peqgold HP Total RNA Kit

Transkript

1 Arbeitsanleitung Instruction Manual peqgold HP Total RNA Kit (Classic-Line & Safety-Line) V0815

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3 INHALT EINLEITUNG 1 FUNKTIONSPRINZIP 1 KITBESTANDTEILE 2 LAGERUNG 2 WICHTIGE HINWEISE 3 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE 4 PEQGOLD HP TOTAL RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE 6 DNA-KONTAMINATIONEN 9 QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA 9 RNA-QUALITÄT 10 BESTELLINFORMATIONEN 10 TROUBLESHOOTING TIPS 11 CONTENT INTRODUCTION 10 THEORY 10 KIT COMPONENTS 11 STORAGE AND STABILITY 11 BEFORE STARTING 12 DANGEROUS COMPONENTS 13 PEQGOLD HP TOTAL RNA ISOLATION PROTOCOL 15 DNA CONTAMINATION 18 QUANTITATION AND STORAGE OF RNA 18 RNA QUALITY 19 ORDERING INFORMATION 19 TROUBLESHOOTING TIPS 20 APPENDIX 21

4 EINLEITUNG Der peqgold HP Total RNA Kit kombiniert eine auf Phenol und Guanidinisothiocyanat basierende Einschritt-Flüssigphasen-Separation mit einer silikatmembran-basierenden Zentrifugationssäulenmethode, für eine einfache und effiziente Isolierung von Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen und Geweben. Das im Kit enthaltene peqgold TriFast ist ein gebrauchsfertiges Reagenz und optimal geeignet für die Lyse verschiedenster Gewebe, vor allem für fettreiche Gewebe wie z.b. Gehirn oder Fettgewebe, und inhibiert gleichzeitig effizient RNasen. Ein optimiertes Puffersystem erlaubt dabei die Aufreinigung von bis zu 100 µg nicht degradierter Gesamt-RNA mit Moleküllängen ab 200 Basen aufwärts. RNA, die mit den peqgold HP Total RNA Kits isoliert wurde, kann für alle Arten von Folgeexperimenten, wie RT-PCRs, Poly(A) + -RNA-Extraktionen, Northern Blots, Nuclease Protection Assays und in vitro-translationen, weiterverwendet werden. peqgold HP Total RNA Kits werden wahlweise mit S- oder mit C-Säulen geliefert (Safety- Line, Best.-Nr xx oder Classic-Line, Best.-Nr xx). Schnappdeckel sorgen bei den Safety-Line Säulen für einen sicheren Verschluss und zusätzlichen Schutz vor Kreuzkontaminationen. Classic-Line Säulen haben keinen Deckel und erleichtern so das Handling. FUNKTIONSPRINZIP Aufzuarbeitende Zellen und Gewebe werden zunächst in TriFast Reagenz homogenisiert, wobei alle vorhandenen RNasen und sonstige Enzyme effizient inhibiert werden. Durch die Verwendung von TriFast Reagenz ist es möglich auch größere Mengen Gewebe (bis zu 100 mg Gehirn oder Fettgewebe) auf eine peqgold PerfectBind RNA Column zu laden und damit die RNA-Ausbeute zu erhöhen. Nach der Zugabe von Chloroform und anschließender Zentrifugation trennt sich das Homogenat in drei Phasen auf. Die RNA ist in der wässrigen Phase enthalten, die DNA in der organischen und der Interphase. Die Proteine befinden sich in der organischen Phase. Die wässrige Phase wird anschließend auf eine PerfectBind RNA Column geladen, in der die RNA-Moleküle an die enthaltene Silikamembran binden. Phenol und andere Kontaminationen können durch Waschen mit speziellen Puffern schnell und einfach entfernt werden. Die gereinigte und qualitativ sehr hochwertige RNA wird abschließend in sterilem RNase-free Water eluiert. peqgold HP Total RNA Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 1

5 KITBESTANDTEILE peqgold HP Total RNA Kits 5 Reinigungen 50 Reinigungen 200 Reinigungen Bestellnummer Classic-Line Bestellnummer Safety-Line Bestandteile PerfectBind RNA Columns ml Collection Tubes TriFast Reagenz 6 ml 55 ml 220 ml RNA Wash Buffer I 5 ml 50 ml 200 ml RNA Wash Buffer II (Konz.) 2 ml 20 ml 3 x 20 ml RNase-free Water 1 ml 5 ml 20 ml Arbeitsanleitung LAGERUNG Alle Komponenten des peqgold HP Total RNA Kits, mit Ausnahme des TriFast Reagenz, sollten bei Raumtemperatur gelagert werden. Die Lagerung des TriFast Reagenz sollte bei 4 C erfolgen. Bei Lagerung unter den angegebenen Bedingungen bleiben die Komponenten des Kits für mindestens 12 Monate ab Lieferung stabil. peqgold HP Total RNA Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 2

