen Dingern Dann Gelfiltration mit Überstand: DNA saust durch, kleine Sachen brauchen länger. Finden der DNA zb mit Ethidiumbromidfärbung oder durch radioaktiv markierte DNA. RNA rausfiltern: entw. RNA verdauen, oder mit Ionentauscher: Verschiedene Sorten RNA und DNA werden verschieden stark gebunden. Ribose wird gebunden, lösen mit freier Ribose. Ausfällen: z.b. die wässrige Phase mit Ethanol überschichten (Ethanolpräzipitation). Chromosomenstränge verkleben im Ethanol, nach Zentrifugation kann der Faden/das Knäuel mit sterilem Faden rausgezogen werden. Abschätzen der Menge: ganz grob: Agarosegel fahren feiner: Wiederauflösen und Konzentrationsbestimmung im Photometer. Basen der Nukleinsäuren absorbieren bei 254 nm. 1.0 OD entspricht 40µg/ml. 2 Vorteile und Anwendungsbereich der Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Nucleinsäuren. ( , ) Anwendung: v.a. für Sequenzierung! Zum Sequenzieren vormarkieren: entweder radioaktiv od. mit Fluoreszenz. Nur für kurze Nucleinsäuren (1-500 bp) Vorteil gegenüber Agarose: Die Auflösung (1 Basenlänge Unterschied!)! So kann bei der Sequenzierung die DNA-Sequenz einfach durch die Längenunterschiede von sich um 1 Nukleotid unterscheidenden (markierten) Fragmenten abgelesen werden (Abb. 7.5, S. 268). 3 Vorteile und Anwendungsbereich der Agarose-Gelelektrophorese von Nucleinsäuren. ( ) Anwendung: Z.B. trennen von ganzen Chromosomen (im Pulsfeld) oder von mittelgroßen DNA-/RNA-Stücken. Vorteile: bis 2,5 Mio. Da bei PFGE bis Da bei konst. Feld ungiftig - im Gegensatz zu PA einfach zu gießen - in heißem Puffer gelöst, abkühlen lassen, fertig! horizontal verwendbar einfacheres Blotten der Banden (ohne Strom) Nachweise mit AK meist direkt im Gel möglich (großporig), ohne Blot Ethidiumbromid (giftig) kann im Gel mit eingeschmolzen werden, baut sich in DNA ein, nur das in der DNA fluoresziert Wiedergewinnung der Probe aus Gel leicht möglich 1

2 4 Was ist ein Northern Blot, was ein Southern Blot? ( , ) Methoden zum Herauslösen von DNA/RNA aus einem Gel nach EP, und dem Übertragen auf eine Membran (Nitrozellulose od. Nylon) zur späteren Hybridisierung mit markierten Sonden. Unten ein Schwamm in Puffer, darauf das Agarosegel, dann die Membran, darauf die Papierhandtücher (S. 279). Puffer wird durch das Gel in die Handtücher gesogen, DNA/RNA wird mitgeschwemmt und bleibt auf der Membran hängen. Danach wird mit UV (bei Nylon) oder Hitze (Nitrozellulose) fixiert, dann kann ich mit markierten Sonden (DNA-/RNA-Einzelstrangfragmente) hybridisieren. Die Sonde bindet, die übrigen wasche ich weg. Dann kann ich detektieren. Zur Größenbestimmung habe ich im Gel einen wie die Sonde markierten Marker mitlaufen lassen und mit auf die Membran übertragen. Southern Blot: für DNA Northern Blot: für RNA 5 Was sind Restriktionsenzyme und warum war ihre Entdeckung so epochal? (286, 290, 304, ) Sie schneiden an ganz bestimmten DNA-Palindromsequenzen (Abb. 7-1, S. 286) Damit konnte man auf einmal DNA-Stränge IMMER GLEICH schneiden! alle Segmente sind an der selben Stelle geschnitten Reproduzierbarkeit der Ergebnisse PCR ist nun möglich RFLP möglich - Herstellung einheitlicher bzw. VERGLEICHBARER DNA-Fragmente, die der Größe nach getrennt werden können. Der Vergleich der DNA zweider Individuen ist möglich geworden. Chromosomen können in lauter definierte Fragmente zerlegt und in Bakterien vermehrt