Untersuchung adaptiver Vorgänge an den Photorezeptor-Bandsynapsen

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1 Untersuchung adaptiver Vorgänge an den Photorezeptor-Bandsynapsen Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Michaela Fuchs aus Nürnberg

2 Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink Erstberichterstatter: Prof. Dr. Johann Helmut Brandstätter Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Jan Kremers

3 Anmerkungen Die vorliegende Arbeit enthält Daten, die in Zusammenarbeit mit Frau Anna Sendelbeck im Rahmen ihrer Masterarbeit gewonnen wurden.

4 Verzeichnisse Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Die Retina Synapsen der Retina Elektrische Synapsen Chemische Synapsen Die aktive Zone chemischer Synapsen Bandsynapsen der Retina Molekularer Aufbau des Bandsynapsen-Komplexes Strukturelle Plastizität der Bandsynapse Fragestellung und Arbeitshypothese Ergebnisse Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen synaptischer Bänder Färbungen der präsynaptischen Proteine RIBEYE und Bassoon Struktur der synaptischen Bänder Färbungen der präsynaptischen Proteine Piccolo und Cacna1f Ultrastrukturelle Untersuchungen synaptischer Bänder Schnittebenen durch Photorezeptor-Bandsynapsen und deren Erscheinungsformen Ultrastruktur der synaptischen Bänder in wildtypischen C57BL/6-Mäusen Ultrastruktur der synaptischen Bänder in Balb/c-Mäusen Ultrastruktur der synaptischen Bänder in B6 c-2j -Mäusen Vergleich der ultrastrukturellen Veränderungen Ultrastruktur der synaptischen Bänder in Zapfen-Photorezeptoren Räumliche Ausdehnung der synaptischen Bänder und aktiven Zonen Höhe der synaptischen Bänder in C57BL/6-Mäusen Höhe der synaptischen Bänder in Balb/c- und B6 c-2j -Mäusen Länge der synaptischen Bänder und aktiven Zonen in C57BL/6-Mäusen Länge der synaptischen Bänder und aktiven Zonen in Balb/c-Mäusen Circadiane Abhängigkeit der Höhe und Länge der synaptischen Bänder und der Länge der aktiven Zonen in C57BL/6-Mäusen Genexpression präsynaptischer Proteine Proteinmengen präsynaptischer Proteine Endocytose Ausdehnung der postsynaptischen Invaginationen Vesikelverteilung am synaptischen Band i

5 Verzeichnisse 3 Diskussion Strukturelle Veränderungen synaptischer Bänder von Stäbchen-Photorezeptoren sind abhängig vom Mausstamm Der Albinismus ist nicht der Grund für die strukturellen Veränderungen synaptischer Bänder von Stäbchen-Photorezeptoren in Balb/c-Mäusen ERG-Messungen an pigmentierten und albinotischen Mäusen zeigen eine Fehlfunktion in der Retina von Balb/c-Mäusen Strukturelle Veränderungen synaptischer Bänder als Zeichen von Degeneration Die strukturellen Veränderungen synaptischer Bänder betreffen die Proteine des Bandkompartiments Lichtabhängige Veränderungen in der Genexpression und den Proteinmengen präsynaptischer Proteine an den Photorezeptor-Bandsynapsen Endocytose in Photorezeptoren Lichtabhängige Veränderungen in der Ausdehnung der postsynaptischen Invaginationen Vesikelverteilung am synaptischen Band Fazit Material und Methoden Chemikalien und Bezugsfirmen Verwendete Lösungen Verwendete Antikörper Verwendete Geräte und Hilfsmittel Versuchstiere Fluoreszenzmikroskopie Präparation der Retina, Fixierung und Anfertigen von Gefrierschnitten Immunzytochemische Färbungen Lichtmikroskopische Analyse Elektronenmikroskopie Fixierung für gute Gewebeerhaltung Elektronenmikroskopische Analyse und Quantifizierung Messung der postsynaptischen Invaginationen Analyse der Vesikelverteilung am synaptischen Band PCR-Analysen Laser-Mikrodissektion RNA-Isolation und cdna-synthese Quantitative Real-Time PCR Western Blot Analysen Herstellung von Protein-Lysaten ii

6 Verzeichnisse Bestimmung der Proteinkonzentration SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Western Blot Transfer und Analyse Statistik Zusammenfassung 93 6 Summary 95 7 Literaturverzeichnis 97 8 Danksagung Eidesstattliche Erklärung Publikationen 108 iii

7 Verzeichnisse Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Schematische Darstellung der Säugerretina... 2 Abbildung 2: Elektrische Synapse... 4 Abbildung 3: Konventionelle chemische Synapse der Retina... 5 Abbildung 4: Proteininteraktionen an der aktiven Zone chemischer Synapsen... 7 Abbildung 5: Photorezeptor-Bandsynapse Abbildung 6: Modell einer Photorezeptor-Bandsynapse Abbildung 7: Elektronenmikroskopische Aufnahmen verschiedener Erscheinungsformen synaptischer Bänder Abbildung 8: Doppelfärbungen von RIBEYE und Bassoon in C57BL/6 und Balb/c-Mäusen Abbildung 9: Doppelfärbungen von RIBEYE und Bassoon in C57BL/6 und Balb/c-Mäusen nach einem Dunkel- bzw. Hellstimulus Abbildung 10: Immuncytochemische Auswertung der synaptischen Bänder in C57BL/6-Mäusen Abbildung 11: Immuncytochemische Auswertung der synaptischen Bänder in Balb/c-Mäusen Abbildung 12: Erscheinungsformen synaptischer Bänder nach Helladaptation Fluoreszenzmikroskopie Abbildung 13: Doppelfärbungen von Piccolo und Cacna1f in C57BL/6-und Balb/c-Mäusen Abbildung 14: Schnittebenen durch das synaptische Band in Photorezeptoren Abbildung 15: Anschnitte nicht gewerteter Terminalien Abbildung 16: Erscheinungsformen synaptischer Bänder Abbildung 17: Elektronenmikroskopische Auswertung der synaptischen Bänder in C57BL/6-Mäusen Abbildung 18: Elektronenmikroskopische Auswertung der synaptischen Bänder in Balb/c-Mäusen Abbildung 19: Elektronenmikroskopische Auswertung der synaptischen Bänder in B6 c-2j -Mäusen Abbildung 20: Erscheinungsformen synaptischer Bänder nach Helladaptation Elektronenmikroskopie Abbildung 21: Erscheinungsformen synaptischer Bänder in Zapfen-Photorezeptoren nach Helladaptation Abbildung 22: Höhe der synaptischen Bänder in C57BL/6-Mäusen Abbildung 23: Höhe der synaptischen Bänder in Balb/c- und B6 c-2j -Mäusen Abbildung 24: Längenausdehnung der synaptischen Bänder und aktiven Zonen in C57BL/6-Mäusen Abbildung 25: Längenausdehnung der synaptischen Bänder und aktiven Zonen in Balb/c-Mäusen Abbildung 26: Ausdehnung der synaptischen Bänder und aktiven Zonen in helladaptierten C57BL/6-Mäusen Abbildung 27: Genexpression in hell- und dunkeladaptierten Photorezeptoren Abbildung 28: Genexpression in Photorezeptoren nach einem Dunkelstimulus Abbildung 29: Western Blot Analyse hell- und dunkeladaptierter Retinae für Bassoon Abbildung 30: Western Blot Analyse hell- und dunkeladaptierter Retinae für Piccolino Abbildung 31: Western Blot Analyse hell- und dunkeladaptierter Retinae für Cacna1f iv

8 Verzeichnisse Abbildung 32: Western Blot Analyse hell- und dunkeladaptierter Retinae für RIBEYE Abbildung 33: Endocytotische Vesikel nach Dunkeladaptation Abbildung 34: Ausdehnung der postsynaptischen Invaginationen Abbildung 35: Form der postsynaptischen Invaginationen Abbildung 36: Vesikelverteilung am synaptischen Band in Stäbchen-Photorezeptoren von C57BL/6-Mäusen Abbildung 37: Vesikelverteilung am synaptischen Band in Zapfen-Photorezeptoren Abbildung 38: Zeitschema zu den Adaptationszeiten Abbildung 39: Messung der Ausdehnung der postsynaptischen Invaginationen Abbildung 40: Verteilung der Vesikel am synaptischen Band Abbildung 41: Laser-Mikrodissektion Abbildung 42: Auftrennung der PCR-Amplifikate auf einem 1,5%igen Agarose-Gel Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Ausdehnung der synaptischen Bänder und aktiven Zonen in helladaptierten C57BL/6-Mäusen Tabelle 2: Chemikalien und Bezugsfirmen Tabelle 3: Verwendete Lösungen Tabelle 4: Verwendete Primärantikörper Tabelle 5: Verwendete Sekundärantikörper Tabelle 6: Verwendete Geräte und Hilfsmittel Tabelle 7: Primer für die quantitative Real-Time PCR Tabelle 8: Zusammensetzung der SDS-Gele Abkürzungsverzeichnis C Grad Celsius µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer µv Mikrovolt ANOVA Varianzanalyse (englisch: analysis of variance) APS Ammoniumperoxodisulfat Aqua bidest. lateinisch: Aqua bidestillata AZ Amakrinzelle B6 c-2j B6(Cg)-Tyr c-2j /J BARS englisch: brefeldin A-dependent ADP-ribosylation substrate BCA Bicinchoninsäure (englisch: acid) brmunc13-2 hirnspezifisch exprimiertes Munc13-2 (englisch: brain Munc13-2) BSA bovines Serumalbumin BZ Bipolarzelle v

9 Verzeichnisse Calcium CABP4 englisch: calcium binding protein 4 CAST englisch: CAZ-associated structural protein Ca v 1.4 englisch: calcium channel, voltage-dependent, L type, α1f subunit (Cacna1f) CAZ Cytomatrix an der aktiven Zone (englisch: cytomatrix at the active zone) cd/m 2 Candela pro Quadratmeter cdna komplementäre DNA (englisch: complementary DNA) Cplx Complexin CtBP englisch: C-terminal binding protein D Dunkeladaptation DAPI 4,6-Diamidin-2-phenylindol DNA Desoxyribonukleinsäure (englisch: acid) DS Dunkelstimulus dt Desoxythymidin DTT 1,4-Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraessigsäure (englisch: acetic acid) EGTA Ethylenglycoltetraessigsäure (englisch: acetic acid) ELKS hoher Gehalt an Glutamat (E), Leucin (L), Lysin (K) sowie Serin (S) Erc englisch: ELKS/Rab6-interacting/CAST family member ERG Elektroretinogramm Ex Exon g Gramm g Erdbeschleunigung (englisch: gravity) GCAP englisch: guanylate cyclase activating proteins GCL Ganglienzellschicht (englisch: ganglion cell layer) gp Meerschweinchen (englisch: guinea pig) gt Ziege (englisch: goat) GZ Ganglienzelle H Helladaptation HRP Meerrettichperoxidase (englisch: horseradish peroxidase) HS Hellstimulus HZ Horizontalzelle INL innere nukleäre Schicht (englisch: inner nuclear layer) IPL innere plexiforme Schicht (englisch: inner plexiform layer) IS innere Segmente (englisch: inner segments) kda Kilo-Dalton KIF3A englisch: Kinesin family member 3A M Molar ma Milliampere ml Milliliter mm Millimeter mm Millimolar mrna englisch: messenger RNA ms Maus (englisch: mouse) ms Millisekunden Munc13 englisch: mammalian uncoordinated 13 n Anzahl der Stichproben NFL Nervenfaserschicht (englisch: nerve fiber layer) NGS normales Ziegenserum (englisch: normal goat serum) vi Ca 2+

10 Verzeichnisse nm Nanometer ONL äußere nukleare Schicht (englisch: outer nuclear layer) OPL äußere plexiforme Schicht (englisch: outer plexiform layer) OS äußere Segmente (englisch: outer segments) p Signifikanzwert (p-wert; von englisch: probability) PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PB Phosphatpuffer (englisch: phosphate buffer) PBS phosphatgepufferte Salzlösung (englisch: phosphate buffered saline) PCR Polymerasekettenreaktion (englisch: polymerase chain reaction) PE Pigmentepithel PFA Paraformaldehyd ph Säuregrad (lateinisch: potentia hydrogenii) PhR Photorezeptor PI Protease-Inhibitor PSD postsynaptische Dichte (englisch: postsynaptic density) PVDF Polyvinylidenfluorid rb Kaninchen (englisch: rabbit) RIM englisch: Rab3 interacting molecule RNA Ribonukleinsäure (englisch: ribonucleic acid) Rpe65 englisch: retinal pigment epithelium-specific 65 kda protein RT Raumtemperatur SDS Natriumdodecylsulfat (englisch: sodium dodecyl sulfate) SNAP-25 englisch: synaptosomal associated protein of 25 kda SNARE englisch: soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment protein receptor TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer TBS trisgepufferte Salzlösung (englisch: Tris buffered saline) TBS-T trisgepufferte Salzlösung mit Tween 20 (englisch: Tris buffered saline Tween) TCA Trichloressigsäure (englisch: acetic acid) TEMED Tetramethylethylendiamin TRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan t-snare englisch: target SNARE tulp1 englisch: tubby-related protein 1 ubmunc13-2 ubiquitär exprimiertes Munc13-2 V Volt v-snare englisch: vesicle SNARE vii

11 Einleitung 1 Einleitung Als sensorischer Teil des Auges ist die Retina die erste Verarbeitungsstelle für Lichtsignale und bildet somit die Grundlage für die visuelle Wahrnehmung. Die Stäbchen- und Zapfen-Photorezeptoren sind hochspezialisierte sensorische Neurone mit zwei strukturell abgegrenzten Kompartimenten, die auch unterschiedliche Funktionen übernehmen. In den Außensegmenten der Photorezeptoren findet die Phototransduktion statt. Photonen werden absorbiert und in Änderungen des Membranpotentials übersetzt. Die Terminalien der Photorezeptoren mit den Bandsynapsen wandeln dieses elektrische Signal in ein chemisches um und übertragen es an die nachgeschalteten Zellen (Gießl et al., 2010). Die Retina liefert uns vom schwachen Licht der Dämmerung mit nur wenigen Photonen bis hin zum hellen Tageslicht mit Milliarden von Photonen ein konstantes Bild unserer Umwelt. Auf allen Ebenen der Signalverarbeitung finden sich in der Retina Anpassungsmechanismen, die zur Adaptation an sich ändernde Lichtbedingungen beitragen. Photorezeptoren können sich in ihrer Aktivität ständig den vorherrschenden Lichtverhältnissen anpassen. Einerseits sind sie hoch empfindlich und können bereits einzelne Photonen wahrnehmen, zum anderen übertragen sie zuverlässig eine große Breite an Lichtintensitäten. Ein Teil der Adaptation an diese verschiedenen Lichtbedingungen findet bereits in der Phototransduktionskaskade statt und sorgt für graduierte Änderungen des Membranpotentials der Photorezeptoren. Die Photorezeptor-Bandsynapse ist die erste Synapse im Sehsystem und gehört zu den leistungsfähigsten und komplexesten chemischen Synapsen im Zentralnervensystem. Sie ist darauf spezialisiert, schnell und kontinuierlich große Mengen an Transmitter freizusetzen und die Freisetzungsrate schnell an die sich ändernden Lichtbedingungen anzupassen. Es ist jedoch noch weitestgehend unbekannt, wie sie ihre Funktionen erfüllt und welche Mechanismen zur Adaptation an den Bandsynapsen der Photorezeptoren beitragen. 1

12 Einleitung 1.1 Die Retina Die Säugerretina ist ein dünnes neuronales Gewebe, welches den Augenhintergrund auskleidet. Als Teil des zentralen Nervensystems leistet sie einen enormen Beitrag zur Verarbeitung visueller Information. Lichtsignale werden von den Zapfen- und Stäbchen-Photorezeptoren absorbiert und in ein elektrisches Signal übersetzt (Stryer, 1986). Dieses wird an den Synapsen der Photorezeptoren in ein chemisches Signal umgewandelt, welches an die nachgeschalteten Bipolarzellen und schließlich an die Ganglienzellen übertragen wird. Die Axone der Ganglienzellen bilden den Sehnerv, welcher die Information an die höheren visuellen Zentren im Gehirn weiterleitet. Die laterale Verschaltung in der Retina erfolgt über Horizontal- und Amakrinzellen (Rodieck, 1998). Abbildung 1: Schematische Darstellung der Säugerretina PE = Pigmentepithel (englisch: pigment epithelium) OS = äußere Segmente der Photorezeptoren (englisch: outer segments) IS = innere Segmente der Photorezeptoren (englisch: inner segments) ONL = äußere nukleäre Schicht (englisch: outer nuclear layer) OPL = äußere plexiforme Schicht (englisch: outer plexiform layer) INL = innere nukleäre Schicht (englisch: inner nuclear layer) IPL = innere plexiforme Schicht (englisch: inner plexiform layer) GCL = Ganglienzellschicht (englisch: ganglion cell layer) NFL = Nervenfaserschicht (englisch: nerve fiber layer) (Verändert nach Kolb, 2011) 2

13 Einleitung Abbildung 1 zeigt schematisch den Aufbau der Säugerretina und deren synaptische Organisation. Man unterscheidet zwei Arten von Photorezeptoren die Stäbchen- Photorezeptoren, die eine höhere Lichtempfindlichkeit haben und für das Dämmerungs- und Nachtsehen (skotopisches Sehen) zuständig sind und die Zapfen- Photorezeptoren für das Tages- und Farbensehen (photopisches Sehen). In den lichtsensitiven Außensegmenten der Photorezeptoren (OS, englisch: outer segments), die aus dicht gepackten Membranscheiben (Disks) bestehen, findet die Phototransduktion statt (Stryer, 1986; Gießl et al., 2010). Photonen werden von Sehpigmenten absorbiert, welche in den Diskmembranen eingelagert sind. Das Sehpigment in Stäbchen ist Rhodopsin, während Zapfen je nach Spezies bis zu drei und mehr verschiedene Sehpigmente besitzen. In der Mausretina gibt es zwei verschiedene Zapfen-Opsine, die ihre Absorptionsmaxima im blauen und im grünen Spektrum haben (Jacobs et al., 1991). Über das Verbindungscilium ist das Außensegment mit dem stoffwechselaktiven Teil der Photorezeptoren, dem Innensegment (IS, englisch: inner segment), verbunden. Die Zellkörper der Photorezeptoren bilden die äußere nukleäre Schicht (ONL, englisch: outer nuclear layer), in der äußeren plexiformen Schicht (OPL, englisch: outer plexiform layer) erfolgt die synaptische Verschaltung auf die Bipolarzellen und Horizontalzellen. Die innere nukleäre Schicht (INL, englisch: inner nuclear layer) beinhaltet die Zellkörper der Horizontal-, Bipolar-, und Amakrinzellen. Des Weiteren findet man in der INL die Zellkörper der Müllerzellen. Diese sind spezialisierte Gliazellen, die die gesamte Retina durchspannen und eine Reihe wichtiger Funktionen besitzen. Sie haben Struktur- und Stützfunktion, versorgen die retinalen Nervenzellen mit Nährstoffen, entsorgen Stoffwechsel-Abfallprodukte und sind an der Modulation der synaptischen Übertragung beteiligt. Zudem schützen sie die Neuronen, indem sie überschüssige Neurotransmitter aufnehmen. Auch extrazelluläre K + -Ionen werden von den Müllerzellen aufgenommen und in der Retina umverteilt (Reichenbach & Robinson, 1995; Newman & Reichenbach, 1996). In der inneren plexiformen Schicht (IPL, englisch: inner plexiform layer) erfolgt die Verschaltung der Bipolarzellen auf die Ganglien- und die quervernetzenden Amakrinzellen. Die Zellkörper der Ganglienzellen bilden die Ganglienzellschicht (GCL, englisch: ganglion cell layer), während deren Axone die Nervenfaserschicht (NFL, englisch: nerve fiber layer) und schließlich den Sehnerv bilden. 3

14 Einleitung 1.2 Synapsen der Retina Die Kommunikation zwischen Nervenzellen erfolgt über Synapsen. In der Retina gibt es zwei Arten von chemischen Synapsen die konventionellen chemischen Synapsen der Amakrinzellen und Horizontalzellen und die Bandsynapsen in den Terminalien von Photorezeptoren und Bipolarzellen. Zapfen-Photorezeptoren besitzen eine zusätzliche Art von chemischer Synapse, die so genannten flat contacts, über die das Signal an die OFF-Bipolarzellen weitergeleitet wird (Missotten, 1965; Dowling & Boycott, 1966; Kolb, 1970). Viele Neurone der Netzhaut sind auch über elektrische Synapsen miteinander verbunden (Wässle & Boycott, 1991; Veruki & Hartveit, 2002a, 2002b) Elektrische Synapsen Ein einfacher Typ von Synapse ist die elektrische Synapse (Abbildung 2). Aus Proteinuntereinheiten gebildete Kanäle in der Zellmembran, so genannte Gap junctions, sorgen für eine Kopplung der zytoplasmatischen Kompartimente benachbarter Zellen und ermöglichen die ungerichtete, passive Diffusion von Ionen und Molekülen. Eine Gap junction wird aus zwei Halbkanälen (Connexonen) gebildet, wobei jede der beteiligten Zellen einen Halbkanal beisteuert. Ein Connexon besteht aus sechs Untereinheiten, den Connexinen (Lampe & Lau, 2004). Abbildung 2: Elektrische Synapse Die zytoplasmatischen Kompartimente zweier Zellen sind über Gap junctions verbunden. Eine Gap junction wird von zwei Halbkanälen (Connexonen) gebildet, die wiederum aus jeweils sechs Connexin-Untereinheiten aufgebaut sind. (Verändert nach Kandel et al., 1995) 4

15 Einleitung Chemische Synapsen An chemischen Synapsen (Abbildung 3) wird das Signal nur in eine Richtung weitergeleitet. Dabei gibt es keinen direkten Kontakt zwischen der präsynaptischen und der postsynaptischen Zelle, welche durch den 20 bis 50 nm breiten synaptischen Spalt getrennt sind. Abbildung 3: Konventionelle chemische Synapse der Retina Schema (links) und elektronenmikroskopische Aufnahme (rechts) einer konventionellen chemischen Synapse. Die Anhäufungen synaptischer Vesikel an der aktiven Zone (Pfeile) der präsynaptischen Amakrinzelle (AZ) sind deutlich zu erkennen. In der postsynaptischen Amakrin- oder Ganglienzelle (GZ) markieren die Pfeilspitzen die postsynaptische Dichte. Die Exocytose erfolgt an chemischen Synapsen in der Regel phasisch. Eine Änderung des Membranpotentials der präsynaptischen Zelle führt zum Öffnen spannungsgesteuerter Ca 2+ -Kanäle und zum Anstieg der intrazellulären Ca 2+ - Konzentration. Dieser Anstieg resultiert in Konformationsänderungen der Proteine des SNARE-Komplexes (englisch: soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors) und der SNARE-vermittelten Fusion synaptischer Vesikel mit der präsynaptischen Membran (Schweizer et al., 1995; Chen & Scheller, 2001; Jahn et al., 2003; Südhof, 2004; Jahn & Scheller, 2006). Der SNARE-Komplex besteht aus den sogenannten v-snares (englisch: vesicle SNAREs), den Vesikelassoziierten SNARE-Proteinen, sowie den t-snares (englisch: target SNAREs) in der Zielmembran. Der Ca 2+ -Sensor Synaptotagmin stabilisiert den SNARE-Komplex bei Eintritt von Ca 2+ (Fernández-Chacón et al., 2001; Chapman, 2002; Koh & Bellen, 2003). 5