6 WICHTIGE HINWEISE Bitte lesen Sie das vorliegende Protokoll vor der ersten Verwendung des Kits vollständig durch und legen Sie vor Präparationsbeginn alle für die Isolierung benötigten Materialien bereit, um durch unnötige Zeitverzögerungen verursachte RNA-Degradationen zu vermeiden.! Bei allen Arbeiten mit RNA sollten zur Vermeidung von RNase-Kontaminationen Einmalhandschuhe getragen werden. Zum Pipettieren der im Kit enthaltenen Puffer sollten ausschließlich saubere, RNase-freie Einmalpipettenspitzen verwendet werden.! RNA-Präparationen sollten besonders sorgfältig, daneben aber auch so zügig wie möglich durchgeführt werden.! Es ist unbedingt zu empfehlen, vor Beginn des Experimentes die optimale Menge des Ausgangsmaterials zu definieren. Die maximale Bindekapazität der peqgold PerfectBind RNA Column beträgt 100 µg. Bei Proben mit hohem RNA-Gehalt empfehlen wir deshalb mit 30 mg Gewebe zu starten. Bei Proben mit geringem RNA-Gehalt empfehlen wir, bis zu 100 mg Gewebe einzusetzen.! RNA Wash Buffer II wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner ersten Verwendung mit absolutem Ethanol verdünnt werden: Kit Kit Kit ml RNA Wash Buffer II mit 8 ml 100 % EtOH mischen. 20 ml RNA Wash Buffer II mit 80 ml 100 % EtOH mischen. 3 x 20 ml RNA Wash Buffer II mit 3 x 80 ml 100 % EtOH mischen.! Alle Zentrifugationsschritte müssen bei C ausgeführt werden. peqgold HP Total RNA Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 3

7 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE peqgold HP Total RNA Kit Bestandteile PerfectBind RNA Columns 2 ml Collection Tubes TriFast Reagenz RNA Wash Buffer I Signalwort / Symbole Gefährliche Inhaltsstoffe H- und P-Sätze DANGER Phenol 30-60%, Guanidinium thiocyanate 10-30%, 2-Mercaptoethanol <1%, CAS: , , DANGER Ethanol 25-50%, guanidinium thiocyanate 10-<25%, CAS: , H341, H301+H311+H331, H373, H314, H412, EUH032, P201, P280, P273, P301+P330+P331, P302+P352, P304+P340, P307+P310 H225, H314, P101, P102, P103, P210, P241, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 RNA Wash Buffer II (Konz.) RNase-free Water peqgold HP Total RNA Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 4

8 H- und P-Sätze Erläuterungen H314 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. H225 Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar. H301+H311+H331 Giftig bei Verschlucken, Hautkontakt oder Einatmen. H341 Kann vermutlich genetische Defekte verursachen (Expositionsweg angeben, sofern schlüssig belegt ist, dass diese Gefahr bei keinem anderen Expositionsweg besteht). H373 Kann die Organe schädigen (alle betroffenen Organe nennen) bei längerer oder wiederholter Exposition (Expositionsweg angeben, wenn schlüssig belegt ist, dass diese Gefahr bei keinem anderen Expositionsweg besteht). H412 Schädlich für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung. EUH032 Entwickelt bei Berührung mit Säure sehr giftige Gase. P101 Ist ärztlicher Rat erforderlich, Verpackung oder Kennzeichnungsetikett bereithalten. P102 P103 P201 P210 P241 P273 P280 P301+P330+P331 P302+P352 P303+P361+P353 P304+P340 P305+P351+P338 P307+P310 P405 P501 Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen. Vor Gebrauch Kennzeichnungsetikett lesen. Vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. Von Hitze, heissen Oberflächen, Funken, offenen Flammen sowie anderen Zündquellenarten fernhalten. Nicht rauchen. Explosionsgeschützte elektrische Geräte/Lüftungsanlagen/ Beleuchtungsanlagen/... verwenden. Freisetzung in die Umwelt vermeiden. Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschut z tragen. BEI VERSCHLUCKEN: Mund ausspülen. KEIN Erbrechen herbeiführen. BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT: Mit viel Wasser/ waschen. BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle kontaminierten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen/duschen. BEI EINATMEN: Die Person an die frische Luft bringen und für ungehinderte Atmung sorgen. BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen. Bei Exposition: Sofort Giftinformationszentrum oder Arzt anrufen Unter Verschluss aufbewahren. Inhalt/Behälter zuführen. peqgold HP Total RNA Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 5