werden Die Sequenzierung von (KLEINEN) Segmenten und der Schluss auf das gesamte Erbgut ist möglich 6 Erläutern Sie die RFLP-Messung. Was tut man? Welche Daten erhält man? Welche Schlüsse will man daraus ziehen? ( ) RFLP = Restriktions - Fragment - Längen - Polymorphismus Längen der Restriktionsfragmente unterscheiden sich bei jedem Menschen. Dies lässt sich oft auch mit dem Auftreten bestimmter Erbkrankheiten in Verbindung bringen. Southern Blot erlaubt die selektive Sichtbarmachung eines ganz bestimmten Genfragments nach Agarose Gel und Blotting auf eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran. Alle anderen Fragmente bleiben unsichtbar auch jene die die gleiche Länge haben. DNA ist am einfachsten aus der Isolierung reiner genomischer DNA aus Leukocyten zu gewinnen. Man erhält Aussagen über die größe des mit der Sonde markierten Gens. Genetische Kopplungsanalyse: Mit dem bestimmten krankheitsauslösenden Gen wird oft auch ein naheliegender RFLP-Marker vererbt. Diese liegen dann auch mit hoher Wahrscheinlichkeit auf dem vererbten Gen nahe beieinander. Eine strenge Kopplung liegt aber nur dann vor wenn der RFLP-Marker in den betreffenden Gen enthalten ist. Für die Antwort sollte man sich auch noch die Seite 285 nochmal anschauen. PCR in der Gerichtsmedizin 2

3 7 Wie kommt man zu einer kurzen oder langen markierten Nucleinsäuresonde? ( ) Kurze markierte Nucleinsäuren können von Syntheseautomaten hergestellt werden. Herstellung über organische Chemie. Kann man bei Firmen die auf so eine Herstellung spezialisiert sind kaufen, man muss nur die gewünschte Sequenz angeben. Lang über random priming: Zugegeben werden Primer, die alle Kombinationen von Basen enthalten. Zugabe muss in ausreichender Konzentration erfolgen. Danach müssen DNA-Polymerase und markierte Nucleotide zugegeben werden. DNA-Polymerasen bauen die markierten Nucleotide ein wodurch eine Population mit markierten Exemplaren aller Sequenzen auf beiden Strängen entsteht. andere Methode: Polynucleotidkinasen markieren nur das 5 Ende der DNA mit heißen Phosphoratomen. Mit Restriktionsenzymen wird die DNA dann geschnitten und durch Gelelektrophorese werden die gewünschten markierten Fragmente ausgesucht. Die Sonden können auch mit chemischen oder Antikörpermarkern ausgestattet werden. Auch die Herstellung von RNA-Sonden ist möglich: Run off Transcripts: Mit viraler RNA-Polymerase werden in vitro große Mengen eines bestimmten RNA-Moleküls hergestellt. Ein künstliches Doppelsträngiges DNA-Molekül (Vektor) wird mit einem Promotor und dem RNA-spezifischen Sequenzstück versehen. Am Ende dieser Sequenz wird mit Restriktionsenzymen aufgeschnitten um die Transkriptions zu beenden. Danach wird der offene Vektor mit RNA-Polymerase inkubiert. Nach Entfernung der Polymerase und der DNA ist die reine RNA verfügbar. 8 Wie funktioniert die PCR? ( ) Polymerase Chain Reaction Voraussetzungen: der zu kopierende Bereich wird mit zwei spezifischen Primer begrenzt. Die Länge ist mit ungefähr 1000 BP begrenzt, Spezialisten schaffen aber mehr Von der Vorlage wird zwar im Prinzip nur ein Molekül gebraucht, für die praktische Anwendung sind aber um die 100 Thermostabile Polymerasen Die DNA wird durch Hitze getrennt. Es wird abgekühlt. Die kurzen und im Überfluss vorhandenen Primer binden an die Einzelstränge. Die Temperatur wird meist wieder ein bisschen erhöht um eine schnellere Arbeit der Polymerase zu erreichen. Basen müssen in ausreichender Menge vorhanden sein. Nach einer Zeit die ausreicht damit die Polymerase ihre Arbeit beendet hat wird wieder erhitzt und der Vorgang beginnt von neuem. 