16 Einleitung Nach Fusion mit der präsynaptischen Plasmamembran schütten die Vesikel Neurotransmitter in den synaptischen Spalt aus, welcher an die postsynaptische Membran diffundiert und dort an spezifische Rezeptoren bindet. Die Rezeptoren sind entweder selbst Ionenkanäle (ionotrop) oder sorgen über eine Second-Messenger- Kaskade indirekt für das Öffnen oder Schließen von Ionenkanälen (metabotrop), wodurch in der postsynaptischen Zelle eine Änderung des Membranpotentials ausgelöst wird. Die Vesikel werden durch Endocytose in der Präsynapse zurückgewonnen. Ultrastrukturell sind konventionelle chemische Synapsen durch eine Ansammlung synaptischer Vesikel an der präsynaptischen Membran und ein elektronendichtes Netzwerk von Proteinen in der Postsynapse, die postsynaptische Dichte (PSD), gekennzeichnet. Die PSD dient unter anderem dazu, die Neurotransmitter- Rezeptoren gegenüber der Präsynapse zu verankern (Siekevitz, 1985; Kennedy, 1997) Die aktive Zone chemischer Synapsen Die SNARE-vermittelte Fusion synaptischer Vesikel erfolgt an der aktiven Zone, einem hochspezialisierten Bereich der präsynaptischen Plasmamembran (Landis et al., 1988; Burns & Augustine, 1995). Die aktive Zone besitzt ein komplexes Netzwerk aus Cytomatrix-Proteinen, welches als Cytomatrix an der aktiven Zone (CAZ, englisch: cytomatrix at the active zone) bezeichnet wird und dazu beiträgt, den Vesikelzyklus räumlich und zeitlich zu organisieren (Garner et al., 2000; Dresbach et al., 2001; Schoch und Gundelfinger, 2006). Eine wichtige Funktion der Proteine der aktiven Zone ist das Vorbereiten der synaptischen Vesikel für die Exocytose. Es werden hier traditionell zwei Prozesse unterschieden: Das Anlagern der Vesikel an die Membran (Docking) und das Priming, ein Prozess, welcher die Vesikel für die Exocytose vorbereitet (Schweizer et al., 1995). Das morphologisch sichtbare Docking der Vesikel und das funktionelle Priming stellen jedoch vermutlich den gleichen molekularen Prozess dar, der durch die Bildung des SNARE-Komplexes herbeigeführt wird (Siksou et al., 2009). Eine Reihe von Multidomänen-Proteinfamilien ist am Aufbau der CAZ beteiligt. Dazu gehören die Munc13-Proteine, die RIM-Proteine, die CAST-Proteine, die Liprin- 6

17 Einleitung α-proteine sowie Piccolo und Bassoon, welche direkt oder indirekt interagieren und so ein Netzwerk für Interaktionen mit anderen regulatorischen Proteinen der aktiven Zone bilden (Abbildung 4; Schoch & Gundelfinger, 2006). Abbildung 4: Proteininteraktionen an der aktiven Zone chemischer Synapsen Die aktive Zone besteht aus einem komplexen Protein-Netzwerk, welches die Exo- und Endocytose räumlich und zeitlich organisiert. Die gelb hinterlegten Proteine sind Teil der Cytomatrix an der aktiven Zone (CAZ, englisch: cytomatrix at the active zone). (Verändert nach Schoch & Gundelfinger, 2006) Munc13 (Abbildung 4) In Vertebraten codieren vier Gene für die Proteine Munc13-1 bis -4. Durch alternatives Spleißen entstehen die beiden Munc13-2-Isoformen, ubmunc13-2 und brmunc13-2 (Betz et al., 2001). Munc13-Proteine regulieren den Aufbau des SNARE- Komplexes und tragen somit dazu bei, synaptische Vesikel für die Exocytose zu primen (Richmond et al., 2001; Rosenmund et al., 2002; Wojcik & Brose, 2007; Rizo & Rosenmund, 2008). In elektronentomographischen Untersuchungen an konventionellen chemischen Synapsen von Munc13-1/2 Doppelknockout-Mäusen konnte gezeigt werden, dass Munc13 essentiell für das Docking und damit das Vorhandensein fusionsbereiter Vesikel ist (Siksou et al., 2009). 7

18 Einleitung RIM (Abbildung 4) Die RIM-Proteine (englisch: rab3-interacting protein) wurden ursprünglich als Interaktionspartner des Proteins Rab3 gefunden, welches ein peripheres Membranprotein synaptischer Vesikel ist (Wang et al., 1997). In Vertebraten codieren vier Gene für sieben Isoformen, RIM1α, RIM1β, RIM2α, RIM2β, RIM2γ, RIM3γ und RIM4γ (Wang et al., 1997; Mittelstaedt et al., 2010). Aufgrund verschiedenster Bindedomänen können RIM-Proteine mit vielen synaptischen Proteinen gleichzeitig interagieren. So sorgt etwa ein Komplex der RIMα- und RIMβ-Proteine mit Munc13-1 und Rab3 für die Rekrutierung der Vesikel an die Priming-Maschinerie (Dulubova et al., 2005; Mittelstaedt et al., 2010). Des Weiteren bilden RIM-Proteine Komplexe mit CAST, Piccolo, N-Typ-spannungsabhängigen Ca 2+ -Kanälen, Liprin-α sowie den v-snares SNAP-25 und Synaptotagmin. Durch diese Interaktionen können RIMs die Fusion synaptischer Vesikel modulieren und haben so einen Einfluss auf die präsynaptische Plastizität (Mittelstaedt et al., 2010). CAST (Abbildung 4) In Säugetieren gibt es zwei CAST-Gene (englisch: CAZ-associated structural protein), die auch als ELKS-Gene (hoher Gehalt an Glutamat [E], Leucin [L], Lysin [K] sowie Serin [S]) oder Erc-Gene (englisch: ELKS/Rab6-interacting/CAST family member) bezeichnet werden (Ohtsuka et al., 2002; Deguchi-Tawarada et al., 2004). Im Gehirn der Maus finden sich die beiden Proteine CAST1 (=ELKS2, Erc2) und CAST2b (=ELKS1b, Erc1b). CAST-Proteine interagieren mit Bassoon und Piccolo (Takao-Rikitsu et al., 2004) sowie mit RIM1α und RIM2α/β (Ohtsuka et al., 2002; Wang et al., 2002; Lu et al., 2005). Piccolo / Bassoon (Abbildung 4) Piccolo ist mit etwa 560 kda das größte Protein der aktiven Zone (Cases-Langhoff et al., 1996; Fenster et al., 2000). Es weist hohe Sequenzhomologie zu Bassoon auf, dem mit etwa 420 kda zweitgrößten Protein der aktiven Zone (tom Dieck et al., 1998). Die homologen Regionen werden als Piccolo-Bassoon-Homologie-Domänen (PBH) bezeichnet. Aufgrund dieser Homologie wird vermutet, dass Bassoon und Piccolo ähnliche Funktionen besitzen. Beide Proteine interagieren mit CAST- Proteinen und Mitgliedern der CtBP-Protein-Familie (englisch: C-terminal binding protein) (Shibasaki et al., 2004; tom Dieck et al., 2005). Piccolo spielt eine wichtige 8

19 Einleitung Rolle als Ca 2+ -bindendes Gerüstprotein (Gerber et al., 2001) und könnte eine wichtige Funktion bei der Endocytose haben (Fenster et al., 2003). Mäuse, denen die zentrale Region von Bassoon fehlt, zeigen eine verminderte synaptische Transmission an glutamatergen Synapsen (Altrock et al., 2003). Liprine (Abbildung 4) Liprine interagieren ebenfalls mit vielen Proteinen der aktiven Zone, wie etwa RIMs (Schoch et al., 2002) und CAST (Ko et al., 2003). Vermutlich spielen sie eine Rolle in der Erhaltung und Bildung der aktiven Zone (Zhen & Jin, 1999; Kaufmann et al., 2002). Complexine Zusätzlich kommen noch Complexine an chemischen Synapsen vor. An konventionellen chemischen Synapsen sind dies die beiden Complexin-Isoformen 1 und 2. Complexine sind kleine cytosolische Proteine, welche die Geschwindigkeit und Ca 2+ -Sensitivität der Transmitter-Freisetzung regulieren (Reim et al., 2001) Bandsynapsen der Retina Eine Spezialform der chemischen Synapsen stellen die Bandsynapsen dar (Abbildung 5). Außer in den Photorezeptoren und Bipolarzellen der Retina kommen Bandsynapsen auch in anderen sensorischen Neuronen vor, zum Beispiel in den Haarsinneszellen im Innenohr (Matthews & Fuchs, 2010). Die sensorischen Neurone übertragen eine große Breite an Stimulus-Intensitäten. Bandsynapsen der Retina sind darauf spezialisiert, schnell und kontinuierlich große Mengen an Neurotransmitter freizusetzen und die Freisetzungsrate präzise an graduierte Änderungen des Membranpotentials anzupassen (Heidelberger et al., 2005; Moser et al., 2006; Singer et al., 2009; Matthews & Fuchs, 2010). Die Transmitterfreisetzung an Photorezeptor-Bandsynapsen erfolgt tonisch, mit den höchsten Freisetzungsraten im Dunkeln. Die Exocytose-Rate wird dabei kontinuierlich an sich ändernde Lichtbedingungen angepasst (Heidelberger et al., 2005). 9

20 Einleitung Abbildung 5: Photorezeptor-Bandsynapse Schema (links) und elektronenmikroskopische Aufnahme (rechts) einer Stäbchen-Photorezeptor- Bandsynapse. Die Präsynapse des Photorezeptors (PhR) enthält das synaptische Band (Pfeil), welches von synaptischen Vesikeln umgeben ist. Die postsynaptischen Strukturen, die Horizontal- (HZ) und Bipolarzellen (BZ), invaginieren in das Stäbchenterminal. Namensgebend für die Bandsynapse ist das synaptische Band, eine elektronendichte Struktur, welche als Erweiterung der aktiven Zone betrachtet wird. In Photorezeptoren wölbt sich das synaptische Band über eine Länge von 1-2 µm um die postsynaptischen Elemente, die Dendriten und Fortsätze von Bipolar- und Horizontalzellen (tom Dieck & Brandstätter, 2006). Während die Terminalien von Stäbchen-Photorezeptoren lediglich ein synaptisches Band besitzen, findet man in Zapfen-Photorezeptoren etwa 30 synaptische Bänder (Sterling & Matthews, 2005). Das synaptische Band ist über die arciforme Dichte an der aktiven Zone verankert, ragt etwa 200 nm in das Terminal hinein und ist von hunderten von synaptischen Vesikeln umgeben, die den Neurotransmitter Glutamat enthalten und über dünne Filamente mit dem synaptischen Band verbunden sind (Rao-Mirotznik et al., 1995; Sterling & Matthews, 2005). Dadurch bringt das synaptische Band die Vesikel in enge räumliche Nähe zu den spannungsgesteuerten Ca 2+ -Kanälen (Ca v 1.4) und ermöglicht die präzise Kontrolle der Vesikelfusion (Lenzi & von Gersdorff, 2001; Matthews & Fuchs, 2010). Die genaue Funktion des synaptischen Bandes ist noch nicht geklärt, ist jedoch Gegenstand vieler Untersuchungen (Schmitz, 2009; Matthews & Fuchs, 2010; Regus-Leidig & Brandstätter, 2012). 10

21 Einleitung Molekularer Aufbau des Bandsynapsen-Komplexes Viele der Proteine an konventionellen chemischen Synapsen sind hoch konserviert und kommen ebenfalls an Bandsynapsen vor. Unterschiede zwischen den Synapsentypen lassen sich zum Teil auf das Vorkommen spezifischer Isoformen der verschiedenen Proteine zurückführen (Morgans et al., 1996; Heidelberger et al., 2005; Reim et al., 2005). So findet man beispielsweise in Photorezeptoren die Complexine 3 und 4, nicht jedoch die Complexine 1 und 2, welche nur an konventionellen chemischen Synapsen vorkommen (Reim et al., 2005; Reim et al., 2009). Ein für Bandsynapsen spezifisches Protein ist RIBEYE, welches die Hauptkomponente des synaptischen Bandes darstellt. RIBEYE setzt sich aus einer bandsynapsen-spezifischen A-Domäne und einer B-Domäne zusammen, welche identisch mit CtBP2, einem transkriptionellen Repressor, ist (Schmitz et al., 2000). Das CAZ-Protein Bassoon In den Photorezeptoren von Mäusen, denen ein funktionsfähiges Bassoon fehlt, sind die synaptischen Bänder nicht mehr an der aktiven Zone verankert, sondern liegen frei im Terminal vor. Die synaptische Übertragung ist in diesen Mäusen gestört (Dick et al., 2003). Die Verankerung des synaptischen Bandes erfolgt durch die direkte Interaktion von Bassoon mit RIBEYE (tom Dieck et al., 2005). Über den Knockout von Bassoon konnte auch gezeigt werden, dass sich die Photorezeptor- Bandsynapse aus mindestens zwei räumlich und funktionell getrennten Kompartimenten zusammensetzt dem elektronendichten synaptischen Band und der arciformen Dichte / Plasmamembran (tom Dieck et al., 2005). Zum Kompartiment des synaptischen Bandes gehören die Proteine RIBEYE/CtBP2, CtBP1/BARS, KIF3A (Muresan et al., 1999), Piccolo und RIM1, während Bassoon, RIM2, Erc2/CAST1 (Deguchi-Tawarada et al., 2006), ubmunc13-2 (Cooper et al., 2012), und ein spannungsabhängiger Ca 2+ -Kanal (Ca v 1.4) Bestandteile der arciformen Dichte / Plasmamembran sind (tom Dieck et al., 2005) (Abbildung 6). 11

22 Einleitung Abbildung 6: Modell einer Photorezeptor-Bandsynapse Die Bandsynapse von Photorezeptoren setzt sich aus zwei getrennten Kompartimenten zusammen, dem synaptischen Band und der arciformen Dichte / Plasmamembran mit den jeweils assoziierten Proteinen. Die synaptischen Vesikel an der Bandsynapse lassen sich in drei räumlich voneinander getrennte Pools einteilen: An der aktiven Zone gedockte Vesikel, mit dem synaptischen Band verbundene Vesikel und Vesikel, die frei im synaptischen Terminal liegen und somit den Reservepool darstellen (von Gersdorff, 2001; Heidelberger et al., 2005) (Abbildung 6). 12

23 Einleitung 1.3 Strukturelle Plastizität der Bandsynapse In einer Reihe von Publikationen wurde gezeigt, dass die synaptischen Bänder in Stäbchen-Photorezeptoren hochdynamische Organelle sind (Vollrath et al., 1989; Adly et al., 1999; Spiwoks-Becker et al., 2004). In der Regel erscheint das quer angeschnittene synaptische Band in elektronenmikroskopischen Aufnahmen stäbchenförmig, jedoch wurden verschiedene andere Formen synaptischer Bänder beobachtet und beschrieben (Abbildung 7). Abbildung 7: Elektronenmikroskopische Aufnahmen verschiedener Erscheinungsformen synaptischer Bänder (A) zeigt ein stäbchenförmiges synaptisches Band. In (B) ist ein keulenförmiges Band zu sehen. (C) ist eine Aufnahme eines synaptischen Bandes, von dem sich kugelförmiges Bandmaterial abschnürt. Größenbalken: 0,2 µm. Neben stäbchenförmigen synaptischen Bändern (Abbildung 7A) findet man in den Terminalien von Photorezeptoren auch keulenförmige synaptische Bänder (Abbildung 7B) und kugelförmiges Bandmaterial (Abbildung 7C). In allen Erscheinungsformen ist das Bandmaterial von synaptischen Vesikeln umgeben. In Untersuchungen an den Photorezeptoren albinotischer Ratten wurden tageszeitliche Veränderungen der synaptischen Bänder gefunden (Spadaro et al., 1978; Vollrath et al., 1989). Tagsüber traten vermehrt kugelförmige synaptische Bänder auf, während nachts alle synaptischen Bänder stäbchenförmig waren. Spiwoks-Becker und Kollegen (2004) zeigten an albinotischen Balb/c-Mäusen, dass die strukturellen Veränderungen synaptischer Bänder durch die Umgebungsbeleuchtung ausgelöst werden und damit aktivitätsabhängig sind. Ein Einfluss des circadianen Rhythmus wurde ausgeschlossen, indem Tiere in konstanter Dunkelheit oder unter konstantem Licht gehalten wurden. Diesen Untersuchungen zufolge sorgt Licht für ein Abschnüren von Bandmaterial und führt dadurch zu keulenförmigen und kugelförmigen synaptischen Bändern. Dunkelheit 13

24 Einleitung kehrt diesen Prozess um (Spiwoks-Becker et al., 2004). Diese strukturellen Veränderungen ließen sich auch in vitro durch Veränderungen der Ca 2+ - Konzentrationen auslösen. Eine niedrige Ca 2+ -Konzentration, wie sie im Photorezeptor bei Belichtung vorliegt, führte zum Abschnüren von kugelförmigem Bandmaterial, während die synaptischen Bänder unter hohen Ca 2+ -Konzentrationen stäbchenförmig waren (Spiwoks-Becker et al., 2004). Die Hypothese ist, dass durch das Abschnüren von Bandmaterial das an der aktiven Zone verbleibende synaptische Band kürzer wird, wodurch sich weniger synaptische Vesikel in enger räumlicher Nähe zur präsynaptischen Plasmamembran befinden. Dieser Befund korreliert gut mit den niedrigeren Freisetzungsraten an der Photorezeptor-Bandsynapse im Hellen (Adly et al., 1999). Aus diesem Grund wurde vermutet, dass die strukturellen Veränderungen des synaptischen Bandes dazu beitragen, die Synapse an verschiedene Lichtbedingungen zu adaptieren (Spiwoks- Becker et al., 2004). Ein wesentlicher Kritikpunkt an diesen Arbeiten ist, dass die meisten dieser Studien an albinotischen Balb/c-Mäusen durchgeführt wurden. 14

25 Einleitung 1.4 Fragestellung und Arbeitshypothese Strukturelle Veränderungen synaptischer Bänder wurden in diversen Publikationen beschrieben und mit Änderungen der Umgebungsbeleuchtung in Zusammenhang gebracht. Weitestgehend unbekannt ist jedoch die molekulare Grundlage dieser Veränderungen. In dieser Arbeit sollte mit Hilfe licht- und elektronenmikroskopischer sowie molekularbiologischer Methoden aufgeklärt werden, welche Moleküle der Photorezeptor-Bandsynapse an den lichtabhängigen, strukturellen Veränderungen beteiligt sind. Die Untersuchungen wurden schwerpunktmäßig an C57BL/6-Mäusen durchgeführt, da diese ein gängiges Mausmodell darstellen und viele mutante Mauslinien C57BL/6 als genetischen Hintergrund haben. Zusätzlich zum pigmentierten C57BL/6-Mausstamm wurden zwei albinotische Mausstämme untersucht: Zum einen Balb/c-Mäuse, die bereits in vielen Studien zu den dynamischen Veränderungen synaptischer Bänder verwendet wurden, zum anderen B6(Cg)-Tyr c-2j /J-Mäuse (B6 c-2j ). Diese Mäuse besitzen den gleichen genetischen Hintergrund wie C57BL/6-Mäuse, sind jedoch aufgrund einer Punktmutation im Tyrosinase-Gen albinotisch (Le Fur et al., 1996). 15

26 Ergebnisse 2 Ergebnisse 2.1 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen synaptischer Bänder Die Photorezeptor-Bandsynapse besitzt zwei räumlich getrennte Kompartimente, das synaptische Band und die arciforme Dichte / Plasmamembran (tom Dieck et al., 2005; tom Dieck & Brandstätter, 2006). Für die fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen wurden Retinae dunkel- und helladaptierter C57BL/6- und Balb/c- Mäuse mit spezifischen Antikörpern gegen Proteine der beiden Kompartimente doppelmarkiert Färbungen der präsynaptischen Proteine RIBEYE und Bassoon RIBEYE ist die Hauptkomponente des synaptischen Bandes und spezifisch für Bandsynapsen (Schmitz et al., 2000). Ein Antikörper gegen RIBEYE wurde im in Abbildung 8 gezeigten Färbeexperiment als Marker für das synaptische Band verwendet (grün). Bassoon ist ein sehr großes Protein der aktiven Zone, welches an Bandsynapsen für die Verankerung des synaptischen Bandes zuständig ist (Dick et al., 2003). Ein Antikörper gegen Bassoon (magenta) wurde als Marker für die arciforme Dichte / Plasmamembran verwendet (Abbildung 8). Im dunkeladaptierten Zustand zeigten die synaptischen Bänder in der Retina von C57BL/6-Mäusen die typischen hufeisenförmigen und parallel zueinander verlaufenden Markierungen für RIBEYE und Bassoon (Abbildung 8A). In helladaptierten C57BL/6-Mäusen konnten lichtmikroskopisch keinerlei strukturelle Veränderungen der synaptischen Bänder beobachtet werden (Abbildung 8B). Die synaptischen Bänder erschienen unabhängig vom Adaptationszustand hufeisenförmig. Nur nach dreistündiger Belichtung mit hellem Licht (1000 Lux) fand man in C57BL/6-Mäusen bei einigen wenigen synaptischen Bändern strukturelle Veränderungen (RIBEYE-Färbung; Abbildung 8C). 16

27 Ergebnisse Abbildung 8: Doppelfärbungen von RIBEYE und Bassoon in C57BL/6 und Balb/c-Mäusen (A-F): Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen vertikaler Gefrierschnitte durch die OPL der Retinae von C57BL/6- (A-C) und Balb/c-Mäusen (D-F) doppelgefärbt für RIBEYE (grün) und Bassoon (magenta). (A) und (D) zeigen Bandsynapsen dunkeladaptierter Retinae, in (B) und (E) ist die OPL helladaptierter Tiere zu sehen. (C) und (F) zeigen die OPL nach Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht. Die Kästen zeigen die synaptischen Bänder, die in höherer Vergrößerung gezeigt sind. Größenbalken: 2 µm (OPL) und 1 µm (Ausschnitte). In der Retina dunkeladaptierter Balb/c-Mäuse konnte man wie in C57BL/6-Mäusen die typische hufeisenförmige Färbung der synaptischen Bänder sehen (Abbildung 8D). Nach Helladaptation konnten jedoch auffällige strukturelle Veränderungen der synaptischen Bänder beobachtet werden. An der RIBEYE-Färbung konnte man deutlich erkennen, dass sich kugelförmiges Bandmaterial abschnürte. Die arciforme Dichte (Bassoon-Färbung) hingegen erschien noch immer unverändert und hufeisenförmig (Abbildung 8E). Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht bewirkte keine stärkeren Veränderungen in der Struktur des synaptischen Bandes als Helladaptation mit 200 Lux hellem Licht (Abbildung 8E,F). Zusätzlich wurden auch Retinae von C57BL/6- und Balb/c-Mäusen nach einem Dunkel- und Hellstimulus untersucht (Abbildung 9). Wie in den RIBEYE-Bassoon- Doppelfärbungen zu sehen ist, blieb in den C57BL/6-Mäusen sowohl nach einem 17

28 Ergebnisse Dunkel- als auch nach einem Hellstimulus die typische hufeisenförmige Struktur des synaptischen Bandes erhalten (Abbildung 9A,B). Auch in Balb/c-Mäusen waren die synaptischen Bänder nach einem Dunkelstimulus hufeisenförmig (Abbildung 9C), nach einem Hellstimulus veränderte sich allerdings die Struktur des synaptischen Bandes deutlich (RIBEYE-Färbung; Abbildung 9D). Abbildung 9: Doppelfärbungen von RIBEYE und Bassoon in C57BL/6 und Balb/c-Mäusen nach einem Dunkel- bzw. Hellstimulus (A-D): Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen vertikaler Gefrierschnitte durch die OPL der Retinae von C57BL/6- (A,B) und Balb/c-Mäusen (C,D) doppelgefärbt für RIBEYE (grün) und Bassoon (magenta). (A) und (C) zeigen Bandsynapsen von Retinae nach einem Dunkelstimulus, in (B) und (D) ist die OPL von Mäusen nach einem Hellstimulus zu sehen. Die Kästen zeigen die synaptischen Bänder, die in höherer Vergrößerung gezeigt sind. Größenbalken: 2 µm (OPL) und 1 µm (Ausschnitte). 18