9 PEQGOLD HP TOTAL RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE Eukaryotische Zellen und Gewebe Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:! Chloroform! 100 % Ethanol! 70 % Ethanol in sterilem DEPC-dH 2O! Sterile RNase-freie Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen 1. Homogenisierung und Lyse a. Gewebe mg Gewebe werden mit je 1 ml peqgold TriFast homogenisiert. Um eine gute Lyse zu erreichen, sollte ein Glas-, ein Teflon- oder ein elektrischer Homogenisator verwendet werden. Das Probenvolumen sollte nicht mehr als 10 % des verwendeten peqgold TriFast -Volumens betragen. b. Monolayer-Zellen Die Zellen werden direkt in der Zellkulturschale durch die Zugabe von 1 ml peqgold TriFast je 3.5-cm-Schale und durch mehrmaliges Aufziehen mit der Pipette lysiert. Die Menge an benötigtem peqgold TriFast ist nicht von der Zellzahl, sondern von der Größe der Zellkulturschale (in der Regel 1 ml pro 10 cm 2 ) abhängig. Eine unzureichende Menge an peqgold TriFast kann zur Kontamination der extrahierten RNA mit DNA führen. c. Zellsuspensionen Zellsuspension zentrifugieren und mit 1 ml peqgold TriFast je 5 10 x 10 6 Zellen resuspendieren. Waschen der Zellen vor der Lyse fördert den Abbau der RNA und sollte vermieden werden. 2. Phasentrennung Die Proben für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, um die Dissoziation der Nukleotidkomplexe zu gewährleisten. Je eingesetztem Milliliter peqgold TriFast 0.2 ml Chloroform zugeben und die Proben für 15 Sekunden kräftig schütteln. Danach 3 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Anschließend die Probe für 5 Minuten bei x g* zentrifugieren um eine Phasenauftrennung zu bekommen. Es bilden sich drei Phasen: eine untere rote Phenol-Chloroform-Phase, eine obere farblose wässrige Phase und eine dazwischenliegende Interphase. Die RNA ist ausschließlich in der wässrigen Phase angereichert, während sich die DNA und die Proteine in der Interphase und der Phenolphase befinden. Die wässrige Phase nimmt dabei ca. 60 % des Probenvolumens ein. Das verwendete Chloroform sollte von Zusätzen wie z.b. Isoamylalkohol frei sein. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 21 peqgold HP Total RNA Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 6

10 3. Laden und Binden Die obere wässrige Phase in ein neues 1.5 ml Tube überführen, mit einem identischen Volumen 70 % Ethanol versetzen und durch Vortexen sorgfältig mischen. Eine PerfectBind RNA Column in ein 2 ml Collection Tube stecken und 750 µl Probe auf die Säule laden. PerfectBind RNA Column im Tube für 15 Sekunden bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen. Schritt wiederholen und restliche wässrige Phase auf die PerfectBind RNA Column laden. Nach der Zugabe von 70 % Ethanol kann sich ein Präzipitat bilden, das mit der Probe auf die Säule gegeben werden muss. Das Fassungsvermögen der PerfectBind RNA Column beträgt 750 µl. Durch wiederholtes Befüllen und Zentrifugieren können jedoch auch größere Volumina bearbeitet werden. Dabei ist jedoch zu beachten, dass die maximale Bindekapazität der PerfectBind RNA Column bei ca. 100 µg RNA liegt. 4. Waschen I 500 µl RNA Wash Buffer I auf die PerfectBind RNA Column pipettieren und für 15 Sekunden bei x g* durch die Säule zentrifugieren. PerfectBind RNA Column auf ein frisches 2 ml Collection Tube stecken. Säulendurchfluss und altes Collection Tube verwerfen. 5. DNase I Verdau (optional) Da durch die PerfectBind RNA-Technologie die vorhandene DNA größtenteils entfernt wird, ist ein zusätzlicher DNase-Verdau für die meisten Folgeanwendungen nicht erforderlich. Dennoch kann es bei einigen sensitiven RNA-Anwendungen nötig sein, die verbliebene DNA durch DNase-Behandlung zu entfernen. Das folgende Protokoll beschreibt den DNase I-Verdau direkt auf der PerfectBind RNA Column. (Bestellnr.: /02) a. Für jede PerfectBind RNA Column folgenden DNase I Reaktionsmix vorbereiten: DNase I Digestion Buffer 73.5 µl RNase-freie DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl Gesamtvolumen 75 µl Hinweis: 1. DNase I ist sehr empfindlich gegenüber physikalischer Denaturierung, deshalb DNase I- Lösung niemals vortexen! Ein Invertieren des Tubes reicht zum Mischen aus. Den DNase I Reaktionsmix immer direkt vor der RNA-Isolation ansetzen. 2. Der DNase I Digestion Buffer ist im RNase-freien DNase I Digest Kit enthalten. Standard DNase Puffer sind nicht für den "on-membrane" Verdau geeignet! b. 75 µl des DNase I Reakionsmixes direkt auf die Membran der PerfectBind RNA Column pipettieren. Der DNase I Verdau kann nicht vollständig ablaufen, wenn ein Teil des Reaktionsmixes an der Wand oder dem O-Ring der Säule haftet. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 21 peqgold HP Total RNA Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 7

