Dissertation. von Daniel Heiko Niemiiller aus Osterholz-Scharmbeck

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Kristina Stein
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1 Vergleichende Lokalisation der Homospermidin-Synthase, Eingangsenzym der Pyrrolizidin-Alkaloid-Biosynthese, in verschiedenen Vertretern der Boraginaceae Von der Fakultat fur Lebenswissenschaften der Technischen Universitat Carblo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr, rer. nat.) genehmigte Dissertation von Daniel Heiko Niemiiller aus Osterholz-Scharmbeck

Lebenswissenschaften der Technischen Universitat Carblo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des

2 Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis V VII 1 Einleitung Die Pytrolizidin-Alkaloide als typische pflanzliche Sekundarstoffe Orte der Biosynthese Verteilung und Speicherung der PAs in der Pfianze Toxizitat der PAs Chemische Okologie Die Homospermidinsynthase - das Eingangsenzym der PA-Biosynthese Reaktionsmechanismus der HSS Evolution der HSS Problemstellung 13 2 Material und Methoden Chemikalien, Kits, Enzyme und spezielle Materialien Pflanzenmaterial Molekularbiologische Techniken Klonierung und Expression von 6xHis-Tag markierten Proteinen Einfuhrung des 6xHis-Tag-Motives durch PGR Agarose Gelelektophorese von Nucleinsauren Quantifizierung von Nukleinsauren Klonierung Transformation Herstellen kompetenter Zellen Transformation kompetenter Zellen Isolierung von Plasmid-DNA Heterologe Expression in E. cali Proteinchemische Methoden Quantifizierung, Umpufferung, Aufkonzentrierung und Failung von Proteinen Denaturierende SDS-Polyacrylamidgelelektophorese (SDS-PAGE) Proteinfarbungen Coomassie Faibung Indian-Ink Piirbimg 31

3 Problemstellung 13 2 Material und Methoden 14 2.1 Chemikalien, Kits, Enzyme und spezielle Materialien 14 2.2 Pflanzenmaterial 14 2.3 Molekularbiologische Techniken 16 2.3.1 Klonierung und Expression von 6xHis-Tag markierten Proteinen.

3 Inhaltsverzeichnis Reinigung der rekombinanten HSS und DHS fiber Metallchelatchromatographie Gewinnung des rekombinanten Proteins Ni-Affinitatschromatographie., Co-Affinitatschromatographie Immunologische und mikroskopische Techniken Immunisierung Affinitatsreinigung der Antikorper iiber CNBr-aktivierte Sepharose mit immobilisiertem Protein Western Blot Isolierung von loslichem Gesamtprotein Semi-Dry Elektroblot Detektion, Exposition und Dokumentation Dotblot Preparation und Immunodetektion von Kunsth&rzschnittea Fixierung der pflanzlichen Gewebe Einbettung in Technovit 7100 fur die Lichtmikroskopie Einbettung in Unicryl fur die Elektronenmikroskopie Schneiden der Gewebeblockchen FITG-Markierung fur die Fluoreszenzmikroskopie Immunogold-Markierung fur die Lichtmikroskopie Immunogold-Markierung fur die Elektronenmikroskopie. 45 > Ergebnisse Gewebespezifische Expression der HSS in Cynoglossum officinale Reinigung der rekombinanten HSS und DHS aus Gynoglossum of ficinale Spezifitatsanalyse des affinitatsgereinigten HSS-Antikorpers gegen die DHS im Western Blot Expressionsanalyse dnrch Western Blot Untersuchung von Keimlingen durch Western Blot Imrmmolokalisation der HSS auf zellularer Ebene in den Wurzeln von Cynoglossum officinale Kontrollversuche zur Spezifitat der Markierung Gewebespezifisehe Expression der HSS in Symphytum officinale Reinigung der rekombinanten HSS und DHS aus Symphytum officinale., 0Q Spezifitatsanalyse des af&nitatsgereinigten HSS-Antikorpers gegen die DHS im Western Blot Expressionsanalyse durch Western Blot Expressionsanalyse der HSS im jungen Blatt 70

5.3.2 Semi-Dry Elektroblot 37 2.5.3.3 Detektion, Exposition und Dokumentation 38 2.5.4 Dotblot 39 2.5.5 Preparation und Immunodetektion von Kunsth&rzschnittea... 40 2.5.5.1 Fixierung der pflanzlichen Gewebe 40 2.

4 Inhaltsverzeichnhs III Immunolokalisation der HSS auf zellularer Ebene in den Wurzeln von Symphytum officinale Immunolokalisation der HSS auf zellularer Ebene im jungen Blatt von Symphytum officinale ,5.1 Kontrollversuche zur Spezifitat der Markierung von S. offficinalis Wurzeln Gewebespezifische Expression der HSS in Heliotropium indicurn Reinigung der rekombinanten HSS und DHS aus Heliotropinm indicum Spezifitatsanalyse des affinitatsgereinigten HSS-Antikorpers gegen die DHS im Western Blot Expressionsanalyse durch Western Blot Untersuchung der HSS-Expression in verschiedenen Blattstadien von H. indicum Immunolokalisation der HSS in den jungen Slattern von Heliotropium indicum Kontrollversuche zur Spezifitat der Markierung Immunolokalisation der HSS im jungen SproC von Heliotropium indicum Kontrollversuche zur Spezifitat der Markierung Subzellulare Lokalisation Gewebespezifische Expression der HSS in Senecio jacobaea Reinigung der rekombinanten HSS und DHS aus Senecio jacobaea Spezifitatsanalyse des affinitatsgereinigten HSS-Antikorpers gegen die DHS im Western Blot Expressionsanalyse durch Western Blot Immunolokalisation der HSS auf zellularer Ebene in den Wurzeln von Senecio jacobaea Kontrollversuche zur Spezifitat der Markierung Proteolytische Spaltung der HSS als Artefakt bei Western Blots Diskussion Vergleich der Expressionsmuster der HSS Kreuzreaktivitat des HSS-Antikorpers mit der DHS Abbau der HSS Vergleich RT-PCR und Western Blot Gynoglossum officinale Symphytum officinale Heliotropium indicum Senecio jacobaea Vergleich der HSS-Expression mit anderen Enzymen des Sekundarstoffwechsels..., 131

3.2 Spezifitatsanalyse des affinitatsgereinigten HSS-Antikorpers gegen die DHS im Western Blot 80 3.3.3 Expressionsanalyse durch Western Blot 81 3.3.3.1 Untersuchung der HSS-Expression in verschiedenen Blattstadien von H.

5 IV Inhaltsverzeichnis 4.2 Ausblick Ziisaminenfassung 141

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