I. Strukturelle Genomik II. Funktionelle Genomik III. Integrative Genomik
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- Dominic Bayer
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1 I. Strukturelle Genomik II. Funktionelle Genomik III. Integrative Genomik
2 Themen 1.Begriffe 2.Genomstruktur 3.Funktion des Genoms 4.Verfahren von Genomik
3 Begriffe- 1 Genom: Definition 1. Gesamte Vererbungsinformation von einem Organismus Definition 2. Haploider DNA-Bestand einer Zelle von einem Lebewesen 1. Genom im Zellkern 2. Genom von Mitochondrien und Chloroplasten Transkriptom: 1. Gesamtes Transkriptom : -Gesamt-mRNA in einem Organismus 2. Zellulares Transkriptom: - Gesamt-mRNA in einer Zelle von einem Organismus unter bestimmten experimentellen Bedingungen. Proteom: 1. Gesamtes Proteom: - Gesamt-Protein in einem Lebewesen 2. Zelluläres Proteom: - Gesamt-Protein in einer Zelle von einem Organismus unter bestimmten experimentellen Bedingungen.
4 Begriffe- 2 Genomik (Genombiologie) 1. Strukturelle Genomik: Def: genetische Kartierung und Vergleichen der Individuen a. Bestimmung der Genomsequenz (Mensch, Maus, Schimpanze, usw.) b. Variabilitat des Genoms: intraspezifisches Polymorphismus c. Evolution des Genoms: interspezifisches Polymorphismus 2. Funktionelle Genomik: Def 1: Untersuchung des Transkriptoms Def 2: Untersuchung der Genfunktion 2/1 Funktionelle Genomik-I: Transkriptomik 2/2 Funktionelle Genomik-II: Proteomik Arbeitsbereich: - cdna sammeln: EST, Inventar - messen die Unterschieden der mrna-ausprägung: Transkriptomik - bestimmen die Ausprägung der Proteinen: Proteomik - knock-out, knock-in, konditionellen knock-out der Genen
5 Begriffe- 3 Alternative Einteilung: Genomik Funktionelle Genomik (Transkriptomik) Proteomik
6 Begriffe-4 Weitere omik -en: Phosphorylomik: Verhältnisse zwischen Kinasen und ihrer Substraten Methylomik: Metabolomik: Interaktomik: Methylationsmuster der gesamten DNA ( 3-5% des Genoms von Säugetieren) Verhältnisse zwischen die Stoffwechsel-Enzymen und ihre Substraten Wechselwirkung der Gene Lipidomik: Integratíve Genomik Komparatíve Genomik In silico Genomik Pharmakogenomik Psychogenomik Lipid-Inventar Omiken: Systembiologischer Gesichtspunk
7 2.Strukturelle Genomik 2a. Struktur/Sequenz der DNA 2b. Vielfältigkeit der DNA 2c. Evolution der DNA
8 Die abgefertigten Genomprogramme 2011
9 Strukturelle Genomik DNA Sequenzierung DNA Chromatogram
10 DNA-Sequenzierung nach Sanger Templat: 3 Primer : 5 CCGGTAGCAACT 5 GG 3 datp + ddatp dctp dgtp dttp datp dctp + ddctp dgtp dttp datp dctp dgtp + ddgtp dttp datp dctp dgtp dttp + ddttp GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCG GGCCATCGTTG GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT n A C G T A3 G T T G C T A C C5 Mit dem Templat komplementere Sequenz Dideoxy- Kettenterminierung
11 Automatisierte Sequenzierung
12 Manuelle-automatisierte Sequenzierung Manuelle: Abgelesen und eingetippt werden soll Fehlerhaft Automatische: Sequenz als Rechner-File
13 $ Genome sequencing? Sequenzierung der menschlichen Exon-sequenzen: ~$ 400
14 Hochdurchlässigkeitssequenzierung MULTIPLEX DNA SEQUENZIERUNG Hybridisierung-Basis SBH DNA-Synthese-Basis Pyrosequenzierung tsms SMRT Nanoporen-Technik Zweite Generation der Sequenzierung Dritte Generation der Sequenzierung
15 Auf Hybridisierung gegründete Sequenzierung (SBH) Vergleich mit bekannten DNA-Sequenzen Detektiert kleine Unterschiede SNP-Analyse Microarray-DNA-Chip Nicht-enzymatisch
16 Auf DNA-Synthese-gegründete Sequenzierung Gemeinsame Elemente: DNA-Polymerase Enzym Optische Detektierung Parallel, multiplex Methode Pyrosequenzierung tsms: Einzellmolekülsequenzierung SMRT: Einzellmolekül ware Zeit Sequenzierung
17 Pyrosequenzierung Primer, Strangverlängerung, Nukleotid um Nukleotid, durch Zugabe von jeweils einer der vier Arten dntp. Bei Zugabe des passenden (komplementären) Nukleotiden erhält man ein Lichtsignal, wurde ein an dieser Stelle nicht passendes NTP zugegeben, bleibt der Lichtblitz aus. Die vorhandenen NTPs: Werden zerstört und eine andere Art wird zugesetzt, dies wird fortgesetzt bis sich wieder eine Reaktion zeigt.