11 c. PerfectBind RNA Column bei Raumtemperatur (25 30 C) für 15 Minuten inkubieren. d. PerfectBind RNA Column in ein neues 2 ml Collection Tube stecken und 400 µl RNA Wash Buffer I zugeben. PerfectBind RNA Column bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubieren. Anschließend bei x g* für 5 Minuten zentrifugieren und Durchfluss verwerfen. Collection Tube im nächsten Schritt (Schritt 6) weiterverwenden. 6. Waschen II 600 µl des komplettierten RNA Wash Buffers II (Pufferkonzentrat plus 4 Volumen 100 % Ethanol) auf die PerfectBind RNA Column pipettieren und für 15 Sekunden bei x g* durch die Säule zentrifugieren. Waschschritt wiederholen. Säulendurchfluss verwerfen. 7. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind RNA Column in das geleerte 2 ml Collection Tube stecken und durch einminütiges Zentrifugieren bei x g* vollständig trocknen. 8. Elution PerfectBind RNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und die RNA mit 50 µl bis 100 µl sterilem RNase-free Water eluieren. Dazu direkt auf die Matrix pipettieren und 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Bei erwarteten RNA-Erträgen > 50 µg kann zur vollständigen Rückgewinnung der RNA eine zweite Elutionsrunde notwendig sein. Dabei ist zu berücksichtigen, dass zwar der absolute Ertrag verbessert wird, die RNA-Konzentration jedoch sinkt, da bereits bei der ersten Elution mehr als 80 % der gereinigten RNA zurückgewonnen werden. Ein Vorwärmen des RNase-free Water auf 70 C und eine der Zentrifugation vorangehende fünfminütige Inkubation der PerfectBind RNA Column können die Erträge noch weiter verbessern. Statt einer zweiten Elutionsrunde kann die RNA auch direkt in einem größeren Volumen RNase-free Water eluiert werden. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 21 peqgold HP Total RNA Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 8

12 DNA-KONTAMINATIONEN Mit keinem der aktuell verfügbaren RNA-Extraktionssysteme ist es möglich, genomische DNA vollständig zu entfernen. Für sensitive Experimente wie Differential Display oder RT- PCRs muss deshalb ein DNase I Verdau durchgeführt werden. Eine einfache und zeitsparende Möglichkeit bietet der DNase-Verdau direkt auf der Säule, der in das bestehende Protokoll zwischen den Waschschritten integriert werden kann (s. Punkt 5: DNase I Verdau). Alternativ kann auch eine Nachbehandlung der isolierten RNA mit RNase-freier DNase durchgeführt werden. Der Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens von DNA-Kontaminationen kann mit Hilfe von intronüberspannenden Primern erfolgen, wobei das Entstehen von Banden Rückschlüsse auf mögliche Kontaminationen zulässt. QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA Um die Konzentration und Reinheit einer RNA-Lösung zu bestimmen, muss die Absorption eines geeignet verdünnten Aliquots (10- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessen werden. RNase-free Water ist leicht sauer und kann die gemessenen Absorptionswerte dramatisch herabsetzen. Für die spektrophotometrische Analyse sollte die RNA deshalb besser in einer gepufferten Lösung wie beispielsweise TE verdünnt werden. Eine A 260-Einheit entspricht dabei 40 µg RNA/ml. Die Konzentration berechnet sich demnach wie folgt: RNA-Konzentration (µg/ml) = Absorption 260 x 40 x Verdünnungsfaktor Das A 260/280-Verhältnis reiner Nukleinsäuren liegt bei 2.0. Das mit dem peqgold HP Total RNA Kit erzielbare A 260/280-Verhältnis von 1.8 bis 2.0 entspricht deshalb RNA einer Reinheit von 90 % bis 100 %. RNA, die mit dem peqgold HP Total RNA Kit aufgereinigt wurde, kann in sterilem RNasefree Water für mindestens ein Jahr bei 70 C aufbewahrt werden. peqgold HP Total RNA Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 9

