INHALTSVERZEICHNIS. Vorwort. 1. ANALYTISCHE VERFAHREN IM BIOCHEMISCHEN LABORATORIUM Methoden der quantitativen Analyse 1
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- Holger Becker
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1 INHALTSVERZEICHNIS Vorwort 1. ANALYTISCHE VERFAHREN IM BIOCHEMISCHEN LABORATORIUM Methoden der quantitativen Analyse Radiochemische Verfahren Radioisotope Strahlungsarten Zerfallsgeschwindigkeit (Halbwertszeit) \ Einheiten Meßmethoden Geigen-Müller Zähler Szintillationszähler Autoradiographie Anwendung von Radioisotopen Kompetitiver Radioimmunoassay (RIA) KompetitiveProteinbindungsanalyse Hormonbindungskapazität Spektroskopische Verfahren Grundlagen Infrarot-Spektroskopie Photometrie Extinktion, Transmission Messung der Extinktion Ermittlung der Konzentration aus der gemessenen Extinktion Reflexphotometrie Nephelometrie,Tyndallometrie,Turbidimetrie Potentiometrische Verfahren Einfluß der Ionenkonzentration auf das Potential einer Halbzelle (Nernst'sche Gleichung) Konzentrationskette ph-messung mit dem ph-meter Ionenselektive Elektroden Zuverlässigkeit von Analysenergebnissen Grobe Fehler 17 III
2 Zufällige Fehler Systematische Fehler Kenngrößen für zufällige und systematische Fehler Meßgrößen für zufällige und systematische Fehler Bewertung von Meßergebnissen Trennverfahren Extraktionsmethoden Chromatographische Methoden Verteilungschromatographie Adsorptionschromatographie Ionenaustauschchromatographie Gelfiltration Elektrophorese KOHLENHYDRATE, LIPIDE, PROTEINE 27 IV 2.1. Kohlenhydrate Monosaccharide Oxidationsprodukte von Monosacchariden Reaktionen von Monosacchariden Reduktionswirkung 31 Versuch 1: Nachweis eines reduzierenden Mono- oder Disaccharids durch die Fehling-Probe Glycoside Disaccharide 32 Versuch 2: Hydrolytische Spaltung von Saccharose Glykane (Polysaccharide) Cellulose Stärke (Amylose, Amylopektin) Glykogen Dextrane Inulin Lipide Verseifbare Lipide Triacylglyceride (Triglyceride, Neutralfette) Phospholipide Phosphoglyceride (Glycerinphosphatide) Sphingolipide Nichtverseifbare Lipide Steroide 38 Versuch 3: Cholesterinnachweis nach Salkowski 40 Versuch 4: Trennung von Lipidgemischen durch Dünnschichtchromatographie, Identifizierung von Serumlipiden 41
3 2.3. Aminosäuren, Peptide, Proteine Aminosäuren Einteilung und Nomenklatur Aminosäuren ohne weitere Substituenten oder mit apolaren Gruppen Aminosäuren mit ungeladenen aber polaren Gruppen Aminosäuren mit geladenen, polaren Gruppen Säureamide der sauren Aminosäuren Ampholytcharakter, isoelektrischer Punkt Nachweis von Aminosäuren Ninhydrin-Reaktion 46 Versuch 5: Ninhydrin-Reaktion Reaktion mit salpetriger Säure (van Slyke Reaktion) Nachweis schwefelhaltiger Aminosäuren 47 Versuch 6: Cysteinnachweis mit der Schwefelblei-Probe Nachweis aromatischer Aminosäuren 47 Versuch 7: Xanthoproteinreaktion Nachweis von Tyrosin (Millon's-Reaktion) 47 Versuch 8: Millon's-Reaktion Trennung von Amonosäuregemischen 48 Versuch 9: Trennung eines Aminosäuregemisches mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie Biochemisch wichtige Reaktionen von Aminojsäuren Bildung von Peptiden Oxidative Desaminierung Decarboxylierung Transaminierung Oxidation von Cystein Peptide Proteine Struktur der Proteine Aminosäuresequenz (Primärstruktur) Kettenkonformation (Sekundär- und Tertiärstruktur) Strukturmodelle Quartärstruktur Einteilung der Proteine Einfache Proteine Zusammengesetzte Proteine Denaturierung von Proteinen Reversible Denaturierung Irreversible Denaturierung 60 Versuch 10: Fällung von Proteinen durch Trichloressigsäure oder Sulfosalicylsäure 60
4 Löslichkeit von Proteinen Art des Proteins phdesmediums 60 Versuch 11: Abschätzung des isoelektrischen Punktes eines Proteins (Casein) Ionenstärke 62 Versuch 12: Fällung mit Ammoniumsulfat Art des Gegenions Qualitative und quantitative Nachweis-Reaktionen Nachweis von Proteinen durch Fällungsreaktionen Quantitative Bestimmung von Proteinen (Biuret- Reaktion) Trennung von Proteingemischen 64 Versuch 13: Entsalzung einer Proteinlösung ENZYME UND ENZYM AKTIVITÄTSBESTIMMUNGEN Natur und Funktion der Enzyme Substrate, Cosubstrate und prosthetische Gruppen Grundbegriffe der Enzymkinetik Einfluß der Substratkonzentration Einfluß des ph-wertes Einfluß der Temperatur Einfluß von Hemmstoffen Methodische Grundlagen der Enzymaktivitätsmessung Definition einer Einheit der katalytischen Aktivität Berechnung von Meßergebnissen Kontinuierliche Meßverfahren Direkte kontinuierliche Meßverfahren Indirekte kontinuierliche Meßverfahren Diskontinuierliche Meßverfahren 76 Versuch 14: Bestimmung der Michaelis-Konstante der Alkoholdehydrogenase Enzymatische Substratbestimmungen 79 Versuch 15: Bestimmung der Alkoholkonzentration mit Hilfe der Alkoholdehydrogenase BLUT 82 VI 4.1. Aufgaben und Zusammensetzung Geformte Elemente des Blutes Thrombozyten 82