29 Ergebnisse Struktur der synaptischen Bänder Für die Quantifizierung der lichtmikroskopischen Erscheinungsformen der synaptischen Bänder wurden die synaptischen Bänder gezählt, in denen sowohl die RIBEYE als auch die Bassoon-Färbung die typische hufeisenförmige Struktur zeigte und beide Färbungen parallel zueinander verliefen (z.b. Abbildung 8A; Ausschnitt). Des Weiteren wurde der Anteil der synaptischen Bänder bestimmt, von denen sich Bandmaterial abschnürte (z.b. Abbildung 8E; Ausschnitt). Abbildung 10 zeigt die Quantifizierung der synaptischen Bänder von C57BL/6-Mäusen. Abbildung 10: Immuncytochemische Auswertung der synaptischen Bänder in C57BL/6- Mäusen Quantifizierung der Formen der synaptischen Bänder von C57BL/6-Mäusen. Die synaptischen Bänder wurden den Kategorien hufeisenförmig (hellgraue Balken) und verändert (dunkelgraue Balken) zugeordnet. Dargestellt sind die prozentualen Anteile der Formen der synaptischen Bänder in in dunkel- (D) und helladaptierten (H) C57BL/6-Mäusen sowie nach einem Dunkel- (DS) und Hellstimulus (HS) und nach Belichtung mit hellem Licht (1000 Lux). In dunkeladaptierten C57BL/6-Mäusen erschienen 98,7% der synaptischen Bänder hufeisenförmig, bei 1,3% der Synapsen war die RIBEYE-Färbung verändert (n=310). Nach Helladaptation erschien die RIBEYE-Färbung an 9,0% der Synapsen verändert, bei 91,0% verliefen beide Färbungen weiterhin parallel und hufeisenförmig (n=346). Ähnlich verhielt es sich nach einem Dunkelstimulus (95,1% hufeisenförmig; 4,9% verändert; n=391) und einem Hellstimulus (90,7% hufeisenförmig; 9,3% verändert; n=355). Nach Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht traten an 35,6% der synaptischen Bänder strukturelle Veränderungen auf (n=489). Hierbei schnürte sich kugelförmiges Bandmaterial ab (RIBEYE-Färbung), die arciforme Dichte (Bassoon- Färbung) hingegen war unverändert und erschien hufeisenförmig. An 64,4% der 19

30 Ergebnisse synaptischen Bänder erschienen weiterhin beide Färbungen hufeisenförmig (Abbildung 10). Auch in Balb/c-Mäusen wurden die Erscheinungsformen der synaptischen Bänder quantifiziert (Abbildung 11). Abbildung 11: Immuncytochemische Auswertung der synaptischen Bänder in Balb/c-Mäusen Quantifizierung der Formen der synaptischen Bänder von Balb/c-Mäusen. Die synaptischen Bänder wurden den Kategorien hufeisenförmig (hellgraue Balken) und verändert (dunkelgraue Balken) zugeordnet. Dargestellt sind die prozentualen Anteile der Formen der synaptischen Bänder in dunkel- (D) und helladaptierten (H) Balb/c-Mäusen sowie nach einem Dunkel- (DS) und Hellstimulus (HS) und nach Belichtung mit hellem Licht (1000 Lux). In dunkeladaptierten Balb/c-Mäusen erschienen 89,7% der synaptischen Bänder hufeisenförmig, an 10,3% der synaptischen Bänder schnürte sich Bandmaterial ab (RIBEYE-Färbung; n=301). Nach Helladaptation erschienen 67,0% der synaptischen Bänder verändert, nur noch 33,0% waren hufeisenförmig (n=303). Ähnliche Werte ergaben sich nach einem Dunkelstimulus (90,3% hufeisenförmig; 9,7% verändert; n=359) und einem Hellstimulus (23,9% hufeisenförmig; 76,1% verändert; n=310). Nach Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht traten an 68,2% der synaptischen Bänder strukturelle Veränderungen auf, 31,8% der synaptischen Bänder erschienen hufeisenförmig (n=302) (Abbildung 11). Die synaptischen Bänder unterschieden sich nach Dunkeladaptation nicht zwischen den beiden Mausstämmen C57BL/6 und Balb/c. Die synaptischen Bänder waren meistens hufeisenförmig. Die Anteile der Formen synaptischer Bänder nach Helladaptation sind in Abbildung 12 zusammengefasst. 20

31 Ergebnisse Abbildung 12: Erscheinungsformen synaptischer Bänder nach Helladaptation Fluoreszenzmikroskopie Angegeben sind die Anteile der Formen synaptischer Bänder in helladaptierten C57BL/6- und Balb/c-Mäusen. Nach Helladaptation erschienen in Balb/c-Mäusen 67,0% der synaptischen Bänder verändert (RIBEYE-Färbung), in C57BL/6 Mäusen betrug dieser Anteil nur 9,0%. Die übrigen synaptischen Bänder waren auch nach Helladaptation hufeisenförmig (Balb/c: 33,0%; C57BL/6: 91,0%) (Abbildung 12) Färbungen der präsynaptischen Proteine Piccolo und Cacna1f Zur Untersuchung der adaptationsabhängigen Struktur der Photorezeptor- Bandsynapsen wurden weitere Färbungen mit Antikörpern gegen die präsynaptischen Proteine Piccolo und Cacna1f durchgeführt (Abbildung 13). Das Multidomänen-Protein Piccolo ist homolog zu Bassoon, ist jedoch im Gegensatz zu Bassoon nicht an der Basis, sondern am distalen Teil des synaptischen Bandes lokalisiert (Dick et al., 2001; tom Dieck et al., 2005) (Abbildung 13; grün). Die Ca 2+ - Kanal-Untereinheit Cacna1f ist Teil des spannungsgesteuerten Ca 2+ -Kanals (Ca v 1.4) an der präsynaptischen Plasmamembran (Morgans, 2001; Berntson et al., 2003) und daher an der Basis des synaptischen Bandes lokalisiert (tom Dieck et al., 2005) (Abbildung 13; magenta). In der Retina färben Antikörper gegen Cacna1f die Bandsynapsen in der OPL (Specht, 2009). In dunkel- und helladaptierten C57BL/6-Mäusen zeigte auch die Färbung des präsynaptischen Bandkomplexes mit Antikörpern gegen Piccolo und Cacna1f die typische hufeisenförmige Struktur (Abbildung 13A,B). Nur nach dreistündiger Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht konnten in C57BL/6-Mäusen strukturelle Veränderungen der synaptischen Bänder beobachtet werden (Piccolo-Färbung). Hierbei schnürte sich kugelförmiges Bandmaterial ab, wodurch die Piccolo-Färbung nicht mehr durchgängig hufeisenförmig erschien. Die arciforme Dichte (Cacna1f- Färbung) hingegen war unverändert und erschien weiterhin hufeisenförmig (Abbildung 13C). 21

32 Ergebnisse Abbildung 13: Doppelfärbungen von Piccolo und Cacna1f in C57BL/6-und Balb/c-Mäusen (A-F): Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen vertikaler Gefrierschnitte durch die OPL der Retinae von C57BL/6- (A-C) und Balb/c-Mäusen (D-F) doppelgefärbt für Piccolo (grün) und Cacna1f (magenta). (A) und (D) zeigen Bandsynapsen dunkeladaptierter Retinae, in (B) und (E) ist die OPL helladaptierter Tiere zu sehen. (C) und (F) zeigen die OPL nach Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht. Die Kästen zeigen die synaptischen Bänder, die in höherer Vergrößerung gezeigt sind. Größenbalken: 2 µm (OPL) und 1 µm (Ausschnitte). In dunkeladaptierten Balb/c-Mäusen erschienen die meisten synaptischen Bänder ebenfalls hufeisenförmig (Abbildung 13D). Nach Helladaptation, sowie nach Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht war die Struktur der synaptischen Bänder jedoch deutlich verändert (Piccolo-Färbung; Abbildung 13E,F). 22

33 Ergebnisse 2.2 Ultrastrukturelle Untersuchungen synaptischer Bänder Schnittebenen durch Photorezeptor-Bandsynapsen und deren Erscheinungsformen Für eine genauere Quantifizierung der strukturellen Veränderungen wurden die synaptischen Bänder der Stäbchen-Photorezeptoren mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Von jeweils drei Tieren je Mausstamm und Adaptationszustand wurden mehrere hundert Stäbchenterminalien aufgenommen. Auf den Aufnahmen waren synaptische Bänder in verschiedenen Ebenen angeschnitten. Die häufigsten Schnittebenen sind in Abbildung 14 dargestellt. Abbildung 14: Schnittebenen durch das synaptische Band in Photorezeptoren (A) zeigt schematisch einen Querschnitt durch die Photorezeptor-Bandsynapse. Das synaptische Band erscheint stäbchenförmig und die Triadenstruktur der Postsynapse ist zu erkennen. In (B) ist ein Längsschnitt durch das synaptische Band dargestellt. (C) zeigt ein schräg angeschnittenes synaptisches Band. 23

34 Ergebnisse Die synaptischen Bänder waren in den meisten Fällen quer (Abbildung 14A) oder längs (Abbildung 14B) angeschnitten. Selten gab es auch synaptische Bänder, die schräg angeschnitten waren (Abbildung 14C). In Abbildung 15 sind beispielhaft einige elektronenmikroskopische Bilder von Schnitten durch Photorezeptor- Terminalien und Bandsynapsen gezeigt, die nicht weiter ausgewertet wurden. Abbildung 15: Anschnitte nicht gewerteter Terminalien (A) zeigt ein Terminal, in welchem zwar postsynaptische Elemente angeschnitten sind, jedoch kein synaptisches Band. Diese Terminalien wurden als leer bezeichnet. In (B) ist das synaptische Band schräg angeschnitten und wurde aus diesem Grund nicht weiter ausgewertet. Das synaptische Band in (C) liegt weiter als zwei Reihen synaptischer Vesikel von postsynaptischen Strukturen entfernt und wurde daher als freiliegend definiert. Größenbalken: 0,5 µm. Viele Terminalien waren so angeschnitten, dass kein synaptisches Band zu sehen war (Abbildung 15A). Der Anteil dieser leeren Terminalien wurde bestimmt und war in allen untersuchten Retinae etwa gleich. Bei schräg angeschnittenen synaptischen Bändern (Abbildung 15B) konnte die Struktur des Bandes nicht eindeutig bestimmt werden, weshalb diese Terminalien nicht weiter ausgewertet wurden. Sehr selten waren synaptische Bänder zu sehen, die weit von postsynaptischen Strukturen entfernt lagen (Abbildung 15C). Diese wurden als freiliegend bezeichnet. Es war allerdings nicht klar, ob diese synaptischen Bänder tatsächlich nicht an der aktiven Zone verankert waren, oder ob es sich hierbei um Querschnitte durch einen distalen Teil des synaptischen Bandes handelte. Für die weitere Auswertung wurde daher festgelegt, dass der Abstand der Bänder zu den postsynaptischen Elementen maximal dem Durchmesser zweier synaptischer Vesikel entsprechen durfte. Alle synaptischen Bänder, die entweder quer oder längs angeschnitten waren, wurden weiter ausgewertet. Hierfür wurden sie in drei Kategorien eingeteilt: stäbchenförmige, keulenförmige oder kugelförmige synaptische Bänder (Abbildung 16). 24

35 Ergebnisse Abbildung 16: Erscheinungsformen synaptischer Bänder Die Aufnahmen in (A-C) zeigen Querschnitte durch synaptische Bänder.In (D-I) sind Längsschnitte durch synaptische Bänder gezeigt. Die synaptischen Bänder wurden in drei Kategorien unterteilt: stäbchenförmig (A,D,G), keulenförmig (B,E,H) und kugelförmig (C,F,I). Größenbalken: 0,5 µm. Im Querschnitt waren die verschiedenen Erscheinungsformen der synaptischen Bänder deutlich zu erkennen. In Abbildung 16A ist ein stäbchenförmiges synaptische Band gezeigt, hier ist auch die Triadenstruktur der postsynaptischen Invaginationen gut zu erkennen. Andere synaptische Bänder erschienen keulenförmig (Abbildung 16B), wobei das distale Ende des synaptischen Bandes deutlich dicker war als bei stäbchenförmigen synaptischen Bändern. Des Weiteren gab es Terminalien, in denen sich kugelförmiges Material vom synaptischen Band abgeschnürte (Abbildung 16C). Im hier gezeigten Beispiel ist zusätzlich zum kugelförmigen Bandmaterial auch noch ein verankertes stäbchenförmiges synaptisches Band zu sehen. In solchen Fällen wurde nur das kugelförmige synaptische Band gezählt. 25

36 Ergebnisse Die verschiedenen Formen synaptischer Bänder ließen sich auch im Längsschnitt erkennen. In Abbildung 16D ist ein stäbchenförmiges synaptisches Band gezeigt, welches aufgrund der Schnittebene doppelt angeschnitten ist. In Abbildung 16E ist ein doppelt angeschnittenes keulenförmiges synaptisches Band zu sehen. Auch wenn nur einer der beiden Anschnitte keulenförmig war, wurde das Terminal der Kategorie keulenförmiges synaptisches Band zugeordnet. Abbildung 16F zeigt ein schräg angeschnittenes synaptisches Band, neben welchem kugelförmiges Bandmaterial liegt. Unabhängig von der Struktur des übrigen synaptischen Bandes wurde in diesem Terminal nur die Kategorie kugelförmig gewertet. Wenn der Längsschnitt durch einen weiter distal gelegenen Bereich des synaptischen Bandes verlief, waren keine separaten Anschnitte zu sehen, Stattdessen war das gesamte synaptische Band der Länge nach angeschnitten. In dieser Schnittebene konnten stäbchenförmige (Abbildung 16G) und keulenförmige (Abbildung 16H) synaptische Bänder unterschieden werden. In Abbildung 16I ist kugelförmiges Bandmaterial ohne weitere Anschnitte von Bandstrukturen zu sehen Ultrastruktur der synaptischen Bänder in wildtypischen C57BL/6-Mäusen Um die strukturellen Veränderungen der synaptischen Bänder in dunkel- und helladaptierten wildtypischen C57BL/6-Mäusen zu untersuchen, wurden die Retinae von drei Tieren je Adaptationszustand für die elektronenmikroskopische Untersuchung präpariert. Von zufällig ausgewählten Retinastücken wurden Ultradünnschnitte erstellt. Mit facher Vergrößerung wurden 125 Bilder entlang der OPL aufgenommen, so dass zwischen 1100 und 1400 Stäbchen-Terminalien je Adaptionszustand ausgewertet werden konnten. Abzüglich der Terminalien, die nicht weiter ausgewertet wurden (vgl. Abbildung 15), blieben zwischen 400 und 550 Terminalien übrig, welche in eine der zuvor beschriebenen Kategorien stäbchenförmiges, keulenförmiges und kugelförmiges synaptisches Band eingeteilt werden konnten. Die Quantifizierung der Formen synaptischer Bänder in C57BL/6- Mäusen ist in Abbildung 17 zu sehen. 26

37 Ergebnisse Abbildung 17: Elektronenmikroskopische Auswertung der synaptischen Bänder in C57BL/6- Mäusen Quantifizierung der Formen der synaptischen Bänder von C57BL/6-Mäusen. Es wurden die stäbchenförmigen (hellgraue Balken), keulenförmigen (dunkelgraue Balken) und kugelförmigen (schwarze Balken) synaptischen Bänder gezählt. Dargestellt sind die prozentualen Anteile der Formen der synaptischen Bänder in dunkel- (D) und helladaptierten (H) C57BL/6-Mäusen sowie nach einem Dunkel- (DS) und Hellstimulus (HS) und nach dreistündiger Belichtung mit hellem Licht (1000 Lux). In dunkeladaptierten C57BL/6-Mäusen waren fast alle synaptischen Bänder stäbchenförmig (99,3%; n=460). Die übrigen 0,7% der synaptischen Bänder waren keulenförmig. Bei helladaptierten C57BL/6-Mäusen gab es einige wenige keulenförmige (2,5%) und kugelförmige (2,1%) synaptische Bänder. Die meisten synaptischen Bänder waren jedoch ebenfalls stäbchenförmig (95,4%; n=483) (Abbildung 17). Die für Balb/c-Mäuse in der Literatur beschriebenen strukturellen Veränderungen nach Helladaptation (Adly et al., 1999; Spiwoks-Becker et al., 2004) konnten in den C57BL/6-Mäusen nicht beobachtet werden. Die gleichen Untersuchungen wurden auch an den Retinae von Mäusen durchgeführt, die tagsüber dunkeladaptiert (Dunkelstimulus), bzw. dunkel- und anschließend helladaptiert (Hellstimulus) wurden (vgl. Abbildung 38). Wie schon nach Dunkeladaptation war nach einem Dunkelstimulus der Großteil der synaptischen Bänder stäbchenförmig (98,8%; n=412). Die übrigen 1,2% der synaptischen Bänder waren keulenförmig. Auch nach einem Hellstimulus konnten in C57BL/6-Mäusen keine strukturellen Veränderungen der synaptischen Bänder beobachtet werden (96,5% stäbchenförmig, 2,6% keulenförmig, 0,9% kugelförmig; n=549) (Abbildung 17). Um zu untersuchen, ob es in C57BL/6-Mäusen überhaupt lichtabhängige strukturelle Veränderungen gibt, wurden weitere Tiere für drei Stunden 1000 Lux hellem Licht ausgesetzt. In diesen Tieren traten mehr strukturelle Veränderungen auf 27

38 Ergebnisse (14,4% keulenförmig, 14,6% kugelförmig; n=513), aber 71,0% der synaptischen Bänder waren noch immer stäbchenförmig (Abbildung 17) Ultrastruktur der synaptischen Bänder in Balb/c-Mäusen Um unsere Ergebnisse aus den Untersuchungen an C57BL/6-Mäusen zu überprüfen, wurden die gleichen Experimente an Balb/c-Mäusen durchgeführt, für die starke lichtabhängige strukturelle Veränderungen der Bandsynapsen beschrieben sind (Adly et al., 1999; Spiwoks-Becker et al., 2004). Für diese Untersuchungen wurden je Retina 60 Bilder entlang der OPL aufgenommen und zwischen 130 und 280 synaptische Bänder ausgewertet. Die Quantifizierung der Formen synaptischer Bänder in Balb/c-Mäusen ist in Abbildung 18 dargestellt. Abbildung 18: Elektronenmikroskopische Auswertung der synaptischen Bänder in Balb/c- Mäusen Quantifizierung der Formen der synaptischen Bänder von Balb/c-Mäusen. Es wurden die stäbchenförmigen (hellgraue Balken), keulenförmigen (dunkelgraue Balken) und kugelförmigen (schwarze Balken) synaptischen Bänder gezählt. Dargestellt sind die prozentualen Anteile der Formen der synaptischen Bänder in dunkel- (D) und helladaptierten (H) Balb/c-Mäusen sowie nach einem Dunkel- (DS) und Hellstimulus (HS) und nach dreistündiger Belichtung mit hellem Licht (1000 Lux). In dunkeladaptierten Balb/c-Mäusen waren 94,6% der synaptischen Bänder stäbchenförmig, nur 2,9% waren keulenförmig und 2,5% kugelförmig (n=242). In helladaptierten Balb/c-Mäusen war dieses Verhältnis drastisch verändert. Nur noch durchschnittlich 32,8% der synaptischen Bänder waren stäbchenförmig, während 6,4% der Bänder keulenförmig und 60,8% kugelförmig waren (n=311) (Abbildung 18). Allerdings gab es hier zwischen den drei einzelnen Tieren, die unter den gleichen Stimulusbedingungen untersucht wurden, deutliche Schwankungen. So 28

39 Ergebnisse betrug etwa der Anteil der kugelförmigen synaptischen Bänder in den drei helladaptierten Mäusen 75,9%, 66,7% und 35,4%. Wie die C57BL/6-Mäuse wurden auch die Balb/c-Mäuse nach einem Dunkelstimulus und einem Hellstimulus untersucht. Nach einem Dunkelstimulus war die Verteilung der Formen ähnlich wie bei den dunkeladaptierten Tieren (96,9% stäbchenförmig; 3,1% keulenförmig; n=128). Die strukturellen Veränderungen der synaptischen Bänder traten auch nach einem Hellstimulus auf (stäbchenförmig: 50,6%; keulenförmig: 10,3%; kugelförmig: 39,1%; n=261) (Abbildung 18). Diese Werte waren denen nach einer Helladaptation ähnlich, was die Befunde von Spiwoks-Becker und Kollegen (2004) unterstützt, die zeigten, dass die strukturellen Veränderungen synaptischer Bänder lichtabhängig sind und nicht vom circadianen Rhythmus bestimmt werden. In Balb/c-Mäusen erschienen nach Helladaptation mit 1000 Lux hellem Licht 49,1% der synaptischen Bänder stäbchenförmig, 14,1% waren keulenförmig und 36,8% kugelförmig (n=283) (Abbildung 18). Damit waren die strukturellen Veränderungen der synaptischen Bänder in Balb/c-Mäusen nach einer Belichtung mit 1000 Lux nicht ausgeprägter als nach Helladaptation mit 200 Lux hellem Licht Ultrastruktur der synaptischen Bänder in B6 c-2j -Mäusen Wir konnten die publizierten strukturellen Veränderungen der synaptischen Bänder in helladaptierten albinotischen Balb/c-Mäusen reproduzieren. Die Photorezeptor- Bandsynapsen pigmentierter C57BL/6-Mäuse zeigten jedoch nach Helladaptation oder einem Hellstimulus keine strukturellen Veränderungen. Um zu untersuchen, ob sich dieser Unterschied zwischen den beiden Mausstämmen allein durch die fehlende Pigmentierung der Balb/c-Mäuse erklären lässt, wurden die Retinae albinotischer B6 c-2j -Mäusen nach Dunkel- und Helladaptation untersucht. Diese Mäuse haben den gleichen genetischen Hintergrund wie C57BL/6-Mäuse, sind jedoch aufgrund einer Mutation im Tyrosinase-Gen albinotisch (Le Fur et al., 1996). Die Quantifizierung der Formen synaptischer Bänder in B6 c-2j -Mäusen ist in Abbildung 19 dargestellt. 29

40 Ergebnisse Abbildung 19: Elektronenmikroskopische Auswertung der synaptischen Bänder in B6 c-2j - Mäusen Quantifizierung der Formen synaptischer Bänder in B6 c-2j -Mäusen. Es wurden die stäbchenförmigen (hellgraue Balken), keulenförmigen (dunkelgraue Balken) und kugelförmigen (schwarze Balken) synaptischen Bänder gezählt. Dargestellt sind die prozentualen Anteile der Formen der synaptischen Bänder in dunkel- (D) und helladaptierten (H) B6 c-2j - Mäusen. Wie in den dunkeladaptierten C57BL/6- und Balb/c-Mäusen waren die meisten synaptischen Bänder in den Stäbchen-Photorezeptoren dunkeladaptierter B6 c-2j - Mäuse stäbchenförmig (97,8%; 2,2% keulenförmig; n=449). Nach Helladaptation waren noch 81,6% der synaptischen Bändern stäbchenförmig, während 8,3% keulenförmig und 10,1% kugelförmig waren (n=434) (Abbildung 19) Vergleich der ultrastrukturellen Veränderungen Die synaptischen Bänder unterschieden sich nach Dunkeladaptation nicht zwischen den drei untersuchten Mausstämmen C57BL/6, Balb/c und B6 c-2j. Die prominente Form waren immer stäbchenförmige synaptische Bänder. Keulenförmige oder kugelförmige synaptische Bänder traten nur selten auf. Die Formen der synaptischen Bänder nach Helladaptation sind in Abbildung 20 zusammengefasst. Abbildung 20: Erscheinungsformen synaptischer Bänder nach Helladaptation Elektronenmikroskopie Angegeben sind die prozentualen Anteile der Formen synaptischer Bänder in helladaptierten C57BL/6-, Balb/c- und B6 c-2j -Mäusen. Der Anteil keulenförmiger und kugelförmiger synaptischer Bänder nach Helladaptation ist in albinotischen B6 c-2j -Mäusen im Vergleich zu den pigmentierten C57BL/6-Mäusen leicht erhöht. B6 c-2j -Mäuse zeigen jedoch deutlich weniger strukturelle Veränderungen im Vergleich zu den dramatischen Veränderungen in 30