13 RNA-QUALITÄT Vor ihrer Verwendung in Folgeexperimenten sollte durch denaturierende Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung zunächst noch die Qualität der extrahierten RNA bestimmt werden. Auf dem gefärbten Gel müssen zwei scharfe Banden erkennbar sein, die die ribosomalen 28 S und 18 S rrnas repräsentieren. Sollten diese Banden in Richtung niedermolekularer RNA-Größen schmieren, ist es während der Präparation, Lagerung oder Weiterbearbeitung zu einer Degradation gekommen, die sich je nach Folgeexperiment mehr oder weniger negativ auswirken kann. Obwohl RNA-Moleküle < 200 Basen nur sehr ineffizient an die PerfectBind-Silikamatrix des peqgold HP Total RNA Kits binden, kann auf dem Gel noch eine dritte distinkte Bande aus trnas erscheinen. Diese Bande tritt vor allem dann auf, wenn die Zellzahl im Ausgangsmaterial besonders hoch war. BESTELLINFORMATIONEN für die RNA-Isolierung aus Zellen, Geweben und Blut: peqgold HP Total RNA Kit (Classic-Line) peqgold HP Total RNA Kit (Safety-Line) peqgold Total RNA Kit (Classic-Line) peqgold Total RNA Kit (Safety-Line) peqgold Blood RNA Kit (Safety-Line) Reinigungen Reinigungen Reinigungen Reinigungen Reinigungen Reinigungen Reinigungen Reinigungen Reinigungen Reinigungen Reinigungen Reinigungen Reinigungen Reinigungen Reinigungen peqgold HP Total RNA Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 10

14 TROUBLESHOOTING TIPS Problem Ursache Abhilfe Wenig oder keine RNA im Eluat Säule verstopft RNA bleibt auf der Säule Säule ist überladen Unvollständige Homogenisierung Elution wiederholen. RNase-free Water vor dem Eluieren auf 70 C erwärmen. Säule vor dem Eluieren für 10 min mit RNasefree Water inkubieren. Menge des Ausgangsmaterials reduzieren. Probe vollständig homogenisieren. Zentrifugationszeit verlängern. Menge des Ausgangsmaterials reduzieren. RNA-Degradation Schlechtes Ausgangsmaterial DNA- Kontamination Niedrige Absorptionsraten Probleme bei Folgereaktionen RNase-Kontamination Physikalische Ähnlichkeit von RNA und DNA RNA in saurem Puffer oder Wasser verdünnt Salzübertragung während der Elution Ausgangsmaterial sofort nach Probennahme in Stickstoff einfrieren. Ausgangsmaterial erst lysieren und dann lagern. Präparation zügiger und exakter nach Vorschrift durchführen. Nur RNase-freies Material verwenden und Handschuhe tragen. Puffer auf RNase-Kontaminationen überprüfen. Verdau mit RNase-freier DNase. (5 min bei 37 C inkubieren.) RNase-free Water ist sauer und kann die A 260- Werte dramatisch herabsetzen. Zum Messen in TE-Puffer verdünnen. Sicherstellen, dass RNA Wash Buffer II mit 4 Volumen 100 % EtOH verdünnt wurde. Sicherstellen, dass RNA Wash Buffer II bei Raumtemperatur gelagert und verwendet wurde. Waschschritt mit RNA Wash Buffer II wiederholen. peqgold HP Total RNA Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 11

15 INTRODUCTION peqgold HP Total RNA Kits integrate phenol/guanidine-based lysis and silicamembrane purification of total RNA. TriFast Reagent, included in the kits, is a monophasic solution of phenol and guanidine thiocyanate, designed to facilitate lysis of different sources of samples especially for fatty tissues such as brain and adipose tissue and inhibit RNases. With the peqgold HP Total RNA Kits, all RNA molecules longer than 200 nucleotides are isolated. RNA purified using the peqgold HP Total RNA Kit is ready for applications such as RT- PCR, Northern blotting, poly(a) + -RNA (mrna) purification, nuclease protection assays and in vitro translation. peqgold HP Total RNA Kits are available as S- or C-line columns (Safety-Line, # xx or Classic Line, # xx). Safety-Line columns can be closed tightly by lids to avoid cross-contamination more effectively. Classic-Line columns do not have lids for a more comfortable handling. THEORY The high lysis efficiency of the TriFast Reagent enables use of larger amounts of tissue (up to 100 mg of brain or adipose tissue) with the peqgold PerfectBind RNA Column. Tissue samples are homogenized in TriFast Reagent. After addition of chloroform, the homogenate is separated into aqueous and organic phases by centrifugation. RNA partitions to the upper, aqueous phase while DNA partitions to the interphase and proteins to the lower, organic phase or the interphase. The upper, aqueous phase is extracted, and ethanol is added to provide appropriate binding conditions. The sample is then applied to the PerfectBind RNA Column, where the total RNA binds to the membrane and phenol and other contaminants are efficiently washed away. High-quality RNA is then eluted in RNase-free Water. peqgold HP Total RNA Kit Ord.-No.: / PEQLAB_v0815_E 10

