Chromatographie von Penicillin-G.Natriumsalz / Antibiotikatests

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1 Chromatographie von Penicillin-G.Natriumsalz / Antibiotikatests A. Allgemeines über Antibiotika Bei Antibiotika handelt es sich um Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen, die dazu dienen ihnen eine Nische ohne Fressfeinde zu schaffen. Außerdem werden Antibiotika heutzutage synthetisch bzw. halbsynthetisch hergestellt und werden produziert, um medizinisch gegen bakterielle Infektionen zu wirken. Die Antibiotika wirken entweder wachstumshemmend (bakteriostatisch) oder abtötend (bakterizid) auf die entsprechenden Mikroorganismen (vgl. Meyers Taschenlexikon). Die Wirkung kann spezifisch auf eine Bakteriengruppe gerichtet sein oder gegen eine Vielzahl von Bakterien eingesetzt werden (Breitband-Antibiotika). Man unterscheidet zudem verschiedene Klassen von Antibiotika, die im Folgenden kurz aufgeführt werden sollen. Unter die Klasse der β-lactame fallen unter anderem die Penicilline, die durch A. Fleming 1928 als erstes Antibiotikum entdeckt wurden und 1940 von H. Florey erstmals isoliert werden konnten. Lactame, zum Beispiel das Penicillin wird durch Penicillium notatum produziert. Lactame sind zyklische Amide, wobei der griechische Buchstabe die Ringgröße kennzeichnet (vgl. Beta-Lactam-Antibiotika, unter die neben den Penicillinen auch die Cephalosporine fallen, hemmen die Zellwandsynthese wachsender Bakterien. Cephalosporin C, zum Beispiel, wird durch Cephalosporium acremonium produziert. Sie beeinträchtigen jedoch hauptsächlich nur Abb. 1: Penicillin G das Wachstum von grampositiven Bakterien, da die Lipopolysaccharidschicht von gramnegativen Bakterien für das Penicillin nicht permeabel ist. Das Penicillin verhindert die Quervernetzung der Peptidoglykanketten des Mureins. Es bindet irreversibel an die D-Alanintranspeptidase und stört somit ihre Funktionalität und verhindert eine Neusynthese des Mureins. Es kommt somit zu keiner Teilung. Seite 1 von 10

2 Manche Bakterien sind jedoch in der Lage, die Wirkungsweise von Lactamen durch so genannte Lactamasen zu inhibieren. Die β-lactamase spaltet den Lactamring der beta-lactam-antibiotika, sodass diese ihre hohe Affinität zur Transpeptidase und somit ihre Funktionalität verlieren. Eine weiter Antibiotikaklasse sind die Tetracycline, deren Produzenten meist Streptomyces- Arten sind, wirken gegen grampositive und negative Bakterien. Als Beispiel dieser Breitbandantibiotika sind das Abb. 2: Struktur Tetracycline (vgl. Tetracyclin und das Doxycyclin zu nennen. Tetracycline wirken auf die Biosynthese von Proteinen. Sie verhindern das Anlagern der Aminoacyl-t-RNA an die Akzeptorstelle der 30S Untereinheit. Erythromycin ist ein Vertreter einer weiteren Gruppe von Antibiotika, der Makrolide und wird durch Streptomyces-Arten produziert. Die Makrolide wirken genauso wie die Tetracycline auf die Biosynthese von Proteinen. Allerdings wirken sie auf die 50S Untereinheit der Ribosomen. Sie wirken gleichermaßen auf grampositive wie auch auf gramnegative Bakterien. Als letzte Klasse von Antibiotika seien hier die Aminoglykoside genannt. Als bekannteste Vertreter sind Streptomycin Abb. 3: Erythromycin als Beispiel von und Neomycin zu nennen. Die Makroliden Aminoglykoside bestehen aus Aminozuckern und wirken auf gramnegative Bakterien, jedoch nicht auf gegen gramnegative Anaerobier und Kokken. Sie verursachen durch die Wirkung auf die 30S Untereinheit der Ribosomen einen Ablesefehler und stören somit die Synthese von Proteinen. Deswegen sind die meisten Aminoglykoside bakterizid. Beim Einsatz Seite 2 von 10