9 Wozu wendet man PCR an? (285, 310, 342) In der Gerichtsmedizin wird PCR verwendet um bestimmte Mirkosatelliten oder VNTR (variable number of tandem repeates zb GTGTGTGTGTGT) zu amplifizieren. Da die Anzahl der Repeats vererbt wird und bei jedem Menschen einmalig ist kann so bei vorliegen einer genetischen Probe ein Vergleich angestellt werden, der die Zuordnung Vater - Sohn oder Täter - Verdächtiger erlaubt. Herstellung von markierter Sonden-DNA Mittels PCR lässt sich jeder Bereich der DNA selektiv vermehren und bei Verwendung von markierten (z.b. radioaktiven) Primern sind diese vielen Abschriften auch markiert, d.h. leicht detektierbar. Man kann also von einer kleinen Menge Vorlagenstrang ausgehen und eine große Menge radioaktiver Kop= ien gewinnen, welche später in Northern/Southern Blot als Sonden eingesetzt werden können. PCR zwecks nachheriger Sequenzierung 3

4 Die moderne Methode der Gewebstypisierung (vor Organ-Transplantationen) geht in zwei Stufen vor sich. Zuerst werden in mehreren parallelen PCR-Ansätzen verschiedene MHC-Gene vermehrt (MHC =3D major histocompatibility complex). Jetzt liegt in jedem Röhrchen eine große Menge eines bestimmten MHC-Gens vor. Im zweiten Schritt wird jedes kopierte MHC-Gen sequenziert. PCR mit Sequenz-spezifischen Primern Die ältere Methode der Gewebstypisierung wird in einem Schritt mit Sequenz-spezifischen Primern durchgeführt. Die Zahl der parallel durchgeführten Ansätze ist in diesem Fall viel höher als die Zahl der zu analysierenden MHC-Gene, weil man nämlich Primer verwendet, die jene kritischen Orte der MHC-Gene adressieren, welche sich von Mensch zu Mensch oft unterscheiden. Man muss daher alle theoretisch in Frage kommenden Sequenzen mit den passenden Primern durchspielen. Wenn ein kritischer Primer passt, dann "beißt er an" und es entsteht ein PCR-Produkt, welches man als Bande am Agarose-Gel sieht. In einer modernen Variante kann man während der Enzym-Reaktion von außen mittels Fluoreszenz verfolgen, wie viel Doppel-Helix entsteht (z.b. im Light Cycler), dann kann man nach der 20. Runde die Proben entsorgen und die Daten abspeichern. PCR mit überhängenden Primer-Enden als Klonierungshilfe Einer oder beide Primer können zwei Abschnitte besitzen: (1) denüblichen Abschnitt, welcher eine bestimmte Ziel-Sequenz in der genomischen DNA adressiert, sowie (2) einen nicht paarenden Abschnitt, welcher Schnittstellen für Restriktionsenzyme und damit Klebe-Enden für den Einbau in Plasmide enthält. Es ist natürlich sinnvoll, vorne und hinten zwei ungleiche Klebe-Enden anzufügen. Solche asymmetrischen Stücke können mit eindeutiger Orientierung in einen Vektor inseriert werden und außerdem lassen sich auf diese Weise leicht Fusionsproteine herstellen, d.h. man schneidet wiederholt auf und hängt immer weitere Inserts an die bisherigen Protein-Gene. 10 Wie isoliert man einen Toxin-Rezeptor in reiner Form? (293, ) Reines markiertes Toxin muss vorhanden sein. Die Membran wird mit Detergenz aufgelöst. Danach wird chromatographiert und in Fraktionen aufgeteilt. Toxin wird zu einem Aliquot jeder der Fraktionen zugegeben. Ein Liganden Binungs Test wird durchgeführt. Danach wird es auf eine Gelsäule aufgetragen. Das Gel wird so gewählt, dass alle Proteine im Void-Volumen eluieren, während die kleineren Toxine im Totalvolumen zurückgehalten werden. In der Frakton mit dem Rezeptor biden die markierten Toxine dauerhaft und eluieren im Void-Volumen. Die Menge an Marker in der vorauslaufenden Proteinfraktion lässt daher Aussagen über die Menge an funktionellem Rezeptor zu. Chromatographie muss in mehreren Schritten durchgeführt werden. 