16 KIT COMPONENTS peqgold HP Total RNA Kits 5 Purifications 50 Purifications 200 Purifications Product Number Classic-Line Product Number Safety-Line Bestandteile PerfectBind RNA Columns ml Collection Tubes TriFast Reagent 6 ml 55 ml 220 ml RNA Wash Buffer I 5 ml 50 ml 200 ml RNA Wash Buffer II (Conc.) 2 ml 20 ml 3 x 20 ml RNase-free Water 1 ml 5 ml 20 ml Instruction manual STORAGE AND STABILITY All components except TriFast Reagent in peqgold HP Total RNA Kit should be stored at room temperature. TriFast Reagent should be stored at 4 C. All peqgold HP Total RNA Kit components are stable for at least 12 months from the date of purchase when stored at C. peqgold HP Total RNA Kit Ord.-No.: / PEQLAB_v0815_E 11

17 BEFORE STARTING Briefly examine this booklet and become familiar with each step. Prepare all components and have the necessary materials ready before starting.! Whenever working with RNA, always wear one-way gloves to minimize RNase contamination. Use only fresh RNase-free disposable plastic pipette tips when using the supplied reagents.! Work carefully but as quickly as possible during the procedure.! It is very important to determine the correct amount of starting material before the experiment. The capacity of the PerfectBind RNA Column is 100 µg. For samples containing high amount of RNA, we suggest using 30 mg tissue to start. For samples containing lower level RNA, the maximum amount of starting material (100 mg) can be used.! RNA Wash Buffer II is concentrated and has to be diluted with absolute ethanol as follows: Kit Kit Kit Add 8 ml 100 % EtOH to 2 ml RNA Wash Buffer II Add 80 ml 100 % EtOH to 20 ml RNA Wash Buffer II Add 3 x 80 ml 100 % EtOH to 3 x 20 ml RNA Wash Buffer II! All steps must be carried out at room temperature (22 25 C). peqgold HP Total RNA Kit Ord.-No.: / PEQLAB_v0815_E 12

18 DANGEROUS COMPONENTS peqgold HP Total RNA Kit Components PerfectBind RNA Columns 2 ml Collection Tubes TriFast Reagenz RNA Wash Buffer I Signal word / symbols Dangerous components H and P statements DANGER Phenol 30-60%, Guanidinium thiocyanate 10-30%, 2-Mercaptoethanol <1%, CAS: , , DANGER Ethanol 25-50%, guanidinium thiocyanate 10-<25%, CAS: , H341, H301+H311+H331, H373, H314, H412, EUH032, P201, P280, P273, P301+P330+P331, P302+P352, P304+P340, P307+P310 H225, H314, P101, P102, P103, P210, P241, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 RNA Wash Buffer II (Konz.) RNase-free Water peqgold HP Total RNA Kit Ord.-No.: / PEQLAB_v0815_E 13

19 H and P statements H314 H225 H301+H311+H331 H341 H373 H412 EUH032 P101 P102 P103 P201 P210 P241 P273 P280 P301+P330+P331 P302+P352 P303+P361+P353 P304+P340 P305+P351+P338 P307+P310 P405 P501 Descriptions Causes severe skin burns and eye damage. Highly flammable liquid and vapour. Toxic if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Suspected of causing genetic defects <state route of exposure if it is conclusively proven that no other routes of exposure cause the hazard>. May cause damage to organs <or state all organs affected, if known> through prolonged or repeated exposure <state route of exposure if it is conclusively proven that no other routes of exposure cause the hazard>. Harmful to aquatic life with long lasting effects. Contact with acids liberates very toxic gas. If medical advice is needed, have product container or label at hand. Keep out of reach of children. Read label before use. Obtain special instructions before use. Keep away from heat, hot surfaces, sparks, open flames and other ignition sources. No smoking. Use explosion-proof electrical/ventilating/lighting/ / equipment. Avoid release to the environment. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. IF SWALLOWED: rinse mouth. Do NOT induce vomiting. IF ON SKIN: Wash with plenty of water/ IF ON SKIN (or hair): Take off immediately all contaminated clothing. Rinse skin with water/shower. IF INHALED: Remove person to fresh air and keep comfortable for breathing. IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minuts. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing. If exposed: Call a POISON CENTER/doctor/ Store locked up. Dispose of contents/container to peqgold HP Total RNA Kit Ord.-No.: / PEQLAB_v0815_E 14