18 Pyrosequenzierung (DNA) n + dntp DNA-Polymerase (DNA) n+1 + PP i Sulfurilase Luciferase APS + PP i ATP Licht dntp ATP Apirase T/G polimorfizmus pirogramja dndp + dnmp + P i ADP + AMP + P i Pyrogram der DNA Sequenzen
19 Einzellmolekülsequenzierung Gleichzeitige Sequenzierung ~100 Millionen an DNA- Stränge Durchlässigkeit: Mehrere Milliarden Bp pro Tag!
20 Einzellmolekül ware Zeit Sequenzierung (SMRT single molecule real time) 2013: 100$/menschliches Genom, in 15 Minuten
21 Nanoporensequenzierung Schnell Billig Nicht-enzymatisch Keine Lichtdetektierung Detektiert Strohmstärke Verspricht für 100 ein menschliches Genom, in 15 Minuten
22 Nanoporensequenzierung mit Exonuklease Markierungslos Ohne Synthese 1 Molekül wird sequenziert d=1nm DNA Strohmstärke detektiert Oxford Nanopore Technologies α-hemolizin nanopore α-hemolizin nanopore + ciklodextrin
23 Kenntnis der DNA-Sequenz ermöglicht Prädisposition genetischer Krankheiten (~7000) Pathogen-Identifizierung in Infektionskrankheiten Verwandschafts-Vaterschaftsbestimmung Biologischer Personalausweis, Kriminalistik Herstellung Stammbäume Analyse der genetischen Hintergründe der Krankheiten Entdeckung neue Therapie Personalisierte Therapie
24 Chromosom-Spaziergang 1. Schritt A B C D E F G H Probe: DNA aus Klon A1 Signale: Klone A1, E7, F6 E7 A1 F6 2. Schritt A B C D E F G H Probe: DNA aus Klon F6 Signale: Klone A1, B12, F6 E7 A1 F6 B12
25 Funktionelle Genomik DNA-Chip-Technologie Protein-Chip Real-Time-PCR Whole Genome Tiling Die Ergebnisse sind QUANTITATIV!!!