11 Warum ist die Sequenz der N-terminalen 20 Aminosäuren so wertvoll? (303, ) N-terminale AS wichtig zur Auswahl der Oligonucleotid-sonden, mit der Länge von 20AS kann Mehrdeutigkeit der Sonden ausgeschlossen werden. 12 Wie macht man eine cdna-bibliothek von einem bestimmten Gewebe? Was ist eine cdna-bibliothek? ( , 311, auch kann mit wenigen Stichworten angesprochen werden) mrna isolieren: 1. Gewebe homogenisieren (in Gegenwart von RNAse hemmer), Protein und Lipid durch Chloroform/Phenol-Extraktion beseitigen, DNA wird durch RNAse-freie DNAse verdaut. 2. übriggebliebene Lösung mit diversen RNA-Sorten auf poly-t-affinitätssäule, nur mrna besitzt poly-a-schwanz und wird von der Säule spezifisch gebunden. Synthese von cdna: Enzym Reverse Transcriptase stellt eine kopie der mrna her, die sogenannte cdna, RT braucht Primer um Synthese starten zu können, RNA durch ph 12 los werden. 4

5 Einbau der cdna in Plasmide: cdna in Plasmide einbauen (sehr effizient mit Sticky-Ends / mit blunt-ends wird mehr cdna benötigt), Plasmide mit Antibiotika-Resistenz verwendet. Mehr Plasmid als cdna anbieten, damit nur 1 Insert pro Plasmid. Transformation: durch bestimmte Kombination von Salzen katalysiert man die Aufnahme von «1 Plasmid pro Bakterium. Wegen Antibiotika-Resistenz können nur jene Bakterien überleben, welche auch ein Plasmid aufgenommen haben. Nicht mehr als 1 Plasmid pro Bakterium, da großer Überschuss an Bakterien. All jene Bakterien die jetzt also überleben tragen das Plasmid mit cdna und bilden die cdna Bibliothek. 13 Wie komme ich von der cdna-bibliothek zu einem reinen Klon? ( ) Nylon-Filter auf Kulturschale legen, am Filter bleiben Teile jeder Bakterienkolonie hängen. Filterscheibe wird mit Natronlauge behandelt, Bakterien werden zerstört, DANN-Doppelhelices werden in Einzelstränge aufgeteilt, DNA bindet in Gegenwart von NaOH irreversibel ans Nylon. Filter in konzentrierte Salzlösung mit leicht saurem ph getaucht, mit radioaktivem Oligonucleotid inkubiert (Test auf N-terminale Sequenz des gewünschten Proteins) Bei der gesuchten Kolonie bindet das Oligonucleotid und lässt sich als Schwärzung am Röntgenfilm nachweisen. Diese Markierung bezeichnet die Position der Kolonie mit dem gesuchten Gen, man weiß nun welche Kolonie man picken muss um eine Expression des gewünschten Proteins zu starten. 14 Wie komme ich zur Sequenz für das klonierte Gen? (313, ) Zellwände aufbrechen und DNA isolieren Nach Maxam und Gilbert (chemisch): Stränge der Doppelhelix werden getrennt, chemisch spezifisch zerschneiden, z.b. am A, so entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, jeweils am A geschnitten und bezeichnen so die Position der A in der DNA. Die Länge der Fragmente und damit die Position der A kann mittels Gel aufgetrennt werden. Macht man dies parallel für alle 4 Basen und trägt sie nebeneinander in einem Gel auf kann die DNA-Sequenz direkt