CD- und ORD-Spektroskopie. Dr. Stefan Walter LS Biotechnologie, Prof. Buchner Tel: RN: 57430

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1 CD- und ORD-Spektroskopie Dr. Stefan Walter LS Biotechnologie, Prof. Buchner Tel: RN: 57430

2 ORD- und CD-Spektroskopie 1) Einführung Was sind ORD und CD? Linear und zirkular polarisiertes Licht Wie sehen ORD- bzw. CD-Spektren aus? 2) ORD Erzeugung von linear polarisiertem Licht Die Entstehung eines ORD-Signals Aufbau eines einfachen Polarimeters Anwendungen der ORD-Spektroskopie 3) CD Die Entstehung eines CD-Signals CD-aktive Chromophore Aufbau eines CD-Spektrometers Formeln für die Auswertung von CD-Daten Anwendungen der CD-Spektroskopie

3 CD- und ORD-Spektroskopie Wechselwirkung optisch aktiver Substanzen mit (zirkular) polarisiertem Licht ORD: Optische Rotationsdispersion; beruht auf unterschiedlichem Brechungsindex für linksbzw. rechts-zirkular polarisiertem Licht (RZPL bzw. LZPL) CD: Zirkulardichroismus; beruht auf unterschiedlicher Absorption von links- bzw. rechtszirkular polarisiertem Licht (RZPL bzw. LZPL) Literatur: Werner Schmidt: Optische Spektroskopie, VCH Weinheim 1994 S.B. Brown: An Introduction to Spectroscopy for Biochemists, Academic Press 1980

4 Linear und zirkular polarisiertes Licht a) Zirkular polarisiertes Licht b) Linear polarisiertes Licht Linear polarisiertes Licht Zirkular polarisiertes Licht Was bleibt konstant? Richtung des E-Vektors Amplitude des E-Vektors Modulation (definiert λ) Amplitude des E-Vektors Richtung des E-Vektors Projektion des Vektors in Ausbreitungsrichtung Linie Kreis

5 Beziehung zwischen linear und zirkular polarisiertem Licht ZPL = LPL V + LPL H, wobei: ϕ = π/2 A V = A H LPL = ZPL L + ZPL R, wobei: ϕ = 0 A L = A R Elliptisch pol. Licht: EPL = ZPL L + ZPL R, wobei: ϕ = 0 A L A R Elliptisch pol. Licht: EPL = LPL V + LPL H, wobei: ϕ = π/2 A V A H

6 Einfaches ORD-Spektrum n RZPL -n LZPL Normale Dispersion Anomale Dispersion Wellenlänge (nm) Normale Dispersion: Zunahme von n mit abnehmender Wellenlänge (vgl. Prisma) Anomale Dispersion: Abnahme von n mit abnehmender Wellenlänge; tritt auf, wenn die Probe Strahlung absorbiert

7 Einfaches CD-Spektrum A RZPL - A LZPL Wellenlänge (nm) CD-Banden sind an Absorptionsbanden gekoppelt, d.h. ausserhalb von Absorptionsbereichen ist das Signal null nicht jede Absorptionsbande ist auch CD-aktiv

8 Erzeugung von linear polarisiertem Licht a) durch Reflexion wenn Licht im Brewsterwinkel θ p auf reflektierende Oberfläche auftritt (b), ist der reflektierte Strahl zu 100% polarisiert

9 Erzeugung von linear polarisiertem Licht b) durch linearen Dichroismus die beiden Polarisationsebenen werden von einem Material unterschiedlich stark absorbiert durch Wahl geeigneter Abmessungen wird das austretende Licht linear polarisiert, ohne allzu viel an Intensität zu verlieren

10 Erzeugung von linear polarisiertem Licht c) durch Doppelbrechung anisotrope Anordnung von Atomen im Kristallgitter bewirkt optische Anisotropie unterschiedliche Strahlengänge für die beiden nominalen Polarisationsrichtungen

11 Entstehung eines ORD-Signals Polarisierbarkeit α: Verschiebbarkeit der Elektronenwolke durch den E-Vektor des anregenden Lichts; nach der Clausius-Mosotti-Gleichung nimmt der Brechungsindex n mit steigendem α zu n 2-1 = 4π 1 Nα Da Probe optisch aktiv ist, unterscheiden sich die Polarisierbarkeit für RZPL und LZPL, und damit auch die Brechungsindizes n je grösser n, desto langsamer bewegt sich die Strahlung durch die Probe n = c 0 /c 1 RZPL und LZPL wandern unterschiedlich schnell durch die optisch aktive Probe Phasendifferenz ϕ zwischen RZPL und LZPL

12 Entstehung eines ORD-Signals α Probe Analyzer Detektor Rekombination von RZPL und LZPL ergibt wieder LPL, aber wegen ϕ ist die Polarisationsebene um den Winkel α gedreht α ist proportional zur Konzentration c und zur Schichtdicke d der Probe Ein Polarisationsfilter, der parallel zur Ebene des anregenden Lichts orientiert ist, absorbiert daher einen Teil der auftreffenden Energie scheinbare Abnahme der Intensität