41 Ergebnisse Balb/c-Mäusen (Abbildung 20). Die strukturellen Veränderungen synaptischer Bänder in helladaptierten Balb/c-Mäusen lassen sich daher nicht allein durch die fehlende Pigmentierung erklären. Die Ursache lässt sich vielmehr im anderen genetischen Hintergrund dieser Tiere vermuten Ultrastruktur der synaptischen Bänder in Zapfen-Photorezeptoren Es wurden auch die Terminalien von Zapfen-Photorezeptoren ausgewertet. In C57BL/6-Mäusen waren alle synaptischen Bänder stäbchenförmig (n=408). Unter keiner der Lichtbedingungen, einschließlich der Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht, gab es strukturelle Veränderungen der synaptischen Bänder der Zapfen- Photorezeptoren. In dunkeladaptierten Balb/c-Mäusen waren 98,0% der synaptischen Bänder in Zapfen-Photorezeptoren stäbchenförmig, während jeweils 1,0% der Bänder keulenförmig und kugelförmig erschienen (n=103). Nach einem Dunkelstimulus sah diese Verteilung ähnlich aus (98,7% stäbchenförmig, 1,3% kugelförmig; n=76). Nach Helladaptation waren 95,2% der synaptischen Bänder stäbchenförmig, jeweils 2,4% erschienen keulenförmig und kugelförmig (n=127). Nach einem Hellstimulus betrug der Anteil der stäbchenförmigen synaptischen Bänder 84,8%, während 4,3% keulenförmige und 10,9% kugelförmige synaptische Bänder auftraten (n=92). Nach Belichtung mit hellem Licht (1000 Lux) waren 88,9% der synaptischen Bänder in Zapfen-Photorezeptoren stäbchenförmig (2,2% keulenförmig; 8,9% kugelförmig; n=135). In Balb/c-Mäusen traten im Hellen auch an den synaptischen Bändern der Zapfen-Photorezeptoren strukturelle Veränderungen auf, allerdings waren diese nicht so häufig wie in den Stäbchenterminalien (95,2% stäbchenförmig; 2,4% keulenförmig; 2,4% kugelförmig). In den Zapfen-Photorezeptoren dunkeladaptierter B6 c-2j -Mäuse waren 99,0% der synaptischen Bänder stäbchenförmig, die restlichen 1,0% waren keulenförmig (n=96). Nach Helladaptation waren 97,8% der synaptischen Bänder stäbchenförmig, die restlichen 2,2% waren keulenförmig (n=98). In B6 c-2j -Mäusen gab es nach Helladaptation also auch in den Zapfen-Terminalien nur wenige strukturelle Veränderungen. 31

42 Ergebnisse Die synaptischen Bänder in Zapfen-Photorezeptoren unterschieden sich nach Dunkeladaptation nicht zwischen den drei untersuchten Mausstämmen C57BL/6, Balb/c und B6 c-2j. Die meisten synaptischen Bänder waren stäbchenförmig. Die strukturellen Veränderungen der synaptischen Bänder in Zapfen-Photorezeptoren nach Helladaptation sind in Abbildung 21 zusammengefasst. Abbildung 21: Erscheinungsformen synaptischer Bänder in Zapfen- Photorezeptoren nach Helladaptation Angegeben sind die prozentualen Anteile der Formen synaptischer Bänder in den Zapfen- Photorezeptoren helladaptierter C57BL/6-, Balb/c- und B6 c-2j -Mäuse. Nur in Balb/c-Mäusen zeigten die synaptischen Bänder in Zapfen-Photorezeptoren im Hellen strukturelle Veränderungen. Allerdings war dies nach Helladaptation nicht so deutlich zu sehen, sondern nur nach einem Hellstimulus und nach Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht. 32

43 Ergebnisse 2.3 Räumliche Ausdehnung der synaptischen Bänder und aktiven Zonen Höhe der synaptischen Bänder in C57BL/6-Mäusen In C57BL/6-Mäusen wurden weder lichtmikroskopisch mit immuncytochemischen Färbungen noch elektronenmikroskopisch offensichtliche strukturelle Veränderungen an den synaptischen Bändern gefunden. Daher wurden die synaptischen Bänder dunkel- und helladaptierter Tiere noch weiter auf mögliche strukturelle Unterschiede untersucht. Dazu wurde anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen die Höhe der stäbchenförmigen synaptischen Bänder gemessen. Hierbei wurde darauf geachtet, dass die synaptischen Bänder quer angeschnitten und die postsynaptischen Elemente klar in ihrer Triadenstruktur zu erkennen waren. In Abbildung 22 ist die Auswertung der Höhe der synaptischen Bänder von C57BL/6-Mäusen dargestellt. Abbildung 22: Höhe der synaptischen Bänder in C57BL/6- Mäusen (A) Die Höhe der stäbchenförmigen synaptischen Bänder wurde in dunkel- (D) und helladaptierten (H) C57BL/6-Mäusen sowie nach einem Dunkel- (DS) und Hellstimulus (HS) und nach Belichtung mit hellem Licht (1000 Lux) gemessen. Aufgetragen sind die Mittelwerte und Standardabweichungen. Statistisch signifikante Unterschiede sind durch Sternchen angezeigt (** p < 0,01; *** p < 0,001). (B) zeigt ein kürzeres, (C) ein längeres synaptisches Band. Größenbalken: 0,2 µm. In dunkeladaptierten C57BL/6-Retinae waren die synaptischen Bänder der Stäbchen-Photorezeptoren im Mittel 0,23 µm hoch (± 0,05 µm SD; n=487), nach Helladaptation 0,25 µm (± 0,06 µm SD; n=483). Bei C57BL/6-Mäusen, die einem Dunkelstimulus ausgesetzt waren, betrug die Höhe der synaptischen Bänder durchschnittlich 0,24 µm (± 0,05 µm SD; n=380), nach einem Hellstimulus lag dieser Wert bei 0,25 µm (± 0,06 µm SD; n=564). Im Hellen waren die synaptischen Bänder 33

44 Ergebnisse damit etwas höher als im Dunkeln (p < 0,01) (Abbildung 22A). Allerdings schwankten die Werte zwischen den drei einzelnen Tieren, die unter den gleichen Stimulusbedingungen untersucht wurden, genauso stark wie zwischen den verschiedenen Stimulusbedingungen. Beispielsweise betrug die Höhe der synaptischen Bänder nach einem Dunkelstimulus in den drei Tieren 0,24 µm (± 0,06 µm SD; n=95), 0,23 µm (± 0,05 µm SD; n=137) und 0,25 µm (± 0,05 µm SD; n=148). Nur nach dreistündiger Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht waren die synaptischen Bänder mit durchschnittlich 0,21 µm (± 0,07 µm SD; n=337) signifikant kürzer als unter allen anderen Bedingungen (p < 0,001) (Abbildung 22A). Dies lässt sich vermutlich durch das Auftreten kugelförmiger synaptischer Bänder in einigen Terminalien erklären. Schnürt sich nach Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht Bandmaterial ab, wird das noch an der aktiven Zone verankerte synaptische Band kürzer Höhe der synaptischen Bänder in Balb/c- und B6 c-2j -Mäusen Die Höhe der synaptischen Bänder wurde auch in den albinotischen Balb/c- und B6 c-2j -Mäusen gemessen (Abbildung 23). Abbildung 23: Höhe der synaptischen Bänder in Balb/c- und B6 c-2j -Mäusen (A) Die Höhe der stäbchenförmigen synaptischen Bänder wurde in dunkel- (D) und helladaptierten (H) Balb/c-Mäusen sowie nach einem Dunkel- (DS) und Hellstimulus (HS) und nach Belichtung mit hellem Licht (1000 Lux) gemessen. (B) zeigt die Höhe der stäbchenförmigen synaptischen Bänder in dunkel- (D) und helladaptierten (H) B6 c-2j - Mäusen. Aufgetragen sind die Mittelwerte und Standardabweichungen. Statistisch signifikante Unterschiede sind durch Sternchen angezeigt (*** p < 0,001). Nach Dunkeladaptation waren die synaptischen Bänder der Stäbchen- Photorezeptoren in Balb/c-Mäusen durchschnittlich 0,20 µm hoch (± 0,05 µm SD; n=226), nach Helladaptation etwa 0,16 µm (± 0,06 µm SD; n=102). Ähnlich verhielt 34

45 Ergebnisse es sich auch nach einem Dunkelstimulus (0,19 µm ± 0,05 µm SD; n=126) und einem Hellstimulus (0,15 µm ± 0,06 µm SD; n=133). Auch nach Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht waren die synaptischen Bänder 0,15 µm hoch (± 0,05 µm SD; n=135), was in etwa dem helladaptierten Zustand entspricht (Abbildung 23A). Die synaptischen Bänder in Balb/c-Mäusen waren damit insgesamt deutlich kürzer als in C57BL/6-Mäusen, und es konnten deutliche lichtabhängige Veränderungen in der Höhe der synaptischen Bänder beobachtet werden (Abbildung 22A, 23A). Nach Helladaptation und nach einem Hellstimulus sowie nach Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht waren die synaptischen Bänder signifikant kürzer als im Dunkeln (p < 0,001) (Abbildung 23A). Über ähnliche Veränderungen der Höhe der synaptischen Bänder von Balb/c-Mäusen wurde bereits in verschiedenen Publikationen berichtet. Dabei korrelierte die Ab- oder Zunahme in der Höhe der synaptischen Bänder sehr gut mit der Zu- oder Abnahme in der Anzahl kugelförmiger synaptischer Bänder (Adly et al., 1999; Spiwoks-Becker et al., 2004). In dunkeladaptierten B6 c-2j -Mäusen waren die stäbchenförmigen synaptischen Bänder durchschnittlich 0,19 µm hoch (± 0,04 µm SD; n=342), nach Helladaptation waren sie 0,17 µm hoch (± 0,06 µm SD; n=291) und damit signifikant kürzer als im Dunkeln (p < 0,001) (Abbildung 23B). Die Unterschiede in der Höhe der synaptischen Bänder waren jedoch nicht ganz so stark ausgeprägt wie in den Balb/c-Mäusen. Dies spiegelt sich auch darin wider, dass in den helladaptierten B6 c-2j -Mäusen nur geringfügige strukturelle Veränderungen der synaptischen Bänder auftraten Länge der synaptischen Bänder und aktiven Zonen in C57BL/6-Mäusen Da die synaptischen Bänder in C57BL/6-Mäusen weder strukturelle Veränderungen noch deutliche Höhenänderungen zeigten außer nach Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht wurde auch die Längsausdehnung des synaptischen Bandes und der aktiven Zone untersucht. Hierfür wurden immuncytochemische Färbungen mit Antikörpern gegen RIBEYE und Bassoon lichtmikroskopisch ausgewertet. Die Länge der synaptischen Bänder sowie die Ausdehnung der aktiven Zone wurde in dunkelund helladaptierten C57BL/6-Mäusen sowie nach einem Dunkel- oder Hellstimulus und nach Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht gemessen (Abbildung 24). 35

46 Ergebnisse Abbildung 24: Längenausdehnung der synaptischen Bänder und aktiven Zonen in C57BL/6- Mäusen Aufgetragen sind die Länge der synaptischen Bänder (A) und der aktiven Zonen (B) von C57BL/6- Mäusen. Es wurden die Retinae von dunkel- (D) und helladaptierten (H) Mäusen sowie von Mäusen nach einem Dunkel- (DS) und Hellstimulus (HS) und nach einem Belichtung mit hellem Licht (1000 Lux) ausgewertet. Aufgetragen sind die Mittelwerte und Standardabweichungen. Statistisch signifikante Unterschiede sind durch Sternchen angezeigt (* p < 0,05; *** p < 0,001). (C) zeigt eine Beispielaufnahme einer Bandsynapse doppelmarkiert für das synaptische Band (RIBEYE; grün) und die aktive Zone (Bassoon; magenta). Größenbalken: 1 µm. In dunkel- und helladaptierten C57BL/6-Mäusen waren die synaptischen Bänder durchschnittlich 1,57 µm lang (± 0,26 µm SD bzw. ± 0,25 µm SD; n=450). Bei Mäusen, die einem Dunkelstimulus ausgesetzt waren, betrug die Länge der synaptischen Bänder 1,59 µm (± 0,25 µm SD; n=450), während sie nach einem Hellstimulus 1,64 µm betrug (± 0,26 µm SD; n=450). Wurden die Mäuse 1000 Lux hellem Licht ausgesetzt, betrug die Länge der synaptischen Bänder im Mittel 1,61 µm (± 0,24 µm SD; n=450) (Abbildung 24A). Einen schwachen, aber signifikanten Unterschied in der Länge der synaptischen Bänder gab es nur im Vergleich zwischen einem Dunkel- und Hellstimulus (p < 0,05) (Abbildung 24). Allerdings ist anzumerken, dass die gemessenen Schwankungen zwischen den drei einzelnen Tieren, die unter den gleichen Stimulusbedingungen untersucht wurden, größer waren als zwischen dem Dunkel- und Hellstimulus. So lagen zum Beispiel die einzelnen Werte für die Länge der synaptischen Bänder nach einem Dunkelstimulus bei 1,64 µm (± 0,29 µm SD; n=150), 1,57 µm (± 0,24 µm SD; n=150) und 1,55 µm (± 0,21 µm SD; n=150). Die Länge der gemessenen aktiven Zonen betrug bei dunkeladaptierten C57BL/6- Mäusen durchschnittlich 1,29 µm (± 0,18 µm SD; n=300), bei helladaptierten Mäusen 1,43 µm (± 0,21 µm SD; n=300). Nach einem Dunkelstimulus waren die aktiven 36

47 Ergebnisse Zonen 1,43 µm lang (± 0,22 µm SD; n=300), nach einem Hellstimulus im Mittel 1,41 µm (± 0,19 µm SD; n=300). Nach Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht erstreckten sich die aktiven Zonen über durchschnittlich 1,38 µm (± 0,19 µm SD; n=300) (Abbildung 24B). Ein signifikanter Unterschied bestand zwischen den Längen der aktiven Zonen nach Hell- und Dunkeladaptation (p < 0,001) (Abbildung 24B) Länge der synaptischen Bänder und aktiven Zonen in Balb/c-Mäusen Auch in den Balb/c-Mäusen wurde die Längenausdehnung der synaptischen Bänder und der aktiven Zonen gemessen (Abbildung 25). Abbildung 25: Längenausdehnung der synaptischen Bänder und aktiven Zonen in Balb/c- Mäusen Aufgetragen sind die Länge der synaptischen Bänder (A) und der aktiven Zonen (B) von Balb/c- Mäusen. Es wurden die Retinae von dunkel- (D) und helladaptierten (H) Mäusen sowie nach einem Dunkel- (DS) und Hellstimulus (HS) und nach Belichtung mit hellem Licht (1000 Lux) ausgewertet. Aufgetragen sind die Mittelwerte und Standardabweichungen. Statistisch signifikante Unterschiede sind durch Sternchen angezeigt (*** p < 0,001). In dunkeladaptierten Balb/c-Mäusen waren die synaptischen Bänder im Durchschnitt 1,43 µm lang (± 0,25 µm SD; n=300), nach Helladaptation betrug dieser Wert 1,47 µm (± 0,23 µm SD; n=300). Nach einem Dunkelstimulus betrug die Länge der synaptischen Bänder 1,43 µm (± 0,24 µm SD; n=300), nach einem Hellstimulus 1,38 µm (± 0,32 µm SD; n=300). Nach Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht waren die synaptischen Bänder etwa 1,44 µm lang (± 0,25 µm SD; n=300). Es gab in 37

48 Ergebnisse Balb/c-Mäusen keine signifikanten Unterschiede in der Länge der synaptischen Bänder (Abbildung 25A). Die Länge der aktiven Zonen lag bei dunkeladaptierten Balb/c-Mäusen im Durchschnitt bei 1,43 µm (± 0,21 µm SD; n=300), bei helladaptierten Mäusen bei nur 0,97 µm (± 0,35 µm SD; n=299). Nach einem Dunkelstimulus waren die aktiven Zonen im Mittel 1,25 µm lang (± 0,27 µm SD; n=304), nach einem Hellstimulus etwa 1,31 µm (± 0,18 µm SD; n=302). Bei Mäusen, die 1000 Lux hellem Licht ausgesetzt waren, erstreckte sich die Länge der aktiven Zonen über durchschnittlich 1,11 µm (± 0,38 µm SD; n=300) (Abbildung 25B). Die aktiven Zonen waren in dunkeladaptierten Tieren länger als nach Helladaptation (p < 0,001), unterschieden sich jedoch nicht zwischen einem Dunkel- und Hellstimulus (Abbildung 25B). Nach Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht war die Länge der aktiven Zonen signifikant kürzer als nach Dunkeladaptation oder einem Dunkel- und Hellstimulus, jedoch signifikant länger als nach Helladaptation (p < 0,001) (Abbildung 25B) Circadiane Abhängigkeit der Höhe und Länge der synaptischen Bänder und der Länge der aktiven Zonen in C57BL/6-Mäusen Um einen möglichen circadianen Einfluss auf die Ausdehnung der synaptischen Bänder und aktiven Zonen auszuschließen, wurden in C57BL/6-Mäusen neben 9 Uhr (Helladaptation) und 21 Uhr (Dunkeladaptation) mit 12 Uhr und 15 Uhr noch zwei weitere Zeitpunkte im tageszeitlichen Verlauf untersucht. Helladaptierte Mäuse wurden damit nach drei, sechs und neun Stunden Helladaptation präpariert, und die Höhe und Länge der synaptischen Bänder und die Länge der aktiven Zonen wurden gemessen (Abbildung 26). In helladaptierten C57BL/6-Retinae (9 Uhr) waren die stäbchenförmigen synaptischen Bänder der Stäbchen-Photorezeptoren im Mittel 0,25 µm hoch (± 0,06 µm SD; n=483). Nach weiteren drei (12 Uhr) und sechs Stunden (15 Uhr) Helladaptation waren die synaptischen Bänder durchschnittlich 0,24 µm (± 0,04 µm SD; n=400) bzw. 0,23 µm hoch (± 0,05 µm SD; n=402). Bei der Höhe der synaptischen Bänder gab es keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen 9 Uhr, 12 Uhr und 15 Uhr (Abbildung 26A). 38

49 Ergebnisse Abbildung 26: Ausdehnung der synaptischen Bänder und aktiven Zonen in helladaptierten C57BL/6-Mäusen Aufgetragen sind die Höhe (A) und Länge (B) der synaptischen Bänder sowie die Länge der aktiven Zonen (C) von C57BL/6-Mäusen. Es wurden synaptische Bänder von Mäusen ausgewertet, die um 9 Uhr, 12 Uhr und 15 Uhr präpariert wurden und damit für drei, sechs, oder neun Stunden helladaptiert wurden. Aufgetragen sind die Mittelwerte und Standardabweichungen. Statistisch signifikante Unterschiede sind durch Sternchen angezeigt (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). Die Länge der synaptischen Bänder betrug um 9 Uhr 1,57 µm (± 0,25 µm SD; n=450). Um 12 Uhr und um 15 Uhr waren die synaptischen Bänder im Mittel 1,50 µm lang (± 0,19 µm SD bzw. ± 0,21 µm SD; n=300). Damit war die Länge der synaptischen Bänder um 12 Uhr etwas geringer als um 9 Uhr (p < 0,001) (Abbildung 26B). Die Länge der aktiven Zonen betrug um 9 Uhr 1,43 µm (± 0,21 µm SD; n=300). Um 12 Uhr war die aktive Zone im Mittel 1,48 µm lang (± 0,19 µm SD; n=300), um 15 Uhr 1,43 µm (± 0,17 µm SD; n=300). Damit war die aktive Zone um 12 Uhr etwas länger als um 9 Uhr (p < 0,05), um 15 Uhr jedoch wieder etwas kürzer (p < 0,01) (Abbildung 26C). Allerdings schwankten auch hier die Werte der drei einzelnen Tiere, die unter den gleichen Stimulusbedingungen untersucht wurden, genauso stark wie zwischen den verschiedenen Zeiten. 39

50 Ergebnisse Die Höhen- und Längenausdehnungen der synaptischen Bänder sowie der aktiven Zonen in den Stäbchen-Photorezeptoren von C57BL/6-Mäusen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1: Ausdehnung der synaptischen Bänder und aktiven Zonen in helladaptierten C57BL/6-Mäusen Die Höhe der synaptischen Bänder, deren Längenausdehnungen sowie die Ausdehnung der aktiven Zonen wurden zu verschiedenen Tageszeitpunkten gemessen. Angegeben sind die Mittelwerte und Standardabweichungen in µm. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass in den C57BL/6-Mäusen weder die Lichtbedingungen noch die Tageszeit einen Einfluss auf die Struktur oder Größe der synaptischen Bänder und aktiven Zonen hatten. 40

51 Ergebnisse 2.4 Genexpression präsynaptischer Proteine Auf der Suche nach adaptiven Veränderungen an den Bandsynapsen der Photorezeptoren wurde auch die Expressionsstärke der Gene präsynaptischer Proteine zu den diversen Adaptationszuständen untersucht. Zur Genanalyse wurde nicht die gesamte Retina verwendet, sondern nur die äußere Retina. Dafür wurden mittels Laser-Mikrodissektion Stücke der äußeren nukleären Schicht mit den inneren Segmenten der Photorezeptoren ausgeschnitten. Die mrna der Photorezeptoren wurde isoliert und in cdna umgeschrieben, und die relativen Expressionsstärken der verschiedenen Gene nach Hell- und Dunkeladaptation wurden mittels quantitativer Realtime-PCR bestimmt (Abbildung 27). Abbildung 27: Genexpression in hell- und dunkeladaptierten Photorezeptoren Mittels quantitativer Realtime-PCR wurde die relative Expressionsstärke verschiedener Gene in den Photorezeptoren hell- und dunkeladaptierter C57BL/6-Mäuse untersucht. Die Werte wurden auf die jeweilige Expression von GAPDH normiert und relativ zur Expressionsstärke in der helladaptierten Retina aufgetragen. Aufgetragen sind die Mittelwerte und Standardabweichungen. n=8 (Bassoon, Cacna1f, Piccolo, RIBEYE, RIM2, ubmunc13-2), n=7 (Complexin 3, Complexin 4), n=6 (Syntaxin 3). Die Expressionsstärke der verschiedenen Gene wurde unter Berücksichtigung der Primereffizienzen und relativ zur Expression im helladaptierten Zustand berechnet. Die Expression von Bassoon, Piccolo, RIBEYE, RIM2 und Syntaxin 3 war im dunkeladaptierten Zustand erhöht. Deutlich niedrigere Expressionsstärken fanden 41

52 Ergebnisse sich hingegen für Cacna1f, Complexin 3, und Complexin 4 nach Dunkeladaptation, und auch die Expressionsstärke von ubmunc13-2 war leicht reduziert. Da unklar blieb, ob die Unterschiede durch die unterschiedlichen Adaptationszustände zustande kommen oder ob sich die Expression dieser Gene mit dem circadianen Rhythmus ändert, wurde die Genexpression nach Helladaptation mit der Expression nach einem Dunkelstimulus verglichen (Abbildung 28). Abbildung 28: Genexpression in Photorezeptoren nach einem Dunkelstimulus Mittels quantitativer Realtime-PCR wurde die relative Expressionsstärke verschiedener Gene in den Photorezeptoren von C57BL/6-Mäusen nach einem Dunkelstimulus untersucht. Die Werte wurden auf die jeweilige Expression von GAPDH normiert und relativ zur Expressionsstärke in der helladaptierten Retina aufgetragen. Aufgetragen sind die Mittelwerte und Standardabweichungen. n=8 (Bassoon, Cacna1f, Piccolo, RIBEYE, RIM2, ubmunc13-2), n=7 (Complexin 3, Complexin 4), n=6 (Syntaxin 3). Auch nach einem Dunkelstimulus war die Expression von Bassoon, Piccolo und RIBEYE im Vergleich zum helladaptierten Zustand erhöht. Die schon zuvor beschriebenen Unterschiede könnten daher mit dem Adaptationszustand zusammenhängen. Für Cacna1f, Complexin 3, Complexin 4, RIM2, Syntaxin 3 und ubmunc13-2 fanden sich keine Unterschiede in der Expressionsstärke zwischen Helladaptation und einem Dunkelstimulus. Die Unterschiede in der relativen Expressionsstärke dieser Gene, die zwischen hell- und dunkeladaptierten Photorezeptoren gefunden wurden, lassen sich daher vermutlich auf tageszeitlich bedingte Schwankungen der Genexpression zurückführen. 42