3 im menschlichen Körper müssen die Aminoglykoside intravenös verabreicht werden, da sie nicht zellgängig sind. Außerdem werden sie schnell über die Niere ausgeschieden. Einige Bakterien können durch Spontanmutationen gegen Antibiotika resistent werden. Wie bei den Lactamen schon angesprochen worden ist, können Bakterien Abb. 4: Neomycin zum Beispiel Enzyme bilden, um das Antibiotikum abzubauen oder den Antibiotika keine Angriffsflächen bieten (Gramnegative Bakterien). Andere wiederum sind in der Lage das Antibiotikum aktiv aus der Zelle zu pumpen. Außerdem wird durch Änderung der Zellstruktur (z.b. Ribosomen) die Wirkung der Antibiotika aufgehoben. B. Durchgeführte Versuche 1. Chromatographie von Penicillin-G-Natrium-Salz 1.1. Einleitung Die Chromatographie ist ein Analyseverfahren zur Auftrennung von Stoffgemischen. Die Chromatographie hat sich im Laufe der Jahre soweit entwickelt, dass verschiedene Chromatographien entstanden sind. So gibt es die Dünnschichtchromatographie (DC), Papierchromatographie (PC), sowie die in modernen Labors meist angewandte Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC). Das Prinzip der DC liegt bei der Adsorption und der Verteilung der zu trennenden Stoffe. In diesem Versuch wird die Adsorption vernachlässigt. Es soll hier auch keine Trennung eines Stoffgemisches durchgeführt werden, sondern eine Charakterisierung von Penicillin erfolgen. Anhand der DC kann die Polarität unter Verwendung von verschiedenen Laufmitteln, die polare oder eher apolare Eigenschaften aufweisen, bestimmt werden. Als Laufmittel wird Wasser, Methanol, Ethylacetat und Trichlormethan (Chloroform) eingesetzt. Als Maß für die Polarität der zu untersuchenden Substanzen dienen die sich aus den Laufstrecken ergebenden R f Werte. Zur Ermittlung der R f Werte werden die Chromatographien auf Platten mit Seite 3 von 10

4 Indikatorbakterien gelegt, deren Wachstum durch Penicillin gehemmt wird. Nach einem Tag Inkubation bei 37 Celsius entstehen im Bereich des Penicillins Hemmhöfe. Somit lassen sich die R f -Werte anhand der Formel berechnen. ( Entfernung Mittelpunkt der Hemmhöfe vom Startpunkt) R f Wert = ( Entfernung Laufmittelfront vom Startpunkt) 1.2. Material und Methode Der Versuch wurde wie im Skript beschrieben durchgeführt Ergebnisse Anhand der Ergebnisse in Abbildung 5 und der Formel zur Berechnung der R f -Werte konnten diese nach Ermittlung der Entfernungen berechnet werden. Bei dem Wasserchromatogramm hat sich der Teststreifen an dem Rand festgesaugt. Man erkennt aber trotzdem, dass das Penicillin bis zur markierten Stelle gelaufen ist. Abb. 5: Ergebnisse der Chromatographie. Die grauen Zonen markieren den nicht-bewachsenen Bereich der Platte. Die schwarzen Punkte symbolisieren die Mittelpunkte der Hemmhöfe. Seite 4 von 10

5 Tab. 1: Berechnete R f -Werte Mittelpunkt der Hemmhöfe Laufmittelfront Berechneter R f -Wert Wasser 8cm 8,5cm 0,94 Methanol 6,5cm 8,5cm 0,76 Ethylacetat 0,2cm 8,5cm 0,024 Chloroform 1,1cm 8,5cm 0,12 Beispiel der Berechnung: ( Entfernung Mittelpunkt der Hemmhöfe vom Startpunkt) R f Wert = ( Entfernung Laufmittelfront vom Startpunkt) R f (8cm) Wert = = (8,5cm) 0, Diskussion Die Ergebnisse zeigen auf, dass es sich bei Penicillin um eine polare Substanz handeln muss, da die R f -Werte bei Wasser und Methanol als Laufmittel am größten sind. Je größer die R f -Werte sind, desto besser ist die Fähigkeit des Laufmittels die Substanz zu transportieren. Die Substanz wird nur transportiert, wenn sie die gleichen polaren Eigenschaften wie die Laufmittel aufweisen. Penicillin wurde als Penicillin-Natrium-Salz eingesetzt und dissoziert zu positiven Natriumionen und dem negativ geladenen Penicillinion. Zusätzlich gibt die polarisierte Ketogruppe dem Penicillin einen polaren Charakter. Deswegen transportieren die apolaren Substanzen Ethylacetat und Chloroform das polare Penicillin kaum (kleine R f -Werte). 2. Antibiotika-Test Der Lochtest 2.1. Einleitung Der Lochtest ist ein Test, bei dem die Empfindlichkeit von Mikroorganismen (MO) auf Antibiotika untersucht werden kann. In das zentral gestanzte Loch wird ein Tropfen Penicillin (170E/ml) bzw. Wasser als Kontrolle gegeben. Von diesem Loch aus Seite 5 von 10

6 werden verschiedene Mikroorganismen strahlenförmig zum Rand der Schale ausgestrichen. Nach einer Übernachtinkubation kann man erkennen, wie hoch die Wirksamkeit des Antibiotikums auf die MO war. Je näher der Organismus in Richtung des Loches gewachsen ist, desto unempfindlicher ist er gegenüber Penicillin Material und Methode Die detaillierte Beschreibung des Versuchs ist im Skript zu finden. In dem Versuch wurde anstatt Pseudomonas putida Pseudomonas stutzeri eingesetzt. Außerdem wird die Ausgangslösung des Penicillins in der Konzentration 1700 E/ml eingesetzt Ergebnisse Abb. 6: Ergebnisse des Lochtests (schematische Darstellung), links: Kontrolle, rechts: Testplatte Bei der Kontrollplatte ist ein gleichförmiges Wachstum der Organismen aufgetreten. Das Wachstum erfolgt bis an das ausgestanzte und mit Wasser gefüllte Loch. Bei der Testplatte sind nicht alle Organismen bis an das Loch gewachsen. Nur E. coli und Pseudomonas stutzeri zeigen ein ungehemmtes Wachstum. Der Bakterienrasen von Micrococcus luteus und Staphylococcus carnosus ist auf den Plattenrand beschränkt (siehe Abbildung 6 rechts). Seite 6 von 10