13 Wichtige Formeln für den ORD Achtung: Aus historischen Gründen werden verwirrende Einheiten (kein SI) verwendet, welche die Verwendung der Formeln leider unnötig komplizieren 1. Definition des spezifischen Drehwinkels, entspricht dem Lambert-Beer schen Gesetz α obs T [ α ] L = λ c w α obs : gemessener Drehwinkel in deg [α]: spezifischer Drehwinkel in deg ml g-1 dm-1 c w : Konzentration in g/ml, L: Schichtdicke in dm 2. Definition der molekularen Rotation [ φ] T λ [ α] T λ = MW 100 [φ]: molekulare Rotation in deg cm 2 dmol -1, [α]: spezifischer Drehwinkel MW: Molekulargewicht in g/mol 3. Definition der molekularen Rotation je Monomer (für Polymere) [ m] [ α] T λ = MRW 100 [m]: molekulare Rotation je Monomer in deg cm2 dmol-1 [α]: spezifischer Drehwinkel MRW: mittleres Molekulargewicht je Monomer in g/mol

14 Aufbau eines einfachen Polarimeters X Detektor Na-Dampflampe Probe Polarisationsfilter Polarisationsfilter (Analyzer) Na-Dampflampe: erzeugt monochromatisches Licht von 589 nm Polarisationsfilter sind frei drehbar falls das menschliche Auge als Detektor benutzt wird, müssen optische Tricks zur Feststellung der Rotation eingesetzt werden

15 Anwendungen für den ORD Vorteile der Methode 1) liefert auch ausserhalb von Absorptionsbanden ein Signal kann auch in bei starkem Absorptionshintergrund verwendet werden 2) einfache Instrumentierung Beispiel: Bestimmung der Saccharosekonzentration in gekelterten Trauben (Mostgewicht) Beispiel: Bestimmung der Glucosekonzentration im Blut (historisch) Reinheit von Enantiomeren

16 Anwendungen für den ORD Zur Charakterisierung bzw. Strukturbestimmung von organischen Verbindung findet der ORD heutzutage kaum Verwendung ORD-Spektrum des Steroidhormons Testosteron

17 Entstehung eines CD-Signals Phänomen beruht darauf, dass ein Probe/Substanz RZPL und LZPL unterschiedlich stark absorbiert Damit ein elektronischer Übergang CD-aktiv ist, muß gelten dass µ e µ m 0 ist µ e : elektronisches Übergangsmoment, reflektiert lineare Verschiebung von Elektronen beim Übergang in den angeregten Zustand µ m : magnetisches Übergangsmoment, reflektiert eine radiale Verschiebung von Elektronen beim Übergang in den angeregten Zustand Das Skalarprodukt µ e µ m ist gleichbedeutend mit einer helikalen Elektronenverschiebung je nach Händigkeit der Helix erfolgt die Anregung vorzugsweise mit RZPL bzw. LZPL, d.h. die beiden Polarisationsrichtungen werden unterschiedlich stark absorbiert

18 CD-aktive Chromophore 1) Inherent chirale Chromophore 2) Kopplung von achiralen Chromophoren in unsymmetrischer Konformation Hexahelizen α-helikales Peptid

19 CD-aktive Chromophore 3) Achirale Chromophore mit dissymmetrischer Störung Die unsymmetrische Umgebung erzeugt ein unsymmetrisches Feld in der Nähe des Chromophors Substituiertes Cyclohexanon Tyrosinrest in einem Protein

20 Der Zirkulardichroismus (CD): zwei Sichtweisen Entsteht, wenn eine Probe ZPL L und ZPL R unterschiedlich stark absorbiert 1. Analogie zu Lambert-Beer Quantifizierung: differentieller Extinktionskoeffizient ε für ZPL L und ZPL R A = A L -A R = ε L c d - ε R c d = ε c d Verhältnis i.d.r. sehr klein: ε/ε = Geometrische Sichtweise Aus linear polarisiertem Licht entsteht elliptisch polarisiertes Licht Elliptizität: tanψ = a b b Ψ a Zusammenhang: ψ = 33 A

21 Wichtige Formeln für den CD - Teil 2 Hier wird der Zirkulardichroismus als Absorptionsphänomen behandelt 1. Definition des molaren Zirkulardichroismus ε A = A L A R = (ε ε ) c d L R = ε c d Α: CD-Absorption ε: molarer Zirkulardichroismus in l mol-1 cm-1 c w : Konzentration in mol/l, d: Schichtdicke in cm 2. Definition des Dissymetrieverhältnisses g g = ε ε ε: molarer Extinktionskoeffizient in l mol-1 cm-1 Es gilt: ε = ½(ε L +ε R ) 3. Zusammenhang zwischen Zirkulardichroismus und Elliptizität [ θ] = 3300 ε [θ]: molekulare Elliptizität in deg cm2 dmol-1 ε: molarer Zirkulardichroismus in l mol-1 cm-1