20 PEQGOLD HP TOTAL RNA ISOLATION PROTOCOL Eucaryotic cells and tissue Materials required, but not supplied:! Chloroform! 100 % Ethanol! 70 % Ethanol in sterile DEPC-dH 2O! Sterile RNase-free pipet tips and centrifuge tubes 1. Homogenization and Lysis a. Tissue Homogenize tissue samples in 1ml TriFast per mg tissue. For efficient lysis use a glass-teflon or power homogenizer. The sample volume should not exceed 10 % of the volume of TriFast used for the homogenization. b. Monolayer cells Lyse cells directly in a culture dish by addition of 1 ml TriFast to a 3.5 cm diameter dish and passing the cell lysate several times through a pipette. The amount of TriFast needed is based on the area of the culture dish (1 ml per 10 cm 2 ) and not on the number of cells. An insufficient amount of TriFast may result in contamination of the isolated RNA with DNA. c. Suspension culture Pellet cells by centrifugation. Lyse cells in TriFast by pipetting. Add 1 ml reagent per 5 10 x 10 6 of cells. Washing cells before the addition of TriFast should be avoided as this increases the possibility of RNA degradation. 2. Phase Separation For dissociation of the nucleoprotein complexes the samples should be kept for 5 minutes at room temperature. Add 0.2 ml of chloroform per 1 ml of peqgold TriFast and shake samples by hand vigorously for 15 seconds. Keep them for 3 10 minutes at room temperature. During centrifugation at x g* for 5 minutes the mixture separates into the lower red (phenol-chloroform phase), the interphase and the colourless upper aqueous phase. RNA is forced exclusively into the aqueous phase whereas DNA and the proteins partition into the interphase and lower phenol phase. The volume of the RNA containing phase is about 60 % of the volume of the TriFast used for homogenization. Chloroform used in this experiment should be free of additives like isoamyl alcohol or others. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 21 peqgold HP Total RNA Kit Ord.-No.: / PEQLAB_v0815_E 15

21 3. Load and bind Transfer the upper aqueous phase into a new 1.5 ml centrifuge tube. Add an equal volume 70 % Ethanol to the lysate and mix thoroughly by vortexing. Place a PerfectBind RNA Column in a 2 ml Collection Tube and add 750 µl of the lysate directly to the membrane. Centrifuge the PerfectBind RNA Column/Collection Tube assembly at x g* for 15 sec. Pour off the flow-through liquid. Repeat this step by loading the remaining lysate to the column. A precipitate may form on addition of 70 % ethanol. This will not interfere with RNA purification. Vortex and add the entire mixture to the column. The maximum capacity of the spin column is 750 µl, larger volumes can be loaded successively by repeating the loading procedure. However, the total binding capacity of a spin column is 100 µg RNA. 4. Wash I Add 500 µl RNA Wash Buffer I to the PerfectBind RNA Column and centrifuge for 15 sec at x g*. Place the PerfectBind RNA Column in a fresh 2 ml Collection Tube. Discard the flow-throw liquid and the used Collection Tube. 5. DNase I Digestion (optional) Since PerfectBind RNA resin and spin-column technology actually removes most of DNA without the DNase treatment, it is not necessary to do DNase digestion for most downstream applications. However, certain sensitive RNA applications might require further DNA removal. Following steps provide on-membrane DNase I digestion (Order No ). a. For each PerfectBind RNA Column, prepare this DNase I digestion reaction mix: DNase I Digestion Buffer 73.5 µl RNase-free DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl Total volume 75 µl Note: 1. DNase I is very sensitive for physical denaturation, so do not vortex this DNase I mixture! Mix gently by inverting the tube. Prepare the fresh DNase I digestion mixture directly before RNA isolation. 2. DNase I Digestion Buffer is supplied with RNase-free DNase set. Standard DNase buffers are not compatible with on-membrane DNase digestion! b. Pipet 75 µl of the DNase I digestion reaction mix directly onto the surface of PerfectBind RNA resin in each column. Make sure to pipet the DNase I digestion mixture directly onto the membrane. DNase I digestion will not be complete if some of the mix stick to the wall or the O-ring of the PerfectBind RNA Column. c. Incubate at room temperature (25 30 C) for 15 minutes. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 19 peqgold HP Total RNA Kit Ord.-No.: / PEQLAB_v0815_E 16

22 d. Place the PerfectBind RNA Column into a new 2 ml Collection Tube and add 400 µl RNA Wash Buffer I. Place the PerfectBind RNA Column at benchtop for 5 minutes. Centrifuge at x g* for 5 minutes and discard flow-through. Re-use Collection Tube in the next step. Continue with step Wash II Add 600 µl completed RNA Wash Buffer II to the PerfectBind RNA Column and centrifuge for 15 sec at x g*. Repeat this wash step and discard the flow-through liquid. 7. Dry (Important, do not skip this step!) Place the PerfectBind RNA Column containing your RNA in the Collection Tube and centrifuge for 1 min at x g* to dry the column matrix. 8. Elution Place the PerfectBind RNA Column into a fresh 1.5 ml microcentrifuge tube. Add µl sterile RNase-free Water directly to the binding matrix in the PerfectBind RNA Column and centrifuge for 1 min at x g* to elute RNA. A second elution may be necessary if the expected yield of RNA is > 50 µg. Alternatively, RNA may be eluted with a higher volume of water. While additional elution increase total RNA yield, the concentration will be lowered since more than 80 % of RNA is recovered with the first elution. Pre-heating RNase-free Water to 70 C before adding to the PerfectBind RNA Column and incubating the PerfectBind RNA Column for 5 min at room temperature before centrifugation may increase yield. Instead of eluting twice, the RNA can directly be eluted in a bigger volume of RNase-free Water. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 21 peqgold HP Total RNA Kit Ord.-No.: / PEQLAB_v0815_E 17