26 DNA-Chip (microarray) -Die Funktion wird auf DNA-DNA-Hybridisierung, ein robustes Verfahren, gegründet - Die Anzahl der unterschiedlichen Oligonukleotide liegt in der Höhe von ~50.000
27 DNA-Chip-Herstellung durch Photolitographie Die Chip-Herstellung besteht aus automatisierbaren Schritte Das Chip und die nötigen Reagenzien kosten ~2000 Euro für ein Versuch (Zwei biologische und technische Duplikaten)
28 1. Herstellung des Chips: - Druck - in situ Synthese Kontrolle 2. Einsammlung die Gewebe behandelt 3. RNA-Isolation 4. reverse Transkription (fluoreszens Markierung) 5. Hybridisierung 6. Detektierung
29 Mutationsanalyse/SNP-Analyse durch DNA-Chip A-G Mismatch verhindert die effektive Hybridisierung Krebs-Panel : Enthält ALLE bekannte Mutationen der Krebsgene (RAS, Cyclin, CDC2, P53, NF, BRCA, BCL, RTK, usw.) Das Chip gleichzeitig ein Koordinatensystem ist: Die Stelle der Hyridisierung bestimmt sofort das Gen bzw. das Allel SNP: Single nucleotide polymorphism, EInzellnukleotidpolymorphismus
30 DNA-Chip-Analyse des Transkriptoms Rote Punkte: Exprimierung in Gewebe A Grüne: In B Orangefarbe: In beiden Spektralanalyse der Färbung: Quantitative Ergebnisse!!! Digitale Genexpression, DGE: Sequenzierung ~10 7 cdna TAG -Sequenzen (20-22-mer) DGE vs. Chip Ergebnisse sind vergleichbar DNA-Chip/DGE: Ersetzen zigtausende Northern-Analyse in einem Schritt
31 DNA-Chip Auswertung: Feature Extraction (dauert ~1 Stunde) Die Intensität des Fluoreszenzlichtes bestimmt die Menge (Konzentration) der RNA Spektrum des Fluoreszenzlichtes bestimmt den Beitrag der unterschidlich markierten Moleküle an Fluoreszenzentstehung
32 Anwendungen der Chip-Technologie Bestimmung Infektionskrankheiten, Identifizierung Microorganisma Diagnose: Behandlung dem Typ der Krankheit nach, häufig auf SNP-Muster gegründet Gerichtsmedizin mirna microarray
33 SNP-Kartierung rsnps (random SNPs): Befinden sich in den so genannten stillen Bereichen unseres Genoms, keine Auswirkungen auf den Phänotyp gsnps (Gen-assoziierte SNPs):Viele SNPs liegen in unmittelbarer Nähe von Genen bzw. in den Introns, also denjenigen Bereichen eines Gens, die nicht in ein Genprodukt übersetzt werden. Sie werden meistens mit diesen Genen zusammen vererbt, was sie für deren Kartierung wichtig macht. Auch können gsnps wichtige Kontrollelemente des Gens beeinflussen und damit das Ablesen eines Gens behindern oder beschleunigen csnps (codierende SNPs): Exons bilden den codierenden Bereich eines Gens. SNPs in diesem Bereich haben oft einen großen Einfluss auf die Funktion des entsprechenden Genproduktes psnps (Phänotyp-relevante SNPs): Sowohl gsnps als auch csnps können den Phänotyp eines Menschen beeinflussen (Menge/Form des Genproduktes, Pharmakogenetik)
34 APO E SNPs in Alzheimer-Krankheit Alzheimer-Krankheit: Polygenisch Apolipoprotein E-Gen: 2 SNPs 3 Allele: E2, E3, E4 1-1 Aminosäure Unterschied
35 BRCA1 Mutation: Predisposition für Brustkrebs GAG: Kodiert für Glutaminsäure UAG: Stopp-Kodon Änderungen in Proteinstruktur Splice-Varianten
36 NOS2-Malaria Verursacht: Plasmodium Anopheles Mückenvektor Im Promotor des NOS2-Gen: T -> C-Austausch NO-Konzentration im Blut nimmt zu - > Geringere Chance für Malaria-Erkrankung
37 MC1R Melanocortin 1 Rezeptor
38 Protein-Chip kontrolle behandelt Protein- Isolierung Markierung Immunreaktion Detektierung
39 Protein-Chip Markierungsstrategien 1. Direkte Markierung 2. Sandwichmethode
40 Abklärung von genomischen Imbalancen Die herkömmliche Chromosomenanalyse kann strukturelle Chromosomenaberrationen nur oberhalb eine Größe von ca Millionen Basenpaare erkennen
41 Vergleichende Genomhybridisierung (CGH) Hierbei wird DNA der Testperson mit einem (grün) und DNA einer Kontrollperson mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff (rot) markiert und zusammen auf einen Genchip (Microarray) hybridisiert. Je mehr Sonden pro Genom, desto größer die Auflösung ist. Die Testperson im Vergleich zur Kontrolle eine Deletion trägt, leuchtet später grün auf, wo ein Stück zuviel vorliegt (Duplikation, Amplifikation) leuchtet rot auf.