5 Leukozyten Lymphozyten Erythrozyten Hämoglobinderivate und Hämoglobinanomalien Blutplasma Blutgerinnung - Gewinnung von Plasma und Serum Blutzucker Bestimmung des Blutzuckers 87 Versuch 16: Quantitative Glucosebestimmung im Blut mit einem Glucoseteststreifen Blutlipide Serum-Cholesterin Serum-Triglyceride Lipid-Elektrophorese HDL-Cholesterin Harnsäure Harnstoff Kreatinin Plasmaproteine 92 4: Funktion der Plasmaproteine Konzentration der Plasmaproteine 92 Versuch 17: Bestimmung des Gesamtproteingehaltes des Blutes (Biuret-Reaktion) Trennung der Blutproteine (Elektrophorese) 94 Versuch 18: Elektrophoretische Trennung der Serumproteine auf Celluloseacetat Enzyme des Blutes Grundlagen der klinisch-chemischen Enzymdiagnostik Enzym-Muster, Isoenzym-Muster, intrazelluläre Enzymverteilung Methodische Grundlagen der Enzymaktivitätsbestimmungen im Blut Diagnostisch wichtige Serum-Enzyme Alkalische Phosphatase 100 Versuch 19: Messung der Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) Saure Phosphatase Alanin-Aminotransferase (ALT) Glutamat-Dehydrogenase Kreatin-Kinase Hormonbestimmungen im Blut 102 Versuch 20: Bestimmung des Tß-Bindungskapazitätsindex 103 VII
6 5. NIERE UND HARN Morphologie und Funktion der Niere Allgemeine Eigenschaften des Harnes Harnvolumen 105 VIII Harnfarbe Geruch des Harnes Trübungen des Harnes Dichte des Harnes Chemische Zusammensetzung des Harnes Normale Harnbestandteile ph-wert des Harnes Ionen des Harnes Anionen 107 Versuch 21: Bestimmung der Chloridionen im Harn mit einer Chlorid-Elektrode Kationen 109 Versuch 22: Bestimmung der Calciumionen im Harn mit einer Calcium-Elektrode Organische Bestandteile des Harnes Pathologische Harnbestandteile Methoden Proteine des Harnes (Proteinurie) 113 Versuch 23: Nachweis von Protein mit der Kochprobe 113 Versuch 24: Nachweis von Protein mit Sulfosalicysäure 114 Versuch 25: Nachweis von Protein mit dem Teststreifen Zucker im Harn Glucose im Harn Glucosurie) 115 Versuch 26: Zuckernachweis mit der Fehling-Reaktion 115 Versuch 27: Nachweis von Glucose im Harn mit dem Teststreifen Fructose im Harn (Fructosurie) Galactose im Harn (Galactosurie) Pentosen im Harn (Pentosurie) Lactose im Harn (Lactosurie) Ketonkörper im Harn (Ketonurie) 117 Versuch 28: Nachweis von Ketonkörpern mit der Legal-Probe Gallenfarbstoffe im Harn Bilirubin im Harn (Bilirubinurie) Urobilinogen im Harn (Urobilinogenurie) Blut und Blutfarbstoff im Harn 120 Versuch 29: Nachweis des Blutfarbstoffes im Harn mit der Tolidin-Reaktion 121
7 Versuch 30: Nachweis einer Hämaturie oder Hämoglobinurie mit dem Teststreifen Nitritionen im Harn (Nitriturie) 121 Versuch 31: Nachweis von Nitrit mit dem Teststreifen Durchführung einer Harnanalyse mit einem Kombinationsteststreifen 122 Versuch 32: Durchführung einer Harnanalyse mit einem Kombinationsteststreifen Störungen des Aminosäurestoffwechsels bzw. des Aminosäuretransportes Phenylketonurie 123 Versuch 33: Nachweis von Phenylbrenztraubensäure im Harn von Neugeborenen (Föllig-Probe) Alkaptonurie Prüfung der Nierenfunktion Konzentrationsversuch nach Volhard, Phenolrot-Probe Clearence Endogene Kreatinin-Clearence 126 Versuch 34: Endogene Kreatinin-Clearence Bestimmung der Konzentration von Harnstoff und Kreatinin im Blutplasma Harnsediment Kristalline Sedimentbestandteile Organisierte Sedimentbestandteile Harnkonkremente Konkrementanalyse ' 129 Versuch 35: Analyse von Konkrementen VERDAUUNGSSEKRETE Magensaft Magensalzsäure Pepsinogen Pepsin Mucoproteine Prüfung der Magensekretion durch Titration 133 Versuch 36: Bestimmung der Basalsekretion und der Gipfelsekretion des Magens Pankreassekret Untersuchung der Pankreasfunktion 136 IX
8 Direkte Untersuchungsverfahren Indirekte Untersuchungsverfahren 136 Versuch 37: Bestimmung der Amylase-Aktivität im Serum (nach Wohlgemuth) Dünndarmsekret Galle 138
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