23 DNA CONTAMINATION No RNA extraction procedure can completely remove genomic DNA. For sensitive work (such as RT-PCR or differential display) we suggest that you treat the eluted RNA with RNase-free DNase. On-membrane DNase I Digestion is a simple and fast method and can be integrated into the standard protocol (see point 5). Alternatively, eluted RNA can be treated with RNase-free DNase. Also for RT-PCR, use intron-spanning primers that allow easy identification of DNAcontamination. A PCR reaction, which uses the RNA as template, will also allow the detection of DNA contamination. QUANTITATION AND STORAGE OF RNA Determine the absorption of an appropriate dilution (10- to 50-fold) of the sample at 260 nm and then at 280 nm. RNase-free Water is slightly acidic and can dramatically lower absorption values. We suggest that you dilute the sample in a buffered solution (TE) for spectrophotometric analysis. One A 260-unit is about 40 µg RNA/ml. The RNA concentration is calculated as follows: RNA conc. (µg /ml) = Absorption Dilution Factor The ratio of A 260/280 is an indication of nucleic acid purity. A value higher than 1.8 indicates 90 % 100 % nucleic acid. Store RNA samples at 70 C in sterile RNase-free Water. Under such conditions RNA prepared with the peqgold system is stable for at least one year. peqgold HP Total RNA Kit Ord.-No.: / PEQLAB_v0815_E 18

24 RNA QUALITY It is highly recommended to determine the RNA quality prior to further applications. Denaturing agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining can best assess the quality of RNA. Two sharp bands should appear on the gel. These are the 28 S and 18 S ribosomal RNA bands. If these bands smear towards lower molecular weight RNA, then the RNA has undergone major degradation during preparation, handling or storage. Although RNA molecules less than 200 bases in length do not efficiently bind the PerfectBind matrix, a third RNA band, the trna band, may be visible when a large number of cells are used. ORDERING INFORMATION For RNA isolation from cells, tissues and blood: peqgold HP Total RNA Kit Preparations (Classic-Line) Preparations Preparations peqgold HP Total RNA Kit Preparations (Safety-Line) Preparations Preparations peqgold Total RNA Kit Preparations (Classic-Line) Preparations Preparations peqgold Total RNA Kit Preparations (Safety-Line) Preparations Preparations peqgold Blood RNA Kit Preparations (Safety-Line) Preparations Preparations peqgold HP Total RNA Kit Ord.-No.: / PEQLAB_v0815_E 19

25 TROUBLESHOOTING TIPS Problem Likely cause Suggestion Little or no RNA RNA remains on the column Repeat elution. eluted Pre-heat RNase-free Water to 70 C prior to elution. Incubate column for 10 min with RNase-free Water prior to centrifugation. Column is overloaded Reduce quantity of starting material. Clogged column Incomplete homogenization Completely homogenize sample. Increase centrifugation time. Reduce amount of starting material Degraded RNA Source Freeze starting material quickly in liquid nitrogen. Do not store tissue culture cells prior to extraction unless they are lysed first. Problem in downstream applications DNA contamination Low Absorption ratios RNase contamination Salt carry-over during elution Co-purification of DNA RNA diluted in acidic buffer or water Follow protocol closely, and work quickly. Ensure not to introduce RNase during the procedure. Check buffers for RNase contamination. Ensure RNA Wash Buffer II Concentrate has been diluted with 4 volumes of 100 % ethanol as indicated on the bottle. RNA Wash Buffer II must be stored and used at room temperature. Repeat wash with RNAWash Buffer II. Digest with RNase-free DNase and incubate at 37 C for 5 min. RNase-free Water is acidic and can dramatically lower Abs 260 values. Use TE buffer to dilute RNA prior to spectrophotometric analysis. peqgold HP Total RNA Kit Ord.-No.: / PEQLAB_v0815_E 20

26 APPENDIX Abb. 1: Umrechnungstabelle rcf/rpm. Werte für Zentrifugen, abhängig vom Rotordurchmesser. Fig. 1: Table rcf/rpm. Values for centrifuges depending on rotor diameter. peqgold HP Total RNA Kit Ord.-No.: / PEQLAB_v0815_E 21

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