53 Ergebnisse 2.5 Proteinmengen präsynaptischer Proteine Die Retinae dunkel- und helladaptierter C57BL/6-Mäuse wurden homogenisiert und mittels Western Blot Analysen untersucht. So sollte festgestellt werden, ob sich die Proteinmengen ausgewählter präsynaptischer Proteine zwischen den Adaptationszuständen unterscheiden. Aufgrund der Ergebnisse der quantitativen Realtime-PCR wurden für diese Experimente die Proteine Bassoon, Piccolo, Cacna1f und RIBEYE ausgewählt. Für die Western Blot Analysen von Bassoon und Piccolo wurden Gradientengele und ein Marker für große Proteine verwendet. Abbildung 29 zeigt die Auswertung des Western Blots für Bassoon. Bassoon ist ein sehr großes Protein der aktiven Zone, welches an Bandsynapsen für die Verankerung des synaptischen Bandes zuständig ist (Dick et al., 2003). Abbildung 29: Western Blot Analyse hell- und dunkeladaptierter Retinae für Bassoon (A) zeigt einen Beispiel-Western Blot mit Proteinextrakten aus dunkel- (D) und helladaptierter (H) Retina. Die Pfeile markieren die ausgewerteten Bassoon-Banden, als Referenz diente Aktin. Die Position des Molekulargewicht-Standards (kda) ist angezeigt. (B) zeigt die Quantifizierung der Proteinmengen von Bassoon. Normalisiert wurde auf die jeweilige Aktin-Expression. Die Bassoon- Menge im dunkeladaptierten Zustand wurde als 100% definiert. Aufgetragen sind die Mittelwerte und Standardabweichungen. n=4 Der Antikörper gegen Bassoon detektiert zwei Banden, die bei etwa 350 und 420 kda liegen (tom Dieck et al., 1998) (Abbildung 29A). Der mittlere Wert der Proteinmengen in den dunkeladaptierten Retinae wurde jeweils auf 100% festgelegt, wodurch alle Werte auf den Zustand der Dunkeladaptation normiert wurden. Die Standardabweichungen wurden im gleichen Verhältnis umgerechnet und betrugen 95,5% für Bande 1 bzw. 76,1% für Bande 2. Nach Helladaptation stieg die mittlere 43

54 Ergebnisse Proteinmenge der oberen Bande (1) nur leicht auf 123,7% (± 111,8%) an, die der unteren Bande (2) sank leicht auf 81,8% (± 77,9%) (Abbildung 29B). Bei der Quantifizierung der Proteinmengen von Bassoon konnte somit kein Unterschied zwischen den dunkel- und helladaptierten Retinae gefunden werden. Abbildung 30A zeigt die Auswertung des Western Blots für Piccolo. Das Multidomänen-Protein Piccolo ist homolog zu Bassoon, ist jedoch im Gegensatz zu Bassoon nicht an der Basis, sondern am distalen Teil des synaptischen Bandes lokalisiert (Dick et al., 2001; tom Dieck et al., 2005). Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass an Bandsynapsen eine verkürzte, etwa 330 kda große, Spleißvariante von Piccolo (=Piccolino) existiert (Regus-Leidig et al., eingereicht). Für den Western Blot wurde daher ein Antikörper gegen die Spleißvariante Piccolino verwendet (Abbildung 30A). Abbildung 30: Western Blot Analyse hell- und dunkeladaptierter Retinae für Piccolino (A) zeigt einen Beispiel-Western Blot mit Proteinextrakten aus dunkel- (D) und helladaptierter (H) Retina. Der Pfeil markiert die ausgewertete Piccolino-Bande, als Referenz diente Aktin. Die Position des Molekulargewicht-Standards (kda) ist angezeigt. (B) zeigt die Quantifizierung der Proteinmengen von Piccolino. Normalisiert wurde auf die jeweilige Aktin-Expression. Die Piccolino- Menge im dunkeladaptierten Zustand wurde als 100% definiert. Aufgetragen sind die Mittelwerte und Standardabweichungen. n=5 Die mittlere Proteinmenge von Piccolino in der dunkeladaptierten Retina wurde als 100% (± 56,0%) definiert. Nach Helladaptation konnte keine Veränderung in der Proteinmenge von Piccolino festgestellt werden (101,8% ± 27,7%) (Abbildung 30B). 44

55 Ergebnisse Der spannungsgesteuerte Ca 2+ -Kanal Ca v 1.4 kommt in Stäbchen-Photorezeptoren vor (Morgans, 2001; Berntson et al., 2003) und ist dort an der aktiven Zone der Bandsynapse lokalisiert (tom Dieck et al., 2005). In Abbildung 31 ist die Western Blot Analyse für die Ca 2+ -Kanal-Untereinheit Cacna1f gezeigt, die mit dem Antikörper Panα1 durchgeführt wurde (Specht et al., 2009). Abbildung 31: Western Blot Analyse hell- und dunkeladaptierter Retinae für Cacna1f (A) zeigt einen Beispiel-Western Blot mit Proteinextrakten aus dunkel- (D) und helladaptierter (H) Retina. Die Pfeile markieren die beiden ausgewerteten Cacna1f-Banden, als Referenz diente Aktin. Die Position des Molekulargewicht-Standards (kda) ist angezeigt. (B) zeigt die Quantifizierung der Cacna1f-Banden. Normalisiert wurde auf die jeweilige Aktin-Expression. Die Cacna1f-Menge im dunkeladaptierten Zustand wurde als 100% definiert. Aufgetragen sind die Mittelwerte und Standardabweichungen. n=2 Die Western Blots gegen Cacna1f mit dem Antikörper Panα1 zeigten mehrere Banden (Abbildung 31A). Allerdings wurden nur die beiden Banden ausgewertet, die in der Cacna1f Ex14-17-Maus im Vergleich zum Wildtyp reduziert waren (die 150 und 180 kda Banden; Specht et al., 2009). Die Proteinmenge der oberen Bande (1) wurde in der dunkeladaptierten Retina als 100% (± 3,7%) definiert, nach Helladaptation stieg die Proteinmenge auf 306,4% (± 148,6%). Auch die untere Bande (2) war im Hellen stärker (222,9% ± 0,2%) als im Dunkeln (100% ± 36,6%) (Abbildung 31B). Cacna1f zeigte damit eine stark vom Adaptationszustand abhängige Expression. Die Proteinmenge war nach Helladaptation 2- bis 3-mal höher als nach Dunkeladaptation (Abbildung 31). 45

56 Ergebnisse RIBEYE stellt die Hauptkomponente des synaptischen Bandes dar und ist spezifisch für Bandsynapsen (Schmitz et al., 2000). Die Auswertung der Western Blots für RIBEYE ist in Abbildung 32 gezeigt. Abbildung 32: Western Blot Analyse hell- und dunkeladaptierter Retinae für RIBEYE (A) zeigt einen Beispiel-Western Blot mit Proteinextrakten aus dunkel- (D) und helladaptierter (H) Retina. Die Pfeile markieren die beiden RIBEYE-Banden, als Referenz diente Aktin. Die Position des Molekulargewicht-Standards (kda) ist angezeigt. (B) zeigt die Quantifizierung der RIBEYE- Banden. Normalisiert wurde auf die jeweilige Aktin-Expression. Die RIBEYE-Menge im dunkeladaptierten Zustand wurde als 100% definiert. Aufgetragen sind die Mittelwerte und Standardabweichungen. n=6 Bei den Western Blots mit einem Antikörper gegen RIBEYE war eine Doppelbande bei 110 und 120 kda zu erkennen (Abbildung 32A). Da dieser Antikörper gegen die A-Domäne von RIBEYE gerichtet ist, wurde keine CtBP2-Bande detektiert. Für die obere der beiden RIBEYE-Banden (1) betrug die Proteinmenge nach Helladaptation 66,6% (± 30,7%) im Vergleich zur Proteinmenge in der dunkeladaptierten Retina, die als 100% definiert wurde (± 35,2%). Für die untere Bande (2) wurde die Proteinmenge nach Dunkeladaptation ebenfalls als 100% definiert (± 43,1%). Nach Helladaptation sank die Proteinmenge auf 66,0% (± 39,7%) (Abbildung 32B). Damit konnte gezeigt werden, dass die Proteinmenge von RIBEYE im helladaptierten Zustand niedriger ist als nach Dunkeladaptation (Abbildung 32). Zusammengefasst ergeben die Ergebnisse der Western Blot Analysen folgendes Bild: Bassoon und Piccolino zeigten auf Proteinebene keine adaptationsabhängigen Veränderungen, von der Ca 2+ -Kanal-Untereinheit Cacna1f war im Hellen mehr Protein vorhanden als im Dunkeln, während RIBEYE im Hellen in geringeren Mengen vorlag als im Dunkeln. 46

57 Ergebnisse 2.6 Endocytose In den Photorezeptor-Terminalien von C57BL/6-Mäusen wurden nach Dunkeladaptation sowie nach einem Dunkelstimulus vermehrt Anhäufungen von Vesikeln mit einer besonders elektronendichten Vesikelmembran gefunden (Abbildung 33). Diese lagen immer in der Nähe des synaptischen Bandes und der invaginierenden postsynaptischen Elemente. In helladaptierten Tieren sowie nach einem Hellstimulus traten diese Strukturen nicht auf. Abbildung 33: Endocytotische Vesikel nach Dunkeladaptation Nach Dunkeladaptation traten vermehrt Anhäufungen dunkler Vesikel auf, die schlauchförmig miteinander verbunden waren (Pfeile). Größenbalken: 0,2 µm; Ausschnitt: 0,1 µm. Vergleichbar mit synaptischen Vesikeln haben diese Vesikel einen Durchmesser von etwa 30 bis 50 nm. Ihre Vesikelmembran ist aber elektronendichter, weshalb sie dunkler erscheinen als synaptische Vesikel. Auch sind sie oft miteinander verbunden und bilden oft verzweigte, tubuläre Strukturen (Abbildung 33; Pfeile). Sie ähneln den endocytotischen Strukturen, wie sie in den Photorezeptoren von Drosophila beschrieben sind (Koenig & Ikeda, 1996; Betz & Angleson, 1998). Auch die Tatsache, dass diese Vesikel ausschließlich im Dunkeln auftreten, wenn die Photorezeptoren die höchste Exocytoserate und damit auch die höchste Endocytoserate aufweisen, spricht für eine Beteiligung dieser Vesikel an der Endocytose in den Photorezeptor-Terminalien der Maus. 47

58 Ergebnisse 2.7 Ausdehnung der postsynaptischen Invaginationen Horizontalzellen spielen in der Fischretina eine wichtige Rolle bei der Adaptation. Sie bilden sekundäre Ausstülpungen ( spinules ) aus, die je nach Adaptationszustand unterschiedlich stark in die Terminalien der Zapfen-Photorezeptoren invaginieren (Raynauld et al., 1979; Wagner, 1980; Schmitz & Drenckhahn, 1991; Weiler & Janssen-Bienhold, 1993; Weiler et al., 1996). Licht und hohe Ca 2+ -Konzentrationen erhöhen den Grad dieser Invaginationen, Dunkelheit und niedrige Ca 2+ -Konzentrationen wirken vermindernd auf den Invaginationsgrad bis hin zum kompletten Verlust der Fortsätze (Wagner, 1980; Schmitz & Drenckhahn, 1991). Da die Ausdehnung der postsynaptischen Invaginationen auch in der Mausretina einen Einfluss auf die synaptische Übertragung haben könnte, wurde die Fläche (µm 2 ) der invaginierenden postsynaptischen Elemente in Stäbchen-Photorezeptor- Terminalien dunkel- und helladaptierter C57BL/6-Mäuse sowie nach einem Dunkel- und Hellstimulus und nach Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht untersucht (Abbildung 34A). Abbildung 34: Ausdehnung der postsynaptischen Invaginationen Gemessen wurde die Fläche der postsynaptischen Invaginationen (A) nach Dunkel- (D) und Helladaptation (H) sowie nach einem Dunkel- (DS) und Hellstimulus (HS). Anschließend wurde der Anteil der postsynaptischen Invaginationen an der Fläche der Gesamtterminalien bestimmt (B). Aufgetragen sind die Mittelwerte und Standardabweichungen. Statistisch signifikante Unterschiede sind durch Sternchen angezeigt (*** p < 0,001). In dunkeladaptierten Tieren und nach einem Dunkelstimulus betrug die Fläche der postsynaptischen Invaginationen 0,44 µm 2 (± 0,16 µm 2 SD; n=259) bzw. 0,49 µm 2 (± 0,18 µm 2 SD; n=217). Nach Helladaptation oder nach einem Hellstimulus reduzierte sich die Fläche auf 0,39 µm 2 (± 0,13 µm 2 SD; n=230) bzw. 0,38 µm 2 (± 0,14 µm 2 SD; n=297) (Abbildung 34A). Dunkeladaptation oder ein Dunkelstimulus führen damit zu einer signifikanten Zunahme der Fläche der in die Photorezeptor- 48

59 Ergebnisse Terminalien invaginierenden postsynaptischen Elemente (p < 0,001) (Abbildung 34A). Da sich jedoch auch die Größe der Photorezeptor-Terminalien selbst adaptationsabhängig leicht änderte, wurde zusätzlich der Anteil der postsynaptischen Invaginationen an der Gesamtfläche der Terminalien bestimmt (Abbildung 34B). In dunkeladaptierten C57BL/6-Mäusen betrug der Anteil der postsynaptischen Invaginationen an der Gesamtfläche 19,2% (± 6,8%). In helladaptierten Tieren reduzierte sich dieser Anteil auf 16,0% (± 5,9%). Nach einem Dunkelstimulus betrug der Flächenanteil der postsynaptischen Invaginationen an der Gesamtfläche der Terminalien 18,7% (± 6,2%), nach einem Hellstimulus betrug der Anteil 18,0% (± 6,8%) (Abbildung 34B). Der Anteil der Fläche der Postsynapse am Gesamtterminal war damit nach Dunkeladaptation signifikant höher als nach Helladaptation (p < 0,001) (Abbildung 34B). Beim Vergleich von Dunkel- und Hellstimulus ergab sich kein signifikanter Unterschied (Abbildung 34B). Zusätzlich zu den Größenunterschieden der postsynaptischen Invaginationen entstand der Eindruck, dass sich die Form der Invaginationen im Dunkeln und im Hellen unterscheidet (Abbildung 35). Abbildung 35: Form der postsynaptischen Invaginationen Die Form der postsynaptischen Invaginationen in den Photorezeptor-Terminalien erschien nach Dunkel- und Helladaptation verändert. Im Dunkeln schienen sich die Horizontalzellen um das synaptische Band zu wölben. Größenbalken: 0,2 µm. In dunkeladaptierten Retinae konnte oft beobachtet werden, dass sich die Anschnitte der Horizontalzellen um das synaptische Band wölbten (Abbildung 35A). Derartiges konnten nach Helladaptation nicht beobachtet werden (Abbildung 35B). 49

60 Ergebnisse 2.8 Vesikelverteilung am synaptischen Band In Untersuchungen an den Zapfen-Photorezeptoren der Echse Anolis sagrei konnten Jackman und Kollegen (2009) adaptationsabhängige Unterschiede in der Vesikelverteilung am synaptischen Band zeigen. Die Gesamtzahl der Vesikel am synaptischen Band war nach Hell- und Dunkeladaptation identisch, jedoch fanden sich im Dunkeln deutlich weniger Vesikel an der Basis des synaptischen Bandes als im Hellen. Die Autoren argumentieren, dass diese Vesikel beim Übergang von hell zu dunkel in einem phasischen Schub freigesetzt werden können, was dazu beitragen könnte, den dynamischen Bereich der Photorezeptoren zu erhöhen (Jackman et al., 2009). In einem weiteren Teil meiner Doktorarbeit habe ich daher die Anzahl und Verteilung der synaptischen Vesikel an den synaptischen Bändern in den Stäbchen- Photorezeptoren dunkel- und helladaptierter C57BL/6-Mäuse sowie nach einem Dunkel- und Hellstimulus untersucht (Abbildung 36). In der dunkeladaptierten Retina umgaben durchschnittlich 12,5 (± 2,7) Vesikel das synaptische Band. Davon befanden sich 4,7 (± 1,2) Vesikel an der Basis des synaptischen Bandes. Als Basis wurden die unteren 100 nm des synaptischen Bandes definiert. In helladaptierten Photorezeptoren befanden sich 11,0 (± 3,1) Vesikel am synaptischen Band, aber nur 1,7 (± 1,4) davon waren an dessen Basis lokalisiert. Nach einem Dunkelstimulus waren 12,5 (± 2,5) Vesikel am synaptischen Band gebunden, davon 4,6 (± 1,2) Vesikel an der Basis. Nach einem Hellstimulus waren 1,9 (± 1,5) Vesikel von durchschnittlich 10,8 (± 2,9) Vesikeln in den untersten 100 nm des Bandes lokalisiert. Beispielhaft ist diese Verteilung in Abbildung 36A-C gezeigt. Obwohl die Gesamtzahl der Vesikel am synaptischen Band im Dunkeln nur unwesentlich höher war als im Hellen, lässt sich ein deutlicher Unterschied in der Verteilung der Vesikel am synaptischen Band erkennen. In der dunkeladaptierten Retina sowie nach einem Dunkelstimulus waren die Vesikel gleichmäßig am synaptischen Band verteilt, nach Helladaptation oder einem Hellstimulus hingegen waren deutlich weniger Vesikel an der Basis des synaptischen Bandes lokalisiert (Abbildung 36C). 50

61 Ergebnisse Abbildung 36: Vesikelverteilung am synaptischen Band in Stäbchen-Photorezeptoren von C57BL/6-Mäusen Die Vesikel am synaptischen Band von Photorezeptoren sind nach Dunkel- und Helladaptation unterschiedlich verteilt. (A) zeigt ein typisches Beispiel eines synaptischen Bandes nach Dunkeladaptation (D), (B) ein synaptisches Band nach Helladaptation (H). (C) zeigt eine Schemazeichnung zur Vesikelverteilung an den synaptischen Bändern dunkel- (D) und helladaptierter (H) C57BL/6-Mäuse. In (D) ist der prozentuale Anteil der Vesikel an der Basis an den gesamten Vesikeln am synaptischen Band dargestellt. Aufgetragen sind die Mittelwerte und Standardabweichungen. Im Dunkeln sind deutlich mehr Vesikel an der Basis des synaptischen Bandes lokalisiert als im Hellen. Statistisch signifikante Unterschiede sind durch Sternchen angezeigt (*** p < 0,001). Größenbalken: 0,1 µm. Der prozentuale Anteil der an der Basis des synaptischen Bandes lokalisierten Vesikel an der Gesamtzahl der Vesikel wurde bestimmt. Abbildung 36D zeigt diese Anteile für die verschiedenen Adaptationszustände. In der dunkeladaptierten Retina befanden sich 38,5% (± 10,5%; n=328) der gesamten am synaptischen Band vorhandenen Vesikel an dessen Basis. In der helladaptierten Retina betrug dieser Anteil 15,4% (± 11,7%; n=272). Nach einem Dunkelstimulus waren 37,3% (± 9,9%; n=261) der Vesikel an der Basis des Bandes lokalisiert, nach einem Hellstimulus 17,5% (± 12,6%; n=482). Im Dunkeln waren damit signifikant mehr Vesikel an der Basis des synaptischen Bandes lokalisiert als im Hellen (p < 0,001) (Abbildung 36D). Dies stellt einen deutlichen Gegensatz zur gezeigten Vesikelverteilung in der Publikation von Jackman und Kollegen (2009) dar. In dieser Arbeit wurden allerdings nur die Zapfen-Photorezeptoren des Anolis untersucht. Um herauszufinden, ob es sich hierbei um einen generellen Speziesunterschied handelt, oder ob der 51

62 Ergebnisse Unterschied zwischen meinen Daten und den Ergebnissen von Jackman und Kollegen (2009) am untersuchten Typ von Photorezeptor (Stäbchen- oder Zapfen- Photorezeptor) liegt, wurde die Vesikelverteilung auch an den synaptischen Bändern der Zapfen-Photorezeptoren der Maus untersucht. Dafür wurde in den Zapfen-Photorezeptoren die Gesamtzahl der synaptischen Vesikel am Band sowie die Anzahl der Vesikel an dessen Basis bestimmt. In der dunkeladaptierten Retina umgaben durchschnittlich 11,4 (± 2,1) Vesikel ein synaptisches Band in Zapfen-Photorezeptoren. Davon befanden sich 4,6 (± 1,0) Vesikel in den unteren 100 nm des synaptischen Bandes. In helladaptierten Zapfen- Photorezeptoren befanden sich 10,6 (± 1,7) Vesikel am synaptischen Band, davon 3,2 (± 1,1) Vesikel an dessen Basis. Nach einem Dunkelstimulus waren 11,5 (± 2,3) Vesikel an einem synaptischen Band gebunden, davon 4,1 (± 1,3) Vesikel an der Basis. Nach einem Hellstimulus waren 4,2 (± 1,2) von durchschnittlich 12,0 (± 2,5) Vesikeln an der Basis eines synaptischen Bandes lokalisiert. Es fanden sich somit in den Zapfen-Photorezeptoren keine Unterschiede in der Gesamtzahl der Vesikel am synaptischen Band zwischen den verschiedenen Adaptationszuständen. In Abbildung 37 ist der prozentuale Anteil der Vesikel an der Basis des synaptischen Bandes an den gesamten Vesikeln am Band dargestellt. Abbildung 37: Vesikelverteilung am synaptischen Band in Zapfen-Photorezeptoren Es ist der prozentuale Anteil der Vesikel an der Basis an den gesamten Vesikeln am synaptischen Band von Zapfen- Photorezeptoren dargestellt. Aufgetragen sind die Mittelwerte und Standardabweichungen. Statistisch signifikante Unterschiede sind durch Sternchen angezeigt (*** p < 0,001). In dunkeladaptierten Zapfen-Photorezeptoren waren 41,3% (± 9,0%; n=48) der gesamten Vesikel an der Basis eines synaptischen Bandes lokalisiert. In helladaptierten Zapfen-Photorezeptoren betrug dieser Anteil 30,8% (± 10,5%; n=45). Nach einem Dunkelstimulus waren 35,8% (± 9,8%; n=31) der Vesikel an der Basis eines synaptischen Bandes lokalisiert, nach einem Hellstimulus 35,1% (± 9,2%; 52

63 Ergebnisse n=86). In dunkeladaptierten Zapfen-Photorezeptoren waren damit signifikant mehr Vesikel an der Basis des synaptischen Bandes in Zapfen-Photorezeptoren lokalisiert als nach Helladaptation (p < 0,001). Dieser Unterschied war allerdings nicht so deutlich wie in den Stäbchen-Photorezeptoren und ließ sich zwischen einem Dunkelund Hellstimulus nicht feststellen (Abbildung 37). Auch meine Ergebnisse zur Vesikelverteilung in den Zapfen-Photorezeptoren der Maus decken sich nicht mit den Daten von Jackman und Kollegen (2009) aus dem Anolis. Daher handelt es sich vermutlich um einen generellen Speziesunterschied. 53

64 Diskussion 3 Diskussion Die Retina empfängt und überträgt Lichtintensitäten über einen weiten dynamischen Bereich von schwachem Mondlicht mit nur wenigen Photonen bis zu hellem Sonnenlicht. Die Unterschiede in den Lichtintensitäten umspannen dabei mehr als zehn Größenordnungen (Arshavsky & Burns, 2012), weshalb adaptive Vorgänge eine wichtige Rolle für das Funktionieren des visuellen Systems spielen. Adaptationsmechanismen finden sich auf allen Ebenen der retinalen Signalübertragung. Die ersten adaptiven Prozesse laufen dabei schon in den Außensegmenten der Photorezeptoren ab. Von der Transduktion bis zur Transmission finden sich Regulationsmechanismen, die die Aktivität des Photorezeptors lichtabhängig regulieren (Arshavsky & Burns, 2012; Gießl et al., 2010). Die von den Außensegmenten generierten, fein abgestuften Veränderungen des Membranpotentials müssen an der Photorezeptor-Bandsynapse an die nachgeschalteten Neurone weitergeleitet werden. Die Bandsynapsen der Stäbchenund Zapfen-Photorezeptoren sind daher darauf spezialisiert, sehr schnell und langanhaltend große Mengen des Neurotransmitters Glutamat freizusetzen und die Freisetzungsrate kontinuierlich und präzise an die Änderungen des Membranpotentials anzupassen (Heidelberger et al., 2005; Matthews & Fuchs, 2010). Sie gehören damit zu den effizientesten und komplexesten chemischen Synapsen im Zentralnervensystem. Während relativ viel über die Adaptationsmechanismen in der Phototransduktionskaskade bekannt ist, weiß man noch sehr wenig darüber, wie die Transmitterausschüttung an den Photorezeptor- Bandsynapsen an verschiedene Lichtbedingungen angepasst wird (Gießl et al., 2010; Regus-Leidig & Brandstätter, 2012). In der Literatur werden dynamische strukturelle Veränderungen der synaptischen Bänder als ein möglicher adaptiver Mechanismus diskutiert (Adly et al., 1999; Spiwoks-Becker et al., 2004). In den Untersuchungen wurde gezeigt, dass die synaptischen Bänder in Photorezeptoren dynamische Organelle sind, von denen sich im Hellen Bandmaterial abschnürt, wodurch die synaptischen Bänder schrumpfen und im Dunkeln Bandmaterial zugefügt wird, wodurch die synaptischen Bänder wieder wachsen. Da in Photorezeptoren die Freisetzung des Neurotransmitters Glutamat im Dunkeln ihr Maximum erreicht und mit steigender Lichtintensität sinkt, 54