42 Real time, quantitative PCR Herkömmliche PCR mit der Möglichkeit der Quantifizierung durch fluoreszente Farbstoffe. Fluoreszenz nimmt proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu. Methoden: Interkalierende Farbstoffe: binden sich an die doppelsträngige DNA, wodurch ihre Fluoreszenz ansteigt. zb. Ethidium Bromid, SYBR Green Billiger, weniger spezifisch 2. TaqMan-Sonden Teurer, hochspezifisch
43 Real-Time vs. End Point PCR
44 DETEKTIERUNG MIT SYBR GREEN Nachdem die Polymerisation fertig ist, SYBR Green bindet zur doppelsträngigen DNA und fluoresziert SYBR Green fluoresziert nur wenn es doppelsträngige DNA bindet Je höher die Menge des dsdna Produktes, desto intensiver die Fluoreszenz, was wir während der Reaktion in wahrer Zeit (in real time) fluorimetrisch messen können
45 DETEKTIERUNG MIT TAQ-MAN SONDE keine Fluoreszenz TAQMAN PROBE - TaqMan Sonde: spezifische Bindung an der ZielDNA - Fluoreszierender Farbstoff am 5 -Ende (Reporter) - Am 3 Ende: Farbstoff der die Fluoreszenz absorbiert, dadurch es unterdrücken kann (Quencher) - Quencher wirkt nur, wenn es dem Reporter sehr nah ist
46 DETEKTIERUNG MIT TAQ-MAN SONDE Die Taq Polymerase hat die Fähigkeit, einen neuen DNA Strang zu synthetisieren Nukleotide zu entfernen, die ihm im Wege stehen (Exonuklease Aktivität)
47 RT DETEktierung Fluoreszenz -Die Taq-Polymerase schneidet die TaqMan Sonde ab, der Reporter beginnt zu fluoreszieren (kein Quencher in der Nähe) - Die Intensität der Fluoreszenz mit der Menge der neu synthetisierten Ziel-DNA proportional ist
48 Analyles der Produkten I. (melting curve) primer dimer Spezifische Produkte
49 log Analyse II. (Ct: threshold cycle) Plato Phase threshold (Schwelle) Exponentielle Phase Prdukten werden in der exponentielle Phase vergleicht Background (Hintergund) Fluoreszenz
50 Real-Time PCR in Medizin - Expressionanalyse - Behandelte unbehandelte Kranke Gesunde Proben Sensitiver als DNA chip Weniger Proben in dem Gleichem Termin Relatives Kopienzahl kann determiniert werden: Ct
51 Medizinische Anwendung von PCR: Untersuchung auf erbbare Mutationen Diagnose von viralen Infektionen, z. B. Erkennung von HIV, HPV, Herpesvirus, Rotavirus, Calicivirus Diagnose von bakteriellen Infektionen keine Zellkultur benötigt, z. B. Erkennung von TBC, Syphilis, Lepra Prenatale Diagnostik: Proben aus der amniotischen Flüssigkeit Geschlechtsbestimmung Diagnose von vererbbaren Krankheiten durch die Detektion der verursachenden Mutationen (cystische Fibrose, Brustkrebs, Retinoblastoma)
52 54. HAR1 Gehirnentwicklung HAR1 Entstehung der Rinde FOXP2 normales Gemeinsamer Vorfahr Seit 6M J. MENSCH SCHIMPANSE Sprache Seit 300M J. AMY1 Verdauung von Stärkezucker ASPM kleines ASPM Gemeinsamer Vorfahr HUHN Gehirngrösse Glattes Oberfläch HAR1 LCT Verdauung der Laktose HAR2 Entstehung von Handgelenk und Finger Werkzeugbenutzung Gute Verdauung
53 21. FOXP2: Gen der Sprache Articulation und Grammatik 2 Mutationen entstanden seit Jahre Beweise: Eine Punktmutation in dem Foxp2 Gen verursacht Problemen mit Grammatik in einer englischen Familie stumme Mutation Mensch Orangutan Rhesus Gorilla Maus Schimpanse Aminosäueränderung
54 HAR Human accelerated region
55 Die Unterschiede zwischen Genome, Genomkomplexität - Anzahl der Gene und Zellen Anzahl der Gene: Anzahl der Zellen: Mensch: 20 25, Fruchtfliege: 13,500 Fadenwurm: 19,
56 Herunterladbar und durchsuchbar Humanes Genom
57 Menschliches Genom Funktion der menschlichen Genomregionen
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