7 2.4. Diskussion Wasser hat keinen hemmenden Einfluss auf die Bakterien und dient somit als Kontrolle. Die Testplatte zeigt dagegen ein anderes Bild. Das Penicillin hemmt das Wachstum der grampositiven Organismen Micrococcus luteus und Staphylococcen carnosus. Die gramnegativen Bakterien E. coli und P. stutzeri zeigen keine Wachstumshemmung. Penicillin hemmt die Transpeptidase, die zur Verknüpfung der Peptidoglykanketten des Mureins verantwortlich ist. Somit wird das Zellwachstum durch eine Inhibierung der Zellwandsynthese gehemmt. Dies hat auf gramnegative Bakterien keinen Einfluß, da das Penicillin nicht durch die äußere Zellwand der Bakterien diffundieren kann. Die Bakterien zeigen ein unverändertes Wachstum. Nimmt die Konzentration zum Plattenrand wieder ab, kommt es wieder zum Wachstum der grampositiven Organismen. 3. Antibiotika-Test Gradientenplatte 3.1. Einleitung Bei diesem Test wird Agar ohne Antibiotikum in eine schräg gestellte Petrischale gegossen und nach dem Erstarren ein antibiotikahaltiger Agar in die nun horizontal gestellte Petrischale gegossen. Somit entsteht ein Antibiotikagradient. Der antibiotikahaltige Agar wird in verschiedenen Konzentrationen eingesetzt. Die Ausgangslösung des Penicillins beträgt 1700E/ml. Diese Lösung wird in 10er Stufen bis zur Verdünnungstufe 10-2 verdünnt. Auf den Gradientenplatten wird eine Staphylcoccenkultur ausplattiert und 24 Stunden bei 37 C inkubiert. Anhand der sich gebildeten Kolonien kann eine Aussage über die Wirksamkeit des Antibiotikums auf die Staphylococcen getroffen werden Material und Methode siehe Skript 3.3. Ergebnisse Die Platten des Gradiententests mit dem antibiotikahaltigen Agar in den Verdünnungsstufen bis 10-1 zeigen auf der gesamten Platte kein Wachstum. Seite 7 von 10

8 Abb. 8: Platten mit dem antibiotikahaltigen Agar in der Verdünnungsstufe 10 0 Abb. 9: Platten mit dem antibiotikahaltigen Agar in der Verdünnungsstufe 10-1 Abb. 10: Ergebnisse der Gradientenplatte der Verdünnungsstufe Der Pfeil zeigt den Antibiotika- Gradienten an. Seite 8 von 10

9 Abb. 11: Kontroll-Platte Die Platte in Abbildung 10 zeigt ein Wachstum nur auf der Seite, auf der die Antibiotika-Konzentration niedriger ist. Auffällig sind die vereinzelten Kolonien, die neben dem dichten Bakterienrasen auch noch bei höherer Antibiotika-Konzentration wachsen. In Abbildung 11 ist die Kontrollplatte gezeigt. Die gesamte Platte ist mit Bakterien überwachsen Diskussion Bei den Gradientenplatten, bei denen Agar mit den Verdünnungsstufen 10 0 und 10-1 eingesetzt wurde, tritt wegen der zu hohen Konzentration des Antibiotikums kein Wachstum auf. Bei der 10-2 Verdünnung tritt nur bei niedriger Konzentration ein Wachstum auf, da dort die Synthese der Zellwand durch Penicillin nicht beeinflusst wird (siehe auch 2.4.). Wird die Konzentration jedoch mit dem Gradienten höher, tritt keine Vermehrung der Zellen auf. Nur einzelne Kolonien entstehen bis zur Mitte der Platte. Man kann vermuten, dass es sich bei den Kolonien um Spontanmutationen handelt, die eine Resistenz gegen Penicillin gebildet haben. Eine weitere Möglichkeit wäre eine Kontamination mit gramnegativen Organismen. Seite 9 von 10

10 4. Literatur Madigan, M.: Brock. Mikrobiologie, Heidelberg, 2001 Meyers Grosses Taschenlexikon, Band 2, 5. überarbeitete Auflage, B. I. Taschenbuchverlag, Mannheim, 1995 Schlegel, Hans G.: Allgemeine Mikrobiologie, 7. überarbeitete Auflage, Thieme Verlag, Stuttgart, 1992 Skript Übungen in Mikrobiologie F1-Teil2a Internetquellen: Seite 10 von 10