65 Diskussion lag die Vermutung nahe, dass diese strukturellen Veränderungen der synaptischen Bänder eine funktionelle Bedeutung für die Transmitterfreisetzung haben könnten (Spiwoks-Becker et al., 2004). Im Dunkeln, wenn die Freisetzungsrate am höchsten ist, sind die synaptischen Bänder am längsten und können daher mehr synaptische Vesikel binden. Im Hellen sind die synaptischen Bänder kürzer und binden daher weniger Vesikel. Zusätzlich könnte auch das Wiederauffüllen des synaptischen Bandes mit Vesikeln bei kürzeren Bändern beeinträchtigt sein (Spiwoks-Becker et al., 2004). Daraus wurde geschlossen, dass die synaptischen Bänder möglicherweise im Dunkeln mehr und im Hellen weniger Vesikel zur Freisetzung bereitstellen, was zur Adaptation der Synapse an verschiedene Lichtbedingungen beitragen könnte (Spiwoks-Becker et al., 2004). Spiwoks-Becker und Kollegen (2004) konnten auch zeigen, dass die strukturellen Veränderungen der synaptischen Bänder in Photorezeptoren nicht endogen durch den circadianen Rhythmus reguliert sind, sondern exogen durch Licht ausgelöst werden. Unter konstanter Dunkelheit oder konstantem Licht traten keine strukturellen Veränderungen an den synaptischen Bändern auf (Spiwoks-Becker et al., 2004). Auch die Ausdehnung der synaptischen Bänder in den Photorezeptor-Terminalien wurde in vielen Studien untersucht. Dabei waren die Untersuchungsergebnisse sehr variabel. In manchen Studien waren die synaptischen Bänder im Hellen länger (Spadaro et al., 1978; Rao-Mirotznik et al., 1995), in anderen Studien kürzer (Vollrath et al., 1989; Hermes et al., 1992). In wieder anderen Arbeiten fanden die Autoren keine lichtabhängigen Größenänderungen der synaptischen Bänder (McCartney & Dickson, 1985; Williams et al., 1985). Die Gründe für die sehr unterschiedlichen Untersuchungsergebnisse liegen wahrscheinlich in der Art der verwendeten Messmethoden, in den unterschiedlichen Schnittebenen durch die synaptischen Bänder sowie in den verwendeten Tierarten. In einer Studie von Balkema und Kollegen (2001) wurde die Länge der synaptischen Bänder von C57BL/6- und B6 c-2j -Mäusen im circadianen Rhythmus untersucht und im Verhaltensversuch mit Veränderungen der Sehschwelle korreliert. Die Autoren fanden tageszeitlich bedingte Unterschiede in der Länge der synaptischen Bänder. Die längsten Bänder traten dabei in beiden Mausstämmen nach zweistündiger, die kürzesten nach sechsstündiger Helladaptation auf (Balkema et al., 2001). Dabei korrelierte die niedrigste Sehschwelle zeitlich mit dem Auftreten der längsten synaptischen Bänder und die höchste Sehschwelle mit dem Auftreten 55

66 Diskussion der kürzesten synaptischen Bänder. Auch waren die synaptischen Bänder in den albinotischen B6 c-2j -Mäusen generell kürzer und die Sehschwelle höher als in den pigmentierten C57BL/6-Mäusen (Balkema et al., 2001). Strukturelle Veränderungen synaptischer Bänder lassen sich auch pharmakologisch mit EGTA auslösen. Über diesen Ca 2+ -Chelator wird die Ca 2+ - Konzentrationen erniedrigt und somit der Hellzustand in Photorezeptor-Terminalien imitiert. Spiwoks-Becker und Kollegen (2004) nutzten diesen experimentellen Ansatz, um zu zeigen, dass die strukturellen Veränderungen der synaptischen Bänder in Balb/c-Mäusen von der Ca 2+ -Konzentration abhängig sind und damit möglicherweise über Veränderungen im Photorezeptor-Membranpotential gesteuert werden. Da der Großteil der Daten zu den strukturellen Veränderungen der synaptischen Bänder in Photorezeptoren aus Untersuchungen an albinotischen Balb/c-Mäusen stammt, war es die Zielsetzung meiner Doktorarbeit, herauszufinden, ob strukturelle Veränderungen der Bandsynapsen ein allgemein gültiges Funktionsprinzip in der Adaptation an unterschiedliche Lichtintensitäten darstellen und welche präsynaptischen Proteine des Bandsynapsen-Komplexes an diesen dynamischen Veränderungen beteiligt sind. 3.1 Strukturelle Veränderungen synaptischer Bänder von Stäbchen- Photorezeptoren sind abhängig vom Mausstamm Der pigmentierte C57BL/6-Mausstamm ist der am häufigsten verwendete Mausstamm und viele Knockout-Mäuse werden auf diesem genetischen Hintergrund gezüchtet. In dieser Arbeit wurden C57BL/6-Mäuse verschiedenen Lichtbedingungen ausgesetzt, und die strukturellen Veränderungen der synaptischen Bänder wurden mittels Licht- und Elektronenmikroskopie untersucht. Die Erscheinungsformen der synaptischen Bänder der Stäbchen-Photorezeptoren stäbchen-, keulen- oder kugelförmig unterschieden sich in den C57BL/6-Mäusen nicht zwischen den verschiedenen Lichtbedingungen. Auch bei der Höhenausdehnung der synaptischen Bänder (von der Basis an der aktiven Zone bis zum distalen Ende) und der Längenausdehnung der synaptischen Bänder und aktiven Zonen (Länge der hufeisenförmigen RIBEYE- bzw. Bassoon-Färbung) wurden weder lichtabhängige noch circadiane Unterschiede gefunden. Nur nach 56

67 Diskussion Belichtung mit 1000 Lux hellem Licht konnten in einigen Terminalien strukturelle Veränderungen synaptischer Bänder ausgelöst werden. Es trat vermehrt kugelförmiges Bandmaterial auf, während die Höhe der synaptischen Bänder kleiner wurde. Dieser Befund unterscheidet sich von den Ergebnissen von Balkema und Kollegen (2001), die im Tagesverlauf sowohl bei C57BL/6- als auch bei B6 c-2j -Mäusen unterschiedlich lange synaptische Bänder fanden. Es ist möglich, dass wir mit den Zeiten, zu denen unsere Tiere präpariert wurden, einen leichten circadianen Effekt übersehen. Ein anderer Grund für die unterschiedlichen Ergebnisse könnte sein, dass in der Arbeit von Balkema und Kollegen (2001) andere Lichtintensitäten verwendet wurden. Obwohl in beiden Arbeiten die gleichen Mausstämme verwendet wurden, ist es möglich, dass sich der genetische Hintergrund unserer Tiere und der von Balkema und Kollegen (2001) verwendeten Tiere aufgrund der weiteren Zucht in der eigenen Haltung unterschieden. Im Unterschied zu den C57BL/6-Mäusen traten in helladaptierten Balb/c-Mäusen deutliche strukturelle Veränderungen auf, wie sie auch schon in vorherigen Publikationen beschrieben wurden (Adly et al., 1999; Spiwoks-Becker et al., 2004). Die synaptischen Bänder der Stäbchen-Photorezeptoren erschienen im Hellen sowohl licht- als auch elektronenmikroskopisch stark abgebaut. Es schnürte sich vermehrt Bandmaterial ab, was die Häufigkeit hufeisenförmiger (Lichtmikroskopie) oder stäbchenförmiger synaptischer Bänder (Elektronenmikroskopie) signifikant verminderte. Des Weiteren waren die verbliebenen stäbchenförmigen synaptischen Bänder im Hellen deutlich kürzer als im Dunkeln. Dabei gab es keinen Unterschied zwischen den Retinae, die nach Helladaptation und nach einem Hellstimulus präpariert wurden. Wie schon von Spiwoks-Becker und Kollegen (2004) gezeigt, gab es keinen circadianen Einfluss auf die Struktur und Größe der synaptischen Bänder in Balb/c-Mäusen. Das Ausbleiben der lichtabhängigen strukturellen Veränderungen im pigmentierten C57BL/6-Stamm legt die Vermutung nahe, dass ein lichtabhängiger struktureller Umbau der synaptischen Bänder, wie er in Balb/c-Mäusen stattfindet, kein genereller Mechanismus zur Adaptation der Photorezeptor-Bandsynapse an verschiedene Lichtbedingungen sein kann. In albinotischen Tieren findet man verschiedenste biochemische, physiologische, neuronale und sensorische Defekte und in allen albinotischen Säugetieren treten 57

68 Diskussion Veränderungen des visuellen Systems auf (Creel, 1980). Auch von einem evolutionären Gesichtspunkt aus stellen albinotische Tiere das am wenigsten repräsentative Tiermodell dar (Creel, 1980). Aus diesen Gründen stellt sich generell die Frage, ob es für Untersuchungen des Sehsystems sinnvoll ist, auf albinotische Tiere zurückzugreifen. 3.2 Der Albinismus ist nicht der Grund für die strukturellen Veränderungen synaptischer Bänder von Stäbchen-Photorezeptoren in Balb/c-Mäusen Um herauszufinden, ob der Unterschied in den strukturellen Veränderungen an den Bandsynapsen der Stäbchen-Photorezeptoren der beiden Mausstämme C57BL/6 und Balb/c durch die fehlende Pigmentierung in den Balb/c-Mäusen begründet ist, untersuchte ich den B6 c-2j -Mausstamm dieser Mausstamm wurde auch in der bereits zuvor erwähnten Veröffentlichung von Balkema und Kollegen (2001) untersucht. B6 c-2j -Mäuse haben den gleichen genetischen Hintergrund wie C57BL/6- Mäuse, sind jedoch aufgrund einer Punktmutation im Tyrosinase-Gen albinotisch (Le Fur et al., 1996). Eine Mutation in diesem Gen ist auch für den Albinismus der Balb/c-Mäuse verantwortlich (Shibahara et al., 1990). Nach Helladaptation traten in B6 c-2j -Mäusen geringfügig mehr strukturelle Veränderungen an den synaptischen Bändern der Stäbchen-Photorezeptoren auf als in C57BL/6-Mäusen, aber deutlich weniger als in den Balb/c-Mäusen. Diese geringfügigen Veränderungen sind vermutlich darauf zurückzuführen, dass durch die fehlende Pigmentierung mehr Licht auf die Retina fällt. Die dramatischen strukturellen Veränderungen an den Stäbchen-Photorezeptor-Bandsynapsen der Balb/c-Mäuse lassen sich damit nicht allein durch die fehlende Pigmentierung erklären. Sie sind wahrscheinlich ein Resultat der Vielzahl an genetischen Veränderungen, die die Balb/c-Mäuse aufweisen. 58

69 Diskussion 3.3 ERG-Messungen an pigmentierten und albinotischen Mäusen zeigen eine Fehlfunktion in der Retina von Balb/c-Mäusen Ein weiteres Argument dafür, dass die Retina von Balb/c-Mäusen defekt ist, lieferten Elektroretinogramm- (ERG-) Messungen, die an den drei Mausstämmen C57BL/6, B6 c-2j und Balb/c durchgeführt wurden. Dabei wurden die Antworten dunkel- und helladaptierter Mäuse auf Flickerstimuli verschiedener Frequenzen untersucht (Fuchs et al., 2012a). Während die Antworten in den C57BL/6- und B6 c-2j -Mäusen klar erkennbar waren und sich nur leicht unterschieden, war die Funktion der Retina von Balb/c-Mäusen deutlich verändert. Die Balb/c-Mäuse zeigten unabhängig vom Adaptationszustand keinerlei Antworten auf die Flickerstimuli. Die fehlenden Antworten in Balb/c-Mäusen nach Helladaptation könnten durch die dramatischen strukturellen Veränderungen der synaptischen Bänder erklärt werden. Aber auch in dunkeladaptierten Balb/c-Mäusen mit nahezu normaler Struktur der synaptischen Bänder waren die ERG-Antworten praktisch nicht vorhanden (Fuchs et al., 2012a). Damit sprechen auch die Ergebnisse der ERG-Messungen dafür, dass sich die Unterschiede zwischen C57BL/6- und Balb/c-Mäusen nicht allein durch den Albinismus erklären lassen, sondern nur durch weitere Gendefekte in den Balb/c- Mäusen. So wurde beispielsweise gezeigt, dass Balb/c-Mäuse empfindlicher auf einen Lichtschaden reagieren als B6 c-2j -Mäuse (LaVail et al., 1987), was sich vermutlich auf Variationen im Rpe65-Gen im Pigmentepithel zurückführen lässt (Danciger et al., 2000). Das vermehrte Auftreten kugelförmiger synaptischer Bänder in helladaptierten Balb/c-Mäusen könnte daher einen Abbau synaptischer Bänder als Folge eines Lichtschadens darstellen. 3.4 Strukturelle Veränderungen synaptischer Bänder als Zeichen von Degeneration Freiliegendes, kugelförmiges synaptisches Bandmaterial wurde in der Entwicklung der Retina als Vorläufer synaptischer Bänder beschrieben (Blanks et al., 1974; Regus-Leidig et al., 2009) oder in der adulten Retina als Zeichen ablaufender pathologischer Prozesse in Photorezeptoren und an deren Synapsen (Dick et al., 59

70 Diskussion 2003; Haeseleer et al., 2004; Grossman et al., 2009; Reim et al., 2009; Fuchs et al., 2012b). In den Photorezeptor-Terminalien von Mäusen, denen das präsynaptische Cytomatrixprotein Bassoon fehlt, sind die synaptischen Bänder nicht an der aktiven Zone verankert und lösen sich in kugelförmiges Bandmaterial auf (Dick et al., 2003; Regus-Leidig et al., 2010a). Einen ähnlichen synaptischen Phänotyp findet man in Capb4 -/- -Mäusen. Diesen fehlt das Ca 2+ -bindende Protein CaBP4, welches die Aktivität der L-Typ Ca v 1.4-Kanäle an den aktiven Zonen von Photorezeptoren moduliert (Haeseleer et al., 2004). Das Protein Tulp1 ist an ciliären Transportprozessen in Photorezeptoren beteiligt. In tulp1 -/- -Mäusen ist die Funktion des Photorezeptors und mit ihm die Entwicklung der Photorezeptor-Bandsynapse gestört, und man findet strukturell veränderte synaptische Bänder (Grossman et al., 2009). Eine weitere Maus, in der man mit zunehmendem Alter vermehrt kugelförmiges Bandmaterial findet, ist die Cplx3/4-Doppelknockout-Maus, der die beiden regulatorischen Proteine Complexin 3 und 4 des SNARE-Komplexes fehlen (Reim et al., 2009). Die DBA/2J-Maus stellt ein gängiges Mausmodell für Glaukom dar. In diesen Tieren fanden wir ebenfalls einen Bandsynapsen-Phänotyp in den Terminalien der Stäbchen-Photorezeptoren, wobei die strukturellen, degenerativen Veränderungen mit fortschreitendem Alter deutlich zunahmen (Fuchs et al., 2012b). Die degenerativen Veränderungen an den Photorezeptor-Bandsynapsen der verschiedenen genannten Mausstämme ähneln sehr stark den lichtinduzierten strukturellen Veränderungen an den Bandsynapsen der Balb/c-Mäuse. Die Bandsynapsen in den Balb/c-Mäusen sind jedoch nicht irreversibel geschädigt, sondern werden wieder aufgebaut, sobald die Photorezeptoren dunkeladaptieren. 3.5 Die strukturellen Veränderungen synaptischer Bänder betreffen die Proteine des Bandkompartiments In einer Studie aus unserer Gruppe wurde ein in vitro-ansatz von Spiwoks-Becker und Kollegen (2004) genutzt, um in C57BL/6-Mäusen strukturelle Veränderungen der synaptischen Bänder auszulösen (Regus-Leidig et al., 2010b). Über experimentell veränderte Ca 2+ -Konzentrationen konnten die strukturellen Veränderungen der synaptischen Bänder mit der Umverteilung präsynaptischer Proteine in 60

71 Diskussion Zusammenhang gebracht werden. Während die Proteine der arciformen Dichte / Plasmamembran unter niedrigen Ca 2+ -Konzentrationen relativ stabil waren, bildeten die Proteine des Bandkompartiments kugelförmiges Bandmaterial (Regus-Leidig et al., 2010b). Dies korreliert gut mit meinen Ergebnissen aus den immuncytochemischen Färbungen an den Retinae von Balb/c-Mäusen. Auch hier zeigte sich, dass Proteine des Bandkompartiments (RIBEYE, Piccolo) lichtabhängigen strukturellen Veränderungen unterworfen sind, während Proteine der arciformen Dichte / Plasmamembran (Bassoon, Cacna1f) ihre Position im synaptischen Terminal unabhängig vom Adaptationszustand beibehalten. 3.6 Lichtabhängige Veränderungen in der Genexpression und den Proteinmengen präsynaptischer Proteine an den Photorezeptor-Bandsynapsen Da in C57BL/6-Mäusen keine adaptationsabhängigen strukturellen Veränderungen an den synaptischen Bändern auftraten und ein Umbau der Bandsynapsen damit als adaptiver Mechanismus ausscheidet, wurde mittels PCR-Analysen nach anderen lichtabhängigen Veränderungen in den Photorezeptoren von C57BL/6-Mäusen gesucht. So war zum Beispiel die Expression von Complexin 3 und Complexin 4 im Hellen höher als im Dunkeln, ein Unterschied, der allerdings nach einem Dunkelstimulus nicht auftrat, der aber dennoch auf eine mögliche adaptive Funktion der Complexine hindeuten könnte. Auch die Expression der Ca 2+ -Kanal-Untereinheit Cacna1f variierte zwischen den verschiedenen Adaptationszuständen. Dabei war die Expression nach Helladaptation höher als nach Dunkeladaptation. Dieses Ergebnis deckt sich mit dem Ergebnis der Western Blot Analyse, in der die Menge an Cacna1f im Dunkeln ebenfalls erniedrigt war. Allerdings ist nicht klar, ob der verwendete Antikörper Panα1 nicht auch andere Ca 2+ -Kanal-Untereinheiten in der Retina detektiert, und es ist auch nicht sichergestellt, dass Unterschiede in den Proteinmengen, die in der gesamten Retina gefunden wurden, sich auf die Photorezeptoren zurückführen lassen. Dazu müssten isolierte Photorezeptoren für die Western Blot Analyse verwendet werden. 61

72 Diskussion Im Dunkeln war die Expression der Bassoon- und Piccolo-Transkripte im Verhältnis zum helladaptierten Zustand erhöht. Es ließen sich jedoch mit Antikörpern gegen Bassoon und Piccolino die bandsynapsen-spezifische Form von Piccolo keine Änderungen der Proteinmengen feststellen. Bassoon findet man außer an Bandsynapsen auch an den konventionellen chemischen Synapsen der Retina. Piccolino ist zwar spezifisch für Bandsynapsen, ist jedoch neben den Photorezeptoren auch in Bipolarzellen vorhanden. Da es also bei der Verwendung von Gesamtretina-Material zu einer Vermischung von Bandsynapsen und konventionellen Synapsen und von Photorezeptor- und Bipolarzell-Bandsynapsen kommt, lässt sich keine sichere Aussage über Veränderungen von Bassoon und Piccolo an Photorezeptor-Bandsynapsen treffen. Auch dafür müssten die Proteinmengen in isolierten Photorezeptoren untersucht werden. Sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene war die RIBEYE-Menge im Dunkeln höher als im Hellen. RIBEYE ist ebenfalls spezifisch für Bandsynapsen. Da jedoch auch die Bipolarzellen der Retina RIBEYE exprimieren, lässt sich auch im Fall von RIBEYE nicht mit Sicherheit sagen, ob die Unterschiede in der Proteinmenge von den Photorezeptoren herrühren. In einer Studie von Schwarz und Kollegen (2011) konnte gezeigt werden, dass die B-Domäne von RIBEYE Phosphatidsäure, ein hoch aktives Phospholipid, synthetisiert. Phosphatidsäure beeinflusst die Krümmung von Membranen und könnte damit in Photorezeptoren an Schritten der Exo- und Endocytose beteiligt sein (Schwarz et al., 2011). Basierend auf der Funktion von Phosphatidsäure in anderen Systemen spekulieren die Autoren in ihrer Arbeit, dass die Phosphatidsäure an Bandsynapsen die Vesikelfusion bei der Exocytose erleichtern könnte. Möglicherweise wird durch die erhöhte RIBEYE-Menge im Dunkeln mehr Phosphatidsäure gebildet, was einen adaptiven Effekt auf die synaptische Übertragung an den Photorezeptor-Bandsynapsen haben könnte. 62

73 Diskussion 3.7 Endocytose in Photorezeptoren In den Photorezeptor-Terminalien von C57BL/6-Mäusen wurden im Dunkeln Anhäufungen von Vesikeln gefunden, die sich immer in der Nähe der synaptischen Bänder und postsynaptischen Invaginationen befanden. Diese Vesikel sind miteinander verbunden und bilden verzweigte, tubuläre Strukturen. Sie erscheinen deutlich elektronendichter und damit dunkler als synaptische Vesikel. Ähnliche Strukturen wurden in einer Studie von Koenig und Ikeda (1996) in den Photorezeptoren von Drosophila beschrieben und spielen dort eine Rolle bei der Endocytose. Anders als an den meisten konventionellen chemischen Synapsen wird an Bandsynapsen der Transmitter tonisch freigesetzt (Heidelberger et al., 2005). Die Vesikelmembran, die bei der Exocytose mit der Plasmamembran verschmilzt, muss über den Vorgang der Endocytose zurückgewonnen werden (Royle & Lagnado, 2003). Um die hohen Exocytoseraten an Bandsynapsen aufrecht zu erhalten, bedarf es auch einer hohen Endocytoserate. Zur Endocytose an Bandsynapsen werden verschiedene Mechanismen diskutiert (LoGiudice & Matthews, 2007). Zum einen ist es möglich, dass einzelne umhüllte (coated) oder nicht umhüllte (uncoated) Membranvesikel aufgenommen werden. Es wird aber auch die Aufnahme großer Membrankompartimente diskutiert, von denen sich anschließend Vesikel abschnüren (bulk endocytosis). In den Photorezeptor-Terminalien von Drosophila wurden zwei verschiedene Mechanismen der Endocytose beschrieben (Koenig & Ikeda, 1996). Der langsamere dieser beiden Endocytose-Wege läuft bei starken Stimuli außerhalb der aktiven Zone ab und beinhaltet endosomale Zwischenstufen. Hierbei bilden sich zunächst tubulär verzweigte Strukturen, von denen sich dann umhüllte Vesikel abschnüren (Koenig & Ikeda, 1996; Betz & Angleson, 1998). Dieser Mechanismus ist vermutlich Clathrinvermittelt (Betz & Angleson, 1998). Die in dieser Arbeit gezeigten Vesikel in den Photorezeptor-Terminalien der Maus ähneln diesen Strukturen aus Drosophila und könnten daher ebenfalls eine Zwischenstufe des Clathrin-vermittelten Endocytose- Weges darstellen, welcher zuerst von Heuser und Reese (1973) beschrieben wurde. Auch an den Bipolarzellen der Goldfischretina konnten mit Hilfe von Kapazitätsmessungen verschieden schnelle Endocytoseraten bestimmt werden (von Gersdorff & Matthews, 1994). Peptide, welche die Clathrin-vermittelte Endocytose 63