22 Wichtige Formeln für den CD - Teil 1 Hier wird das Phänomen des Zirkulardichroismus analog zum ORD behandelt 1. Definition der Elliptizität, entspricht dem Lambert-Beer schen Gesetz ψ obs T [ ψ ] L = λ c w ψ obs : gemessene Elliptizität in deg [ψ]: spezifische Elliptizität in deg ml g-1 dm-1 c w : Konzentration in g/ml, L: Schichtdicke in dm 2. Definition der molekularen Elliptizität [ θ ] T λ [ ψ ] T λ = MW 100 [θ]: molekulare Elliptizität in deg cm2 dmol-1 MW: Molekulargewicht in g/mol 3. Definition der molekularen Elliptizität je Monomer (für Polymere) [ θ ] MRW [ ψ ] T λ = MRW 100 [θ] MRW : molekulare Rotation je Monomer in deg cm2 dmol-1 MRW: mittleres Molekulargewicht je Monomer in g/mol

23 Aufbau eines CD-Spektrometers Modulator: elektro-optischer Kristall (NH 4 H 2 PO 4 ); retardiert in Abhängigkeit von der angelegten Wechselspannung (khz) Komponente A RCPL/LCPL-Modulation Signal ε/ε meist sehr gering: hohe Anforderungen an Optik S/N optimal bei A=0.8686; bei A>1-1.5 wird Rauschen zu stark

24 Der Modulator Aufgabe: linear polarisiertes Licht zirkular polarisiertes Licht quarter-wave retarder: verzögert einen der beiden Nominalstrahlen (hier x) um π/2 Einfallendes LPL um 45 gegenüber Modulatorachsen gedreht Brechungsindices für Komponenten x und y unterschiedlich Phasendifferenz Bei geeigneter Geometrie gilt: ϕ = π/2 piezo-elektrisches Element: Wechselspannung komprimiert Modulator Phasendifferenz oszilliert zwischen -π/2 und π/2 ausfallender Strahl erhält ZPL-Modulation

25 Das Meßsignal Der Photomultiplier detektiert eine Gleichspannung (DC), die mit einem schwachen Wechselspannnungssignal (AC) moduliert ist Dabei ist I(DC) proportional zur Absorption, und I(AC) zur differentiellen Absorption Α Die Frequenz von AC ist identisch mit der Steuerfrequenz am Modulator

26 CD-Spektroskopie in der Anwendung Vorteile der Methode: 1) vergleichsweise einfache molekulare Zuordnung von Peaks 2) hohe Empfindlichkeit Nachteile der Methode: 1) aufwendige Instrumentierung 2) hoher Zeitaufwand 3) Einschränkungen in der Probenzusammensetzung findet heute Anwendung v.a. in der Biochemie zur strukturellen Charakterisierung von Peptiden und Proteinen

27 Sekundärstrukturvorhersage von Proteinen mittels CD- Spektroskopie 1) Verschiedenen Klassen von Sekundärstruktur Antiparalleles β-faltblatt Rechtsgängige α-helix β-turn

28 Sekundärstrukturvorhersage von Proteinen mittels CD- Spektroskopie 2) Prototypische CD-Spektren der verschiedenen Sekundärstrukturklassen () α-helix (! ) β-faltblatt ( ) β-turn ( ) unstrukturiert

29 Sekundärstrukturvorhersage von Proteinen mittels CD-Spektroskopie 3) Multikomponenten-Analyse von CD-Spektren

30 Sekundärstrukturvorhersage von Proteinen mittels CD- Spektroskopie 4) Multikomponenten-Analyse von CD-Spektren Linearkombination von (I) Prototypspektren der Sekundärstrukturklassen (II) Referenzspektren von Proteinen mit bekannter 3D-Struktur N S( λ) = f k B k ( λ) k = 1 N k = 1 f k = 1, f k 0 Mögliche Schwachpunkte der Methode Wie gut reflektieren die Prototypspektren die Strukturvariabilität echter Proteine? (I) Eindeutige Zuordnung zu Sekundärstrukturklassen aus Röntgenstruktur schwer (II) α-helix: wegen Kopplung wächst CD mit Zahl der Helixwindungen Einfluss nicht-peptidischer Chromophore wird nicht berücksichtigt

31 Nachweis von Änderungen in der Proteinstruktur mittels CD-Spektroskopie CD-Spektren von gefalteter und chemisch denaturierter Ribonuklease A

32 Bindung von Liganden an Biopolymere Titration von DNA mit dem (achiralen) Farbstoff Proflavin Proflavin interkaliert in die DNA-Doppelhelix; die unsymmetrische Umgebung macht den Farbstoff CD-aktiv

33 Rechenbeispiel ORD Bestimmung der Konzentration einer Lösung von Cholesterin in Chloroform Mittels eines Polarimeters ermittelt man für die Lösung einen Drehwert von -0.9 bei einer Schichtdicke von 10 cm. Cholesterin: [α] 25 C = - 39 α = -0.9 l = 10 cm = 1dm α = [α] c l c = α/([α] l) = -0.9 /(-39 1) = g/ml = 23 mg/ml Spezifische Drehwerte einiger optisch aktiver Verbindungen bei 20 C Kampfer: Penicillin V: +223 Saccharose: Cholesterin: -39