aus dem Gel abgelesen werden. Nach Sanger (enzymatisch): bei in-vitro Synthese werden Didesoxyribonucleosid-Triphosphate in denen die Desoxyribose-3 -OH-Gruppe fehlt eingesetzt, wird dieser Baustein eingebaut, so kann nicht weiter gebaut werden. Dieser Baustein wird statistisch verteilt überall eingebaut. Führt man das ganze zur Detektion von A aus so tritt (didesoxi) ddatp in Konkurrenz mit normalem (desoxi) datp somit entstehen Fragmente unterschiedlicher Länge mit jeweils A an ihrem Ende, dies ergibt also eine ähnliche Leiter wie bei dem chemischen Verfahren (kann ebenfalls für alle 4 Basen durchgeführt werden, (dctp, dgtp, dttp)). Detektiert kann die Länge z.b. durch einen chemischen bzw. radioaktiven Marker im ddxtp (X=A,C,G,T) 15 Wie sequenziert man ein Gen mit vielen tausend Basenpaaren? (333) Was er hören will: Primer Walking: Man stückelt die Sache. Man startet vorne und hinten mit den Primern und sequenziert so weit man kommt. Dann macht man nen neuen Primer und geht von den beiden punkten weiter bzw zurück (damit man schaut ob man eh keinen Fehler gemacht hat), das macht man so lange bis man fertig is. Zusätzliches Wissen: Shotgunverfahren. Man nimmt sich die Target DNA her und ballert entweder physikalisch drauf oder arbeitet mit enzymen um sie zu zerlegen. Die Fragmente werden dann cloniert, kommen auf nen Vector und werden dann sequenziert. 5

6 16 Was muß eine Klonierungsvektor alles haben, was ein Expressionsvektor? ( ) Expressionsvektor: Promoter, Origin, Resistenzgen für Antibiotika, Schnittstellen für Restriktionsenzyme (MCS - Multiple Cloning Sites), darf Sequenzierprimer haben, Repressor (Der Clou ist dass der Repressor den Promotor solange unterdrücken soll bis genug Bakterien vorhanden sind. Expression wird induziert z.b. durch Arabinose, löst Repressor ab und gibt Promoter frei) Klonierungsvektor: Alles außer Promoter und Repressor 17 Wie kann man das Insert in einem Expressionsvektor mutieren? (S. 340) Auf einen Einzelstrang schmeisst man den mutierten Primer(man kann dadurch viel ändern auch mehrere Aminosäuren ersetzen oder entfernen) drauf. Durch die Polymerase wird dann einmal der gesunde Einzelstrang cloniert und einmal der mutant Man bekommt ein Gemisch. Will man nur die mutierten haben,muss man die Bakterien aufbrechen, die Plasmide reinigen und nochmal in neuen Baktieren klonieren. 18 Was ist ein Fusionsprotein, wie generiert man ein Fusionsprotein? (S , S ) Wenn man nacheinander immer neue Gensegemente in einen Mutanten einbaut, entsteht so ein Fusionsprotein. (was auch in der Natur nicht vorkommt zb) Man schnappt sich ein DNA Molekül und schneidet mit einem Restriktionsenzym auf, neuer Teil kommt dazu. Das ganze wird dann cloniert und das neu entstandene Molekül wieder aufgeschnitten und wieder ein neuer Teil dazugeworfen... etc Alternativ kann man mit PCR und einem überlappen der Primer arbeiten. - Details fehlen 19 Wie kann man Expressionsplasmide in Eukaryonten bringen? Wie detektiert man jene Eukaryontenzellen, welche transfiziert wurden? 1. Einspritzen 2. Zelle ist vom Zielplasmid umgeben. Die Zelle wird einem kurzen aber starken Elektroschock ausgesetzt,membranstruktur geht auf, Plasmid kann eindringen, Zelle macht zu 3. Man macht ein Päckchen das von einer Membran umschlossen ist und das gewünschte Plasmid enthält. Es wird eine Fusion mit der Zelle induziert Erfolg 6