74 Diskussion blockieren, beeinflussten die langsame, aber nicht die schnelle Komponente der Endocytose (Jockusch et al., 2005). Daher wird der langsame, nicht jedoch der schnelle Endocytose-Weg in den Bipolarzellen des Goldfisches durch Clathrin vermittelt. Welcher Mechanismus hinter der schnellen Komponente der Endocytose steht, ist noch unklar. Vermutet wird jedoch eine Beteiligung von Endophilin, da Endophilin-bindende Peptide die schnelle Komponente der Endocytose blockieren (Llobet et al., 2011). Eine Kiss-and-Run-Endocytose, wie man sie als schnelle Endocytoseform an konventionellen chemischen Synapsen kennt, ist in den Bipolarzellen des Goldfisches unwahrscheinlich, da die Vesikel hier vollständig mit der präsynaptischen Plasmamembran fusionieren (Zenisek et al., 2002). Ultrastrukturell wurde in den Bipolarzellen des Goldfisches die Aufnahme großer Membrankompartimente beobachtet, von welchen sich anschließend synaptische Vesikel abschnürten (Holt et al., 2003; Paillart et al., 2003). Auch dieser Mechanismus ist noch nicht komplett aufgeklärt. Möglicherweise spielt Clathrin beim Abschnüren der Vesikel vom Endosom eine Rolle (Takei et al., 1996; Lenzi et al., 2002). Es konnte noch nicht mit Sicherheit geklärt werden, ob es auch in den Bipolarzellen der Maus verschieden schnelle Phasen der Endocytose gibt (Wan & Heidelberger, 2011). In einer Arbeit von LoGiudice und Kollegen (2009) konnte jedoch gezeigt werden, dass Endocytose in den Bipolarzellen der Maus hauptsächlich über die Aufnahme einzelner Clathrin-umhüllter Vesikel stattfindet. Die unterschiedlichen Endocytose-Mechanismen in den Bipolarzellen des Goldfisches und der Maus erklären die Autoren mit der unterschiedlichen Größe dieser Zellen. Die Bipolarzellen des Goldfisches sind sehr groß und besitzen einen großen Reservepool an Vesikeln, welcher Endocytose über die Aufnahme großer Membrankompartimente zulässt. Im Gegensatz dazu sind die Bipolarzell-Terminalien der Maus sehr klein und haben einen kleinen Pool an Vesikeln, weshalb Endocytose in diesen Zellen über die Aufnahme einzelner Clathrin-umhüllter Vesikel abläuft (LoGiudice & Matthews, 2007; LoGiudice et al., 2009). Im Unterschied zu den Bandsynapsen in Bipolarzellen gibt es kaum aussagekräftige experimentelle Daten zu den Endocytose-Mechanismen an den Bandsynapsen in Photorezeptoren. In einigen Arbeiten wurde die Aufnahme von Endocytose-Markern in Photorezeptoren untersucht (Ripps et al., 1976; Schacher et al., 1976; Townes-Anderson et al., 1985; Rea et al., 2004), allerdings noch nicht in 64

75 Diskussion der Maus. In diesen Studien waren hauptsächlich einzelne synaptische Vesikel markiert, von denen einige Clathrin-Hüllen besaßen. Daher wird vermutet, dass der Clathrin-vermittelte Mechanismus an der Endocytose in Photorezeptoren beteiligt ist (LoGiudice & Matthews, 2007). In verschiedenen früheren ultrastrukturellen Arbeiten (Yamada 1965; Samorajski et al., 1966; Lovas, 1971) wurden die Photorezeptor-Terminalien verschiedener Spezies (Mensch, Rhesusaffe, Katze, Hund und Tupaja) untersucht. Die Autoren fanden aus Tubuli bestehende Komplexe, die den hier beschriebenen Strukturen ähneln. Allerdings wurde in diesen Arbeiten noch kein funktioneller Zusammenhang mit der Umgebungsbeleuchtung oder der Endocytose untersucht. In dieser Doktorarbeit konnte nun ein Zusammenhang zwischen der Umgebungsbeleuchtung und dem Auftreten dieser elektronendichten vesikulären Strukturen gezeigt werden. Die Ähnlichkeit dieser Vesikelanhäufungen mit endocytotischen Strukturen aus Drosophila und die Tatsache, dass diese in den Maus-Photorezeptoren nur im Dunkeln auftreten wenn die höchste Exocytoserate und damit auch die höchste Endocytoserate vorliegt lässt eine endocytotische Beteiligung in den Photorezeptoren der Maus vermuten. 3.8 Lichtabhängige Veränderungen in der Ausdehnung der postsynaptischen Invaginationen Aus Untersuchungen an Retinae von Fischen ist bekannt, dass die Anzahl der Horizontalzellfortsätze, welche in die Zapfen-Photorezeptor-Terminalien invaginieren, lichtabhängig reguliert wird (Raynauld et al., 1979; Wagner, 1980). Im Hellen findet man etwa zwölf dieser Invaginationen pro Terminal, im Dunkeln nur etwa zwei (Wagner, 1980). Auch experimentell veränderte Ca 2+ -Konzentrationen haben einen Einfluss auf die Anzahl der Invaginationen (Schmitz & Drenckhahn, 1991). Allerdings bewirken hohe Ca 2+ -Konzentrationen, die im Photorezeptor eigentlich im Dunkeln vorliegen, eine Zunahme in der Anzahl der Invaginationen. Niedrige Ca 2+ - Konzentrationen vermindern hingegen den Grad der Invaginationen bis hin zum kompletten Verlust der Fortsätze (Schmitz & Drenckhahn, 1991). In der Mausretina wird die Anzahl der Invaginationen der postsynaptischen Elemente nicht variiert, 65

76 Diskussion jedoch könnte der Grad der Invaginationen einen Einfluss auf die synaptische Übertragung haben. In einer Publikation von Zampighi und Kollegen (2011) wurden die Terminalien von Stäbchen-Photorezeptoren in C57BL/6-Mäusen mittels Elektronentomographie untersucht. Dabei wurde unter anderem die Ausdehnung der postsynaptischen Invaginationen der Horizontal- und Bipolarzellen nach Hell- und Dunkeladaptation bestimmt. Die Autoren führten ihre Messungen an einzelnen Aufnahmen durch und schätzten daraus die Oberfläche und das Volumen der invaginierenden Fortsätze und Dendriten ab. Die Größe der invaginierenden Bipolarzell-Dendriten veränderte sich nicht zwischen den verschiedenen Bedingungen. Unterschiede fanden sich jedoch in der Ausdehnung der Horizontalzell-Fortsätze. Bereits 3 bis 15 Minuten nach Beginn der Dunkeladaptation vergrößerte sich die Ausdehnung der invaginierenden Horizontalzell-Fortsätze im Terminal deutlich (Zampighi et al., 2011). Die Autoren argumentierten, dass die vergrößerten Horizontalzell-Invaginationen die Volumenveränderung der Stäbchen-Photorezeptor-Terminalien in Folge der gesteigerten Exocytose kompensieren. Nach längeren Adaptationszeiten (30 bis 180 Minuten) konnten keine deutlichen Unterschiede in der Größe der invaginierenden Horizontalzell-Fortsätze mehr festgestellt werden, was die Autoren durch ein verzögertes Einsetzen der kompensatorischen Endocytose in den Photorezeptor-Terminalien erklärten (Zampighi et al., 2011). Im Zuge meiner Doktorarbeit bestimmte und verglich ich ebenfalls die Ausdehnung der postsynaptischen Invaginationen (Horizontal- und Bipolarzellen) in den Stäbchen-Photorezeptor-Terminalien hell- und dunkeladaptierter C57BL/6- Mäuse. Im Dunkeln nahmen die Fortsätze und Dendriten der Horizontal- und ON-Bipolarzellen eine größere Fläche in den Stäbchen-Photorezeptor-Terminalien ein als im Hellen. Nach dreistündiger Dunkeladaptation war die Fläche der postsynaptischen Invaginationen um den Faktor 1,13 größer als nach Helladaptation. Dies stimmt gut mit den Daten von Zampighi und Kollegen (2011) überein, bei denen die postsynaptischen Invaginationen nach dreistündiger Dunkeladaptation etwa um den Faktor 1,15 größer waren als nach Helladaptation. Bei kürzerer Dunkeladaptation fanden die Autoren jedoch deutlich größere Unterschiede in der Ausdehnung der postsynaptischen Invaginationen (bis zu einem Faktor von 2,41). Möglicherweise spielt die Größenveränderung der Horizontalzellen bei kürzeren Adaptationszeiten eine wichtige Rolle für die Adaptation. 66

77 Diskussion Darüber hinaus konnte ich feststellen, dass sich die Form der Invaginationen nach Dunkel- und Helladaptation deutlich unterschied, was von Zampighi und Kollegen (2011) nicht untersucht wurde. Nach Dunkeladaptation wölbten sich vor allem die invaginierenden Horizontalzell-Fortsätze oft um das synaptische Band, wodurch sich die Kontaktfläche zwischen den Horizontalzell-Invaginationen und den Vesikeln am synaptischen Band im Vergleich zum helladaptierten Zustand vergrößerte. Dies könnte die Fusionsrate von synaptischen Vesikeln im Dunkeln erhöhen und damit ebenfalls zur Adaptation der Photorezeptor-Bandsynapse an verschiedene Lichtbedingungen beitragen. 3.9 Vesikelverteilung am synaptischen Band Wie ich in meiner Doktorarbeit zeigen konnte, fallen strukturelle Veränderungen am Photorezeptor-synaptischen Band als allgemein gültiger adaptiver Mechanismus weg. Damit bleibt die Frage, wie Photorezeptor-Bandsynapsen an unterschiedliche Lichtverhältnisse adaptieren, weiterhin offen. Kürzlich stellten Jackman und Kollegen (2009) eine interessante neue Hypothese zur Funktion des synaptischen Bandes und der Adaptation an unterschiedliche Lichtverhältnisse auf. In Untersuchungen an den Bandsynapsen der Zapfen-Photorezeptoren einer Echse (Anolis sagrei) fanden sie Unterschiede in der Verteilung der synaptischen Vesikel am synaptischen Band nach Hell- und Dunkeladaptation. Im Dunkeln und damit bei hoher Exocytoserate waren wenige Vesikel an der Basis des synaptischen Bandes lokalisiert, während im Hellen und damit bei niedriger Exocytoserate die Basis des synaptischen Bandes vollkommen mit Vesikeln besetzt war. Dies führte zur Hypothese, dass sich das synaptische Band wie ein Kondensator verhält. Im Hellen belädt sich das synaptische Band mit Vesikeln, wodurch bei einem Dunkelstimulus in einem phasischen Schub sofort hohe Transmittermengen freigesetzt werden können. Die Autoren argumentieren, dass ein derartiger Mechanismus den Arbeitsbereich der Synapse zusätzlich zur langsamen tonischen Transmitterfreisetzung im Dunkeln erweitern würde und damit eine genauere Kodierung der Änderungen der Lichtintensitäten ermöglicht wird (Jackman et al., 2009). Ausgehend von der Arbeit von Jackman und Kollegen (2009) habe ich im letzten Teil meiner Arbeit die 67

78 Diskussion Vesikelverteilung an Photorezeptor-Bandsynapsen hell- und dunkeladaptierter C57BL/6-Mäuse untersucht. Obwohl die Gesamtzahl der Vesikel am synaptischen Band von Stäbchen- Photorezeptoren im Dunkeln nur geringfügig höher war als im Hellen, unterschied sich die Verteilung der Vesikel entlang des synaptischen Bandes. Nach Helladaptation oder nach einem Hellstimulus befanden sich deutlich weniger Vesikel an der Basis des Bandes (100 nm) als nach Dunkeladaptation oder nach einem Dunkelstimulus. Möglicherweise gibt es einen Mechanismus, der die Vesikel im Hellen von der Basis des synaptischen Bandes fernhält, und somit verhindert, dass Exocytose stattfindet. Die unterschiedliche Vesikelverteilung in den Stäbchen- Photorezeptoren der C57BL/6-Maus könnte daher einen Einfluss auf die Transmitterfreisetzung haben und damit von Bedeutung für die Adaptation sein. Die Ergebnisse zur lichtabhängigen Vesikelverteilung an den synaptischen Bändern der Stäbchen-Photorezeptoren der C57BL/6-Mausretina stehen im Gegensatz zu den Ergebnissen der Vesikelverteilung an den synaptischen Bändern der Zapfen-Photorezeptoren der Echse Anolis sagrei (Jackman et al., 2009). Aber auch in den Zapfen-Photorezeptoren der C57BL/6-Maus waren nach Dunkeladaptation mehr Vesikel an der Basis des synaptischen Bandes lokalisiert als nach Helladaptation. Die Unterschiede in der Vesikelverteilung zwischen meinen Ergebnissen und den Daten von Jackman und Kollegen (2009) lassen sich daher eher auf einen generellen Speziesunterschied zwischen Maus und Anolis als auf den Photorezeptortyp zurückführen. Wie meine Kollegin Anna Sendelbeck in ihrer Masterarbeit zeigte, finden sich an den synaptischen Bändern der Stäbchen-Photorezeptoren von Cplx3/4- Doppelknockout-Mäusen keine Unterschiede in der Vesikelverteilung zwischen Dunkel- und Helladaptation (Sendelbeck, 2011). Unabhängig vom Adaptationszustand sind die Vesikel gleichmäßig am synaptischen Band verteilt. Dies lässt vermuten, dass die Complexine 3 und 4 eine Rolle bei der Vesikel- Bereitstellung am synaptischen Band und damit bei lichtabhängigen adaptiven Prozessen spielen könnten. Dafür spricht auch die erhöhte Expression der Complexine 3 und 4 nach Helladaptation, die ich in den PCR-Analysen fand. Die Funktion der Complexine 3 und 4 an den Photorezeptor-synaptischen Bändern der Mausretina wird derzeit von Frau Sendelbeck im Rahmen ihrer Doktorarbeit im Detail untersucht. 68

79 Diskussion 3.10 Fazit In der Literatur wurde seit vielen Jahren ein lichtabhängiger Umbau der synaptischen Bänder als möglicher adaptiver Prozess an der Photorezeptor-Bandsynapse propagiert. In meiner Doktorarbeit konnte ich nun zeigen, dass das Auftreten dieser strukturellen Veränderungen vom verwendeten Mausstamm abhängt Veränderungen treten im albinotischen Balb/c-Stamm auf, nicht jedoch im pigmentierten C57BL/6-Stamm. Strukturelle Veränderungen der synaptischen Bänder können daher keinen generellen Mechanismus zur Adaptation der Photorezeptor-Bandsynapse an unterschiedliche Lichtbedingungen darstellen. Damit zeigt sich wieder, wie wichtig es ist, nicht nur ein Tiermodell zu betrachten, sondern biologische Fragestellungen an unterschiedlichen Tiermodellen und Spezies zu untersuchen, will man zu allgemein gültigen Aussagen über einen biologischen Vorgang kommen. 69

80 Material und Methoden 4 Material und Methoden 4.1 Chemikalien und Bezugsfirmen Tabelle 2: Chemikalien und Bezugsfirmen Soweit nicht anders erwähnt, stammt die Bezugsquelle aus Deutschland. Chemikalie 1,4-Dithiothreit (DTT) Aceton Agarose Amidoschwarz Ammoniumpersulfat (APS) NuPAGE Antioxidant Aqua Polymount Bicine BisTris Blocking Reagenz CA Bovines Serumalbumin (BSA) Bromphenolblau Cresylviolett Acetat DAPI Dimethylarsinsäure Natriumsalz (Cacodylat) Einbettmedium Renlam (Araldit) Epoxy-Einbettungsmedium-Kit (Epon) Essigsäure 100% Ethanol (EtOH) Ethidiumbromid-Lösung 1% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) GeneRuler 100 bp DNA Ladder Glutaraldehyd-Lösung 25% Glycerin Glycin Hepes Bezugsfirma Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf Roth, Karlsruhe Sigma-Aldrich, Taufkirchen Invitrogen, Karlsruhe Polysciences Europe, Eppelheim Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe AppliChem, Darmstadt Sigma-Aldrich, Taufkirchen Sigma-Aldrich, Taufkirchen Sigma-Aldrich, Taufkirchen Sigma-Aldrich, Taufkirchen Merck, Darmstadt Serva, Heidelberg Sigma-Aldrich, Taufkirchen Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Fermentas, St. Leon-Rot Sigma-Aldrich, Taufkirchen Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Sigma-Aldrich, Taufkirchen 70

81 Material und Methoden Chemikalie Iodacetamid iscript cdna Synthese Kit Isofluran (Forene 100%) Isopentan (n-pentan) Kaliumchlorid (KCl) Kaliumhexacyanoferrat Lumigen TM PS-3 Luminata TM Forte Western HRP Substrate Methanol (MeOH) Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O (Dinatriumhydrogenphosphat) NaH 2 PO 4 x H 2 O (Natriumdihydrogenphosphat) Natriumacetat Natriumchlorid (NaCl) Natriumcitrat Natrium-Deoxycholat Natriumdodecylsulfat (SDS) Natriumhydroxid (NaOH) Normales Ziegenserum (NGS) Orange G Osmiumtetroxid-Lösung 4% Paraformaldehyd (PFA) Pierce BCA Protein Assay Reagent A Pierce BCA Protein Assay Reagent B Ponceau S Solution Propylenoxid Protease Inhibitor (PI) Protein-Marker V Proteinstandard HiMark TM Pre-Stained Rotiphorese Gel 30 Saccharose D (+) Salzsäure (HCl) 1N / 37% SsoFast TM EvaGreen Supermix (2x) Bezugsfirma Sigma-Aldrich, Taufkirchen Bio-Rad, München Abbott, Wiesbaden Merck, Darmstadt Sigma-Aldrich, Taufkirchen Sigma-Aldrich, Taufkirchen GE Healthcare, Freiburg Millipore, Schwalbach Roth, Karlsruhe Sigma-Aldrich, Taufkirchen Sigma-Aldrich, Taufkirchen Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Sigma-Aldrich, Taufkirchen Sigma-Aldrich, Taufkirchen Roth, Karlsruhe Interchim, Montluçon, Frankreich Roth, Karlsruhe Polysciences Europe, Eppelheim Roth, Karlsruhe Thermo Scientific, München Thermo Scientific, München Sigma-Aldrich, Taufkirchen Avantor, Griesheim Roche, Mannheim Peqlab, Erlangen Life Technologies, Darmstadt Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Bio-Rad, München 71

82 Material und Methoden Chemikalie Tetramethylethylendiamin (TEMED) Tissue-Tek O.C.T. TM Compound Trichloressigsäure (TCA) Tricine Tris (Trishydroxymethylaminomethan) Triton X-100 Tween 20 Uranylacetat Dihydrat β-mercaptoethanol Bezugsfirma GE Healthcare, Freiburg Sakura, Alphen aan den Rijn, Niederlande Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Merck, Darmstadt Roth, Karlsruhe 4.2 Verwendete Lösungen Tabelle 3: Verwendete Lösungen Lösung Amidoschwarz-Lösung Ammoniumpersulfat 10% (APS) Agarose-Lösung 1,5% Antikörper-Verdünnungslösung für Immunzytochemie Blockierungslösung und Antikörperverdünnungslösung für Western Blot (ph 7,4) Zusammensetzung 14,4 g Amidoschwarz in 1000 ml Methanol- Essigsäure (9 Teile MeOH, 1 Teil Eisessig), über Nacht rühren, filtrieren 1 g in 10 ml Aqua bidest. lösen, aliquotieren, lagern bei -20 C 1,5 g Agarose in 1000 ml 1x TAE-Puffer 3% NGS 1% BSA 0,5% Triton X-100 in 0,01 M PBS 2 g Blocking Reagenz (0,2%) 1,21 g Tris (10 mm) 8,76 g NaCl (150 mm) in Aqua bidest. lösen, auf 95 C erhitzen, abkühlen lassen, ph mit HCl einstellen, Aqua bidest. ad 1000 ml 72

83 Material und Methoden Lösung Cacodylatpuffer (0,1 M; ph 7,4) Cresylviolett Färbelösung (1%) EDTA (0,5 M; ph 7,5 und 8,0) Ethidiumbromid-Gebrauchslösung (1 µg/ml) Ethidiumbromid-Stammlösung HCl-Lösung (1M) Hepes (50 mm; ph 7,5) Homogenisierungspuffer (ph 7,5) Kaliumhexacyanoferrat (6%) in Cacodylat Laufpuffer für große Proteine (20x) Zusammensetzung 2,14 g Dimethylarsinsäure Natriumsalz in Aqua bidest. lösen, ph mit HCl einstellen, Aqua bidest. ad 100 ml 1 g Cresylviolett-Acetat in 100 ml 50% EtOH über Nacht bei RT lösen, 30 Minuten bei 9500 g und 15 C zentrifugieren, Überstand abgießen 146,1 g in Aqua bidest. lösen, ph mit NaOH einstellen, Aqua bidest. ad 1000 ml 80 µl Stammlösung Aqua bidest. ad 400 ml 0,5% in Aqua bidest. 36,46 g HCl Aqua bidest. ad 1000 ml 1,19 g Hepes in Aqua bidest. lösen, ph mit HCl einstellen, Aqua bidest. ad 100 ml 320 mm Saccharose 4 mm Hepes in Aqua bidest. lösen, ph mit NaOH einstellen, vor Gebrauch Protease Inhibitor frisch zusetzen 0,6 g Kaliumhexacyanoferrat in 10 ml Cacodylatpuffer 121 g TrisBase 179 g Tricine 20 g SDS Aqua bidest. ad 1000 ml vor Gebrauch 1:20 mit Aqua bidest. verdünnen 73

84 Material und Methoden Lösung Laufpuffer für kleine Proteine (10x; ph 8,4) NaOH-Lösung (1M) Paraformaldehyd (PFA; 4%) Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS; 10x; 0,1 M; ph 7,4) Phosphatpuffer (PB; 0,2 M; ph 7,4) Präinkubationslösung für Immunzytochemie Protease-Inhibitor (PI) Zusammensetzung 30 g Tris (250 mm) 144 g Glycin (1,92 M) 10 g SDS (1%) Aqua bidest. ad 1000 ml vor Gebrauch 1:10 mit Aqua bidest. verdünnen 40,01 g NaOH Aqua bidest. ad 1000 ml 4% in 0,1 M PB im Wasserbad bei 65 C unter ständigem Rühren lösen und anschließend filtrieren 21,76 g Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O 2,76 g NaH 2 PO 4 x H 2 O 2 g KCl 87,6 g NaCl Aqua bidest. ad 1000 ml, ph mit HCl einstellen vor Gebrauch 1:10 mit Aqua bidest. verdünnen 43,42 g Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O 5,24 g NaH 2 PO 4 x H 2 O Aqua bidest. ad 1000 ml vor Gebrauch 1:1 mit Aqua bidest. verdünnen 10% NGS 1% BSA 0,5% Triton X-100 in 0,01 M PBS 1 Tablette in 1 ml Aqua bidest. lösen, aliquotieren, lagern bei -20 C 74

85 Material und Methoden Lösung RIPA-Lysepuffer (ph 8,0) RNAse Wash Saccharose-Lösung 10%, 20%, 30% Sammelgelpuffer (4x; ph 6,8) SDS Lösung (10%) SDS-Probenpuffer (1,5x; ph 8,5) Transferpuffer Trenngelpuffer (4x; ph 8,8) Zusammensetzung 5 ml 1 M Tris HCl-Lösung (ph 7,5) 0,88 g NaCl 1 ml Triton X-100-Stammlösung 1 ml 10%ige SDS-Lösung 0,5 g Natrium-Deoxycholat ph mit HCl einstellen, Aqua bidest. ad 100 ml 4 g NaOH 0,37 g EDTA in 1000 ml Aqua bidest. lösen 10%, 20%, 30% in 0,01 M PBS 60,6 g Tris (1,0 M) in Aqua bidest. lösen, ph mit HCl einstellen, auf RT abkühlen lassen, erneut ph einstellen, Aqua bidest. ad 500 ml 10 g SDS Aqua bidest. ad 100 ml 10 ml Glycerin 3,03 g Tris 2 g SDS 100 µl EDTA-Lösung (0,5 M; ph 8,0) 10 mg Bromphenolblau ph mit HCl einstellen 30 mg DTT pro ml Puffer hinzufügen 16,4 g Bicine 21 g BisTris 4 ml 10%ige SDS-Lösung 8 ml 0,5 M EDTA-Lösung (ph 7,5) Aqua bidest. ad 3800 ml vor Gebrauch 200 ml Methanol zugeben 90,1 g Tris in Aqua bidest. lösen, ph mit HCl einstellen, auf RT abkühlen lassen, erneut ph einstellen, Aqua bidest. ad 500 ml 75

86 Material und Methoden Lösung Tris HCl-Lösung (1 M; ph 7,5) Trisacetat/EDTA/Elektropuffer (TAE; 10x; ph 8,3) Tris-gepufferte Salzlösung (TBS; 10x; ph 7,5) Tris-gepufferte Salzlösung mit Tween 20 (TBS-T) Triton X-100-Stammlösung Uranylacetat (0,5%) in 70% EtOH Zusammensetzung 121,1 g Tris in Aqua bidest. lösen ph mit HCl einstellen, Aqua bidest. ad 1000 ml 242,26 g Tris (0,04 M) 82,03 g Natriumacetat (0,02 M) 23,27 g EDTA (1,25 M) Aqua bidest ad 5000 ml ph mit Essigsäure einstellen vor Gebrauch 1:10 mit Aqua bidest. verdünnen 12,1 g Tris (100 mm) 175,3 g NaCl (3 M) In Aqua bidest. lösen, ph mit HCl einstellen, Aqua bidest. ad 1000 ml vor Gebrauch 1:10 mit Aqua bidest. verdünnen 1 ml Tween 20 in 1000 ml 1x TBS lösen 5% in PB oder PBS 0,1 g Uranylacetat in 20 ml 70% EtOH lösen, steril filtrieren 76

87 Material und Methoden 4.3 Verwendete Antikörper Alle verwendeten Maus-Antikörper sind monoklonal, die Antikörper aus Kaninchen und Meerschweinchen sind polyklonal. Tabelle 4: Verwendete Primärantikörper gp = Meerschweinchen (englisch: guinea pig); ms = Maus (englisch: mouse); rb = Kaninchen (englisch: rabbit) Antigen Wirt Bezugsquelle Verdünnung Verdünnung Immuncytochemie Western Blot Aktin ms BD Biosciences 1:1000 / 1:2500 Bassoon 1.6 rb E. D. Gundelfinger 1:4000 Bassoon mab7f ms Stressgen 1:2500 Cacna1f (Pep3) rb M. Maw 1:3000 Panα1 rb Alomone 1:500 1:500 Piccolino gp H. Regus-Leidig 1:5000 Piccolo 44a gp E. D. Gundelfinger 1:2000 RIBEYE rb Synaptic Systems 1:1000 1:1000 Tabelle 5: Verwendete Sekundärantikörper gp = Meerschweinchen (englisch: guinea pig); gt = Ziege (englisch: goat); ms = Maus (englisch: mouse); rb = Kaninchen (englisch: rabbit); HRP = Meerrettich-Peroxidase (englisch: horseradish peroxidase) Antikörper Wirt Antigen Hersteller Verdünnung AlexaFluor 488 TM AlexaFluor 594 TM HRP gt gt gt gp ms rb gp ms rb gp ms rb Life Technologies, Darmstadt Sigma-Aldrich, Taufkirchen 1:500 1:

88 Material und Methoden 4.4 Verwendete Geräte und Hilfsmittel Tabelle 6: Verwendete Geräte und Hilfsmittel Soweit nicht anders erwähnt, stammt die Bezugsquelle aus Deutschland. Adhesive Caps 500 µl Gerät bzw. Hilfsmittel Adobe Photoshop CS5 Axio Imager Z.1 mit Apotom-Funktion Axiostar plus Axiovision 4.8 Beacon Designer 7 Binokular Discovery V.8 Binokular Stemi 2000 / DV4 Blockheizer Blotkammer Mini Trans-Blot Cell Blotkammer Trans-Blot Cell CFX Manager Software 2.0 CFX96 Real-Time PCR Detection System ChemiDoc TM MP Geldokumentationssystem Consort EV231 power supply Corel Draw X5 Deckgläser 24x24 mm / 24x50 mm DigitalMicrograph TM Software Elektronenmikroskop Zeiss EM 10 Elektrophorese System Mini-PROTEAN Elektrophoresekammer XCell SureLock TM Fettstift (Liquid Blocker Super Pap-Pen) Gatan SC1000 Orius TM CCD Kamera Geldokumentation DeVision G Gelelektrophoresekammer (PCR) Gelgießstation (PCR) Handpotter (Micro tissue grinder) Image Lab 4.0 Bezugsfirma Zeiss, Oberkochen Adobe Systems, München Zeiss, Oberkochen Zeiss, Oberkochen Zeiss, Oberkochen PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA Zeiss, Oberkochen Zeiss, Oberkochen Peqlab, Erlangen Bio-Rad, München Bio-Rad, München Bio-Rad, München Bio-Rad, München Bio-Rad, München Sigma-Aldrich, Taufkirchen Corel Corporation, Unterschleißheim Menzel-Gläser, Braunschweig Gatan, Pleasanton, CA, USA Zeiss, Oberkochen Bio-Rad, München Invitrogen, Karlsruhe SCI Science Service, München Gatan, München Decon Science Tec, Hohengandern Peqlab, Erlangen Peqlab, Erlangen Roth, Karlsruhe Bio-Rad, München 78

89 Material und Methoden ImageJ Gerät bzw. Hilfsmittel Immersol TM 518 F Öl-Immersion Kaltlichtquelle KL 1500 LCD Kippschüttler Typ WT 12 Kontrastiergerät (EM STAIN) Kryostat Leica CM3050 S Kühlzentrifuge 5417 R Leuchtstoffröhren TLD 58W/25 Low Profile 96 well PCR Plate Magnetrührer mit Heizplatte RCT basic Mini-Lichtleiste weiß Objektträger Objektträger Membrane Slide 1.0 PEN Objektträger Superfrost Plus Origin 8G SR4 PALM Micro Beam System mit Nitrogen Laser (337 nm) PCR SoftTubes 0,2 ml PCR workstation Captair bio Pipettensatz PIPETMAN Pixelcounter Polyacrylamidgele NuPAGE 3-8% PowerPac TM Basic / HC power supply PVDF-Membran Hybond-P QPCR Seal Reaktionsgefäße RNeasy Micro Kit Schüttler Typ KL 2 Spektralphotometer Ultrospec 2100 pro Sterilfilter (Rotilabo -Spritzenfilter und Rotilabo -Faltenfilter) Thermomixer comfort Tischzentrifuge Galaxy Mini Bezugsfirma NIH, Bethesda, MD, USA Zeiss, Oberkochen Schott, Jena Biometra, Göttingen Leica, Wetzlar Leica, Wetzlar Eppendorf, Hamburg Philips, Hamburg Peqlab, Erlangen IKA, Staufen IBV Deutschland GmbH, Osnabrück Roth, Karlsruhe Zeiss, Oberkochen Menzel-Gläser, Braunschweig OriginLab, Northampton, MA, USA Zeiss, Oberkochen Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf Erlab, Köln Gilson, Middleton, WI, USA Christian Ammann Invitrogen, Karlsruhe Bio-Rad, München GE Healthcare, Freiburg Peqlab, Erlangen Sarstedt, Nümbrecht Qiagen, Hilden Edmund Bühler GmbH, Hechingen GE Healthcare, Freiburg Roth, Karlsruhe Eppendorf, Hamburg VWR, Ismaning 79

90 Material und Methoden Gerät bzw. Hilfsmittel Tischzentrifuge Heraeus Pico 17 Centrifuge Ultramikrotom Ultracut E Ultraschallhomogenisator Sonoplus HD 2200 Vortexer Vortex-Genie 2 Waage TE3102 S / TE64 Wärmeschrank Heraeus Whatmanpapier 3MM Chr Bezugsfirma Thermo Scientific, München Reichert-Jung, Heidelberg Bandelin Electronic, Berlin Scientific Industries, New York, USA Sartorius, Göttingen Thermo Scientific, München GE Healthcare, Freiburg 4.5 Versuchstiere In der vorliegenden Arbeit wurden wildtypische Mäuse der Stämme C57BL/6 und BALB/c aus eigener Zucht verwendet. Die Tiere waren zum Zeitpunkt der Versuche zwischen 8 und 12 Wochen alt. Des Weiteren wurden Mäuse des Stammes B6(Cg)-Tyr c-2j /J (B6 c-2j ) untersucht. Die Mäuse dieses Stammes haben den gleichen genetischen Hintergrund wie C57BL/6-Mäuse, sind jedoch aufgrund einer Mutation im Tyrosinase-Gen (Tyr c-2j ) albinotisch (Le Fur et al., 1996). Diese Mäuse wurden freundlicherweise von Ronald Naumann (Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik, Dresden) zur Verfügung gestellt und waren zum Zeitpunkt der Versuche zwischen 17 und 20 Wochen alt. Die Mäuse wurden in einem Lichtzyklus mit 12 Stunden Licht (von 6 Uhr bis 18 Uhr) mit einer durchschnittlichen Belichtungsstärke von 200 Lux und 12 Stunden Dunkelheit (von 18 Uhr bis 6 Uhr) gehalten. Die Raumbeleuchtung erfolgte durch Leuchtstoffröhren mit weißem Licht. Die Hell- und Dunkeladaptation der Tiere für die Versuche fand nach dem Schema in Abbildung 38 statt. Abbildung 38: Zeitschema zu den Adaptationszeiten Mäuse wurden nach drei Stunden Hell- (9 Uhr) bzw. Dunkeladaptation (21 Uhr) präpariert. Weitere Mäuse wurden tagsüber einem Dunkel- (12 Uhr) bzw. Hellstimulus (15 Uhr) ausgesetzt. Zu den gleichen Zeiten wurden auch helladaptierte Mäuse präpariert. 80

91 Material und Methoden Ein Teil der Mäuse wurde im regulären tageszeitlichen Rhythmus nach drei Stunden Licht (9 Uhr; helladaptiert) bzw. Dunkelheit (21 Uhr; dunkeladaptiert) präpariert. Außerdem wurden Mäuse präpariert, die um 9 Uhr für drei Stunden dunkeladaptiert (12 Uhr; Dunkelstimulus) bzw. für drei Stunden dunkel- und anschließend für drei Stunden helladaptiert (15 Uhr; Hellstimulus) wurden. Um einen möglichen circadianen Einfluss auszuschließen, wurden zu diesen Zeiten auch helladaptierte Tiere untersucht. Weitere Tiere wurden nach dreistündiger Belichtung mit 1000 Lux präpariert. Hierfür wurden zusätzliche Mini-Lichtleisten verwendet, die in 25 cm Abstand zum Käfig angebracht waren. Der Käfig wurde mit reflektierender Aluminiumfolie umhüllt und die Einstreu wurde entfernt, um eine optimale Ausleuchtung zu erreichen. Diese Mäuse wurden anschließend wie bei einem Hellstimulus um 15 Uhr präpariert. Für jeden Versuch wurden mindestens drei Mäuse je Adaptationszustand präpariert. Die Mäuse wurden in einem Glasbehältnis mit 0,8 ml Isofluran betäubt und anschließend durch Genickbruch getötet. Bei dunkeladaptierten Tieren erfolgte die gesamte Präparation unter schwachem Rotlicht. 4.6 Fluoreszenzmikroskopie Präparation der Retina, Fixierung und Anfertigen von Gefrierschnitten Die Augen wurden mit einer gebogenen Pinzette entnommen und in 0,1 M PB überführt. Die Cornea wurde mit einem spitzen Skalpell eingestochen und mit Schnitten entlang des Augenbecherrandes entfernt. Anschließend wurden Linse und Glaskörper mit Pinzetten entnommen. Für einen guten Erhalt der Gewebestruktur erfolgte die Fixierung der Retinae im Augenbecher. Die Retinae wurden in 4%igem Paraformaldehyd (PFA) bei Raumtemperatur (RT) für 15 bzw. 30 Minuten im Augenbecher fixiert. Bei dunkeladaptierten Tieren erfolgte auch die Fixierung im Dunkeln. Alle nachfolgenden Schritte erfolgten auf Eis. Nach dreimaligem Waschen mit 0,01 M phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für jeweils 10 Minuten wurden die Retinae aus dem Augenbecher heraus präpariert und im Anschluss in einer aufsteigenden Saccharose-Reihe (10%, 20% und 30% in PBS) entwässert. Anschließend wurden die Retinae für 30 Minuten in Tissue Tek Einfriermedium inkubiert, bevor sie im Gefriermikrotom bei einer Kammertemperatur von -25 C und 81

92 Material und Methoden einer Objekttemperatur von -45 C übereinander aufgefroren wurden. Von diesen Sandwichpräparaten wurden bei -21 C Kammertemperatur und -17 C Objekttemperatur und 12 µm dicke Vertikalschnitte gemacht und auf speziell beschichtete Superfrost Objektträger aufgenommen. Die Schnitte wurden bei -20 C gelagert Immunzytochemische Färbungen Die Objektträger wurden aus dem Gefrierfach genommen und für eine bessere Haftung der Schnitte 15 Minuten luftgetrocknet. Währenddessen wurden die Schnitte mit einem Fettstift umrandet, um ein Abfließen der Inkubationslösungen zu verhindern. Nach zweimaligem Waschen für jeweils 10 Minuten in PBS wurden die Schnitte für 60 Minuten in Präinkubationslösung inkubiert, um freie Proteinbindestellen abzusättigen. Anschließend wurden die Primärantikörper in Antikörper-Inkubationslösung aufgetragen (Verdünnungen siehe Tabelle 4) und verblieben über Nacht in einer feuchten Kammer auf den Schnitten. Am nächsten Tag wurden überschüssige Primärantikörper durch dreimaliges Waschen in PBS für jeweils 10 Minuten entfernt, bevor die Schnitte für 60 Minuten mit den entsprechenden Sekundärantikörpern (Verdünnungen siehe Tabelle 5) inkubiert wurden. Es folgten erneut drei Waschschritte mit PBS im Dunkeln, bevor die fertigen Schnitte in Aqua Poly Mount eingedeckt und bei 4 C gelagert wurden Lichtmikroskopische Analyse Die Analyse der immunzytochemischen Färbungen erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Apotomfunktion. Es wurden mehrere übereinander liegende Ebenen in Z-Richtung aufgenommen, welche anschließend in eine Ebene projiziert wurden. Kontrast und Helligkeit der digitalen Aufnahmen wurden in Photoshop CS5 bearbeitet. Die Abbildungen wurden mit CorelDRAW X5 erstellt. Die Längenausdehnung der hufeisenförmigen synaptischen Bänder (RIBEYE-Färbung) und der parallel dazu verlaufenden aktiven Zonen (Bassoon-Färbung) wurde in ImageJ mit dem Messwerkzeug Segmented Line gemessen. 82

93 Material und Methoden 4.7 Elektronenmikroskopie Fixierung für gute Gewebeerhaltung Die Retina wurde in 4%igem Paraformaldehyd mit 2,5% Glutaraldehyd für zwei Stunden bei RT im Augenbecher fixiert. Anschließend wurde dreimal für jeweils zehn Minuten in 0,1 M PB auf Eis gewaschen, die Retina freipräpariert, geviertelt und über Nacht bei 4 C aufbewahrt. Nach dreimaligem Waschen mit Cacodylatpuffer, wurde das Gewebe am nächsten Tag für 90 Minuten im Dunkeln osmiert (1,5% Kaliumhexacyanoferrat + 2% Osmium in Cacodylatpuffer). Im Anschluss wurden die Retinastücke in einer aufsteigenden Ethanolreihe (jeweils 15 Minuten in 30%, 50%) dehydriert, gefolgt von einem 60-minütigen Schritt in 70%igen Ethanol, dem 0,5% Uranylacetat zugesetzt waren. Anschließend wurden die Proben weiter dehydriert (15 Minuten 90%, zweimal 15 Minuten 100% Ethanol, zweimal fünf Minuten Propylenoxid). Die Retinae wurden nun für 30 Minuten in einem 1:1-Gemisch aus Epon und Propylenoxid inkubiert, bevor sie über Nacht in reines Epon überführt wurden. Am nächsten Tag wurden die Retinastücke einzeln in Epon eingebettet und für 60 Stunden bei 60 C auspolymerisiert. Für einige Proben wurde Araldit an Stelle von Epon verwendet. Mit einem Ultramikrotom wurden etwa 60 nm dicke Ultradünnschnitte angefertigt, welche auf Lochgrids aufgenommen und in einem Kontrastiergerät mit Bleicitrat und Uranylacetat nachkontrastiert wurden Elektronenmikroskopische Analyse und Quantifizierung Die ultrastrukturelle Analyse erfolgte an einem Zeiss EM 10 Elektronenmikroskop mit einer GATAN SC1000 Orius TM CCD Kamera und der DigitalMicrograph TM Software. Kontrast und Helligkeit der digitalen Aufnahmen wurden mit Photoshop bearbeitet. Von jedem Adaptationszustand wurden zufällig ausgewählte Ultradünnschnitte von jeweils drei Tieren ausgewertet. Dazu wurden 125 Aufnahmen mit facher Vergrößerung der OPL jedes Tieres analysiert. Die Photorezeptor-Terminalien wurden gezählt und in mehrere Kategorien eingeteilt: (1) Terminalien ohne synaptischem Band, (2) Terminalien mit stäbchenförmigem synaptischen Band, (3) Terminalien mit keulenförmigem 83

94 Material und Methoden synaptischen Band und (4) Terminalien mit kugelförmigem Bandmaterial. Die Höhe der synaptischen Bänder von der Basis an der aktiven Zone bis zum distalen Ende wurde in ImageJ mit dem Messwerkzeug Segmented Line gemessen Messung der postsynaptischen Invaginationen In Terminalien, in denen ein quer angeschnittenes synaptisches Band zu sehen war (Abbildung 9A; vgl. Abbildung 13), wurde die Ausdehnung der postsynaptischen Invaginationen bestimmt. Hierzu wurden die Anschnitte der Horizontal- und Bipolarzellen in Photoshop umrandet und schwarz ausgefüllt (Abbildung 9B). Auf die gleiche Weise wurde mit dem gesamten Terminal verfahren (Abbildung 9C). Mit Hilfe eines von Christian Ammann erstellten Programmes (Pixelcounter) wurden die Anteile der schwarzen Pixel am Gesamtbild gemessen. Anschließend konnte der Anteil der postsynaptischen Invaginationen am Gesamtterminal errechnet werden. Abbildung 39: Messung der Ausdehnung der postsynaptischen Invaginationen Gezeigt ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines Photorezeptor-Terminals (A). Die Triadenstruktur der postsynaptischen Invaginationen ist hier deutlich zu erkennen (BZ = Bipolarzelle, HZ = Horizontalzelle). Die Anschnitte der Horizontal- und Bipolarzellen (B) bzw. des ganzen Terminals (C) wurden jeweils umrandet und schwarz ausgefüllt. Größenbalken: 0,2 µm. 84

95 Material und Methoden Analyse der Vesikelverteilung am synaptischen Band Für die Analyse der Vesikelverteilung am synaptischen Band wurde die Gesamtzahl der Vesikel an den stäbchenförmigen synaptischen Bändern bestimmt, wobei nur Vesikel gewertet wurden, die sich in erster Reihe um das Band befanden. Zusätzlich wurde die Anzahl der Vesikel bestimmt, die in den untersten 100 nm des synaptischen Bandes lokalisiert waren (Abbildung 40). Diese Vesikel wurden als Vesikel an der Basis des Bandes definiert. Abbildung 40: Verteilung der Vesikel am synaptischen Band Es wurden die Gesamtanzahl der Vesikel am synaptischen Band sowie die Anzahl der Vesikel in den untersten 100 nm (Balken) des synaptischen Bandes bestimmt. Größenbalken: 0,2 µm. 4.8 PCR-Analysen Laser-Mikrodissektion Die Augen wurden direkt nach der Entnahme in Röllchen aus Tesafilm gegeben, die mit Tissue Tek Einfriermedium gefüllt waren. Dabei wurde der Sehnerv zur Seite ausgerichtet. Die Augen wurden anschließend für 45 Sekunden in Isopentan getaucht, welches zuvor mit flüssigem Stickstoff gekühlt wurde. Die eingefrorenen Augen konnten bei -80 C aufbewahrt werden. Mit dem Kryostat wurden 30 µm dicke Gefrierschnitte der unfixierten Augen erstellt, welche auf gebackene Membran- Objektträger aufgezogen wurden. Die Retinaschnitte wurden mit Cresylviolett-Lösung gefärbt und mit Ethanol gewaschen. Von den getrockneten Schnitten wurden mittels Laser-Mikrodissektion am PALM Micro Beam System Stücke der ONL und inneren Segmente der Photorezeptoren ausgeschnitten (Abbildung 41A) und mit einem Laserimpuls kontaktfrei in Adhesive Caps katapultiert (Abbildung 41B). 85

96 Material und Methoden Abbildung 41: Laser- Mikrodissektion (A) zeigt einen Cresylviolettgefärbten Vertikalschnitt durch die Mausretina. Die ONL mit den Zellkörpern der Photorezeptoren und deren innere Segmente wurden mit dem Laser ausgeschnitten und in das Adhesive Cap katapultiert. (B) zeigt isolierte Retinastücke im Adhesive Cap. Größenbalken: 50 µm (A) bzw. 100 µm (B) RNA-Isolation und cdna-synthese Die Isolation der RNA erfolgte mit dem RNeasy Micro Kit nach Anleitung des Herstellers, wobei die ausgeschnittenen Retinastücke nach der Lyse im RLT-Puffer mit β-mercaptoethanol bei -20 C gelagert werden konnten. Die isolierte RNA wurde mit dem iscript cdna Synthese Kit in cdna umgeschrieben und für die quantitative Real-Time PCR eingesetzt. Wichtig war hierbei, dass die Poly(A) Carrier-RNA des Micro Kits nicht eingesetzt wurde, da diese mit den Oligo(dt)-Primern des cdna- Synthese Kits zu unspezifischen Nebenprodukten führt Quantitative Real-Time PCR Mittels quantitativer Real-Time PCR wurde die Expression verschiedener Gene in den Photorezeptoren dunkel- und helladaptierter C57BL/6-Mäuse untersucht. Die verwendeten Primer wurden mit Beacon Designer 7 entworfen und sind in Tabelle 7 aufgeführt. Die Spezifität der Primerpaare wurde mittels Auswertung der Schmelzkurven sowie durch den Auftrag der PCR-Produkte auf ein 1,5%iges Agarosegel (Abbildung 42) bestätigt. Die Effizienzen der Primerpaare wurden mittels Verdünnungsreihen bestimmt. Die PCR wurde in einem CFX96 Real-Time PCR Detection System mit der CFX Manager Software (Version 2.0) von Bio-Rad durchgeführt und ausgewertet. Als Referenzgen diente GAPDH. 86

97 Material und Methoden Tabelle 7: Primer für die quantitative Real-Time PCR Aufgeführt sind die Sequenzen der verwendeten Primer sowie die mittels Verdünnungsreihe bestimmten Effizienzen und die Länge der jeweiligen Amplifikate. Gen Bassoon Primer for 5 -AGCACCCTGTGTCCAATA-3 rev 5 -AGTGGTCATGTCCATTCC-3 Effizienz (%) 109,0 198 Produkt (bp) Cacna1f Complexin 3 Complexin 4 GAPDH Piccolo RIBEYE RIM2 Syntaxin 3 ubmunc13-2 for 5 -GCAGTTGTGAAGATTTACC-3 rev 5 -CAAGTTTGCCAAGGTATC-3 for 5 -GAAGAGTACGAGGAGTATC-3 rev 5 -CTTCCTCTGTGTGAACTG-3 for 5 -GGCTAAAGGGATGACTAG-3 rev 5 -CTCTCTCCATCTTCTCTTC-3 for 5 -CAACTTTGTCAAGCTCATT-3 rev 5 -TCTGGGATGGAAATTGTG-3 for 5 -AGCAAAGACAGGACAGAA-3 rev 5 -ATATTCCGTCAGAGGAGTAC-3 for 5 -TGATACCAGATTAGGGATAGAG-3 rev 5 -AACAGGTCTTTCGCAGAT-3 for 5 -GGAGCAAGTCAAGAAGATG-3 rev 5 -TTACACACCCACATAACCT-3 for 5 -AGGTGATGACAAAGTACAATG-3 rev 5 -CCACTCTCCAACATCTCTT-3 for 5 -GCCAAATTCCAGGGTTCA-3 rev 5 -TGCTACAGTTGTGCTCTTC-3 87, , , , , , , , ,

98 Material und Methoden Abbildung 42: Auftrennung der PCR-Amplifikate auf einem 1,5%igen Agarose-Gel Die PCR-Amplifikate wurden auf einem 1,5%igen Agarosegel aufgetrennt. Alle verwendeten Primer ergaben nur ein PCR-Produkt mit der erwarteten Länge. Marker: 100 bp. 12,5 µl PCR-Ansatz enthielten: 6,25 µl SsoFast EvaGreen Supermix 0,2 µl Vorwärtsprimer 0,2 µl Rückwärtsprimer 4,85 µl H 2 O 1,0 µl cdna Es wurde folgendes PCR-Protokoll verwendet: 95 C 30 sec 95 C 1 sec 59 C 1 sec 40x 95 C 5 sec 88