Analysen zur Modulation des axonalen Transports und zur Dimerisierung

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1 Analysen zur Modulation des axonalen Transports und zur Dimerisierung Нрг APP-FamiliP Vom Fachbereich Biologie der Universität Kaiserslautern zur Verleihung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften" genehmigte Dissertation vorgelegt von Dipl Biol Nadine Schmidt Geboren in Simmern/Hunsrück Datum der wissenschaftlichen Ausspra^ 14 März 2016 Prüfungskommission Vorsitzender: Prof Dr. Thorsten Stoeck, Technische Universität Kaiserslautern Gutachter: 1. Prof. Dr Stefan Kins, Technische Universität Kaiserslautern 2. Prof Dr. Claus Pietrzik, Johannes Gutenberg-Universität Mainz Kaiserslautern, 2016 D386

2 Inhaltsverzeichnis 1 ZUSAMMENFASSUNG 2 EINLEITUNG Die Alzheim erdem enz 一 Subzelluläre Lokalisation DER APP-Familie Subzelluläre Lokalisation in Neuronen und axonaler Transport von Regulation der subzellulären Lokalisation: Die VpslOp Rezeptorfamilie...n...l Der Sortilin-verwandte und im Zen^alnervensystemexprimierte Rezeptor So٢CS m_ Funktion der Prozessierungsprodukte von APP Dimerisierung d erapp-familie ZIELSETZUNG""""""^ 4 ERGEBNISSE Kupferfördertdiec^ - u n d ^ - D imerisierungderapp-genfa Kupfer steigert die homotypische cis-interaktion von APP Mutationen derkupferbindungsstellen in APP vermindern die homotypische APP cis- Dimerisierung Der Einfluss von Kupfer aufdie homo und heterotypische Interaktion derapp-familie Einfluss von Kupfer aufdie trans-dimerisierung von ΑΡΙΡ SorCSI nimmt Einfluss auf den axonalen Transport von APP SorCSl-Venus Fusionsproteine zeigen ein SorCSl typisches Lokalisations- und Interaktionsverhalten APP undsorcslb bzw. SorCSlczeigen in verschiedenen ZeUtypen eine deutliche C 〇 m Lokalisation SorCSlb undsorcslc werden durch das schnelle axonale Transportsystem transportiert Die Co-Expression mitsorcslc beeinflusst die Vesikelverteilung von 4.3 Die A P P intrazelluläredom änenim m teinflussaufdenaxonalentransport s Die APP intrazellulare Domänefiihrtzu axonalen Transportdeflziten in Loligo pealeii AICD induziert die Phosphorylierung der schweren und leichten Kette von Kinesin...54

3 4.3.3 DieAICDfåhrtzurAktivierung der Kinase ρ38 und CK Die transiente Überexpression deraicd nimmt keinen Einfluss aufden axonalen Transport von LRPl DISKUSSION Kupfer moduliert die Interaktion der APP-Fa m ilie Kupfer steigert die cis-dimerisierung derapprnfamiue Kupfer moduliert die homotypische trans-interaktion von Die Modulation des axonalen T ransports von APP IST ABHÄNGIG VON DER SorCSI Isoform ModulationdesaxonalenTransportsdurchdieAICD MATERIALUNDMETHOD^ Material Tabellarische Auflistung derverwendeten Materialien Bakterienstämme, ZelUinien und Tierstämme Bakterienstämme Zelllinien Tierstämme Puffer, Losungen und Medien Puffer und Lösungen Kultivierungsmedien für prokaryontische Zellen Kultivierungsmedien für eukaryontische Zelllinien Methoden Molekularbiologische Methoden Generierung chemokompetenter E. coli Zellen Transformation chemokompetenter E. coli Zellen Anzucht von E. coli Flüssigkulturen Aufreinigung von Plasmid-DNA aus E. coli XLl-blue Zellen Mini-Präparation Maxi-Präparation Sequenzierung Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von Plasmid-DNA RestriMonsverdau Agarose-Geleletoophorese Gel-Extraktion Ligation Ortsgerichtete P u n iu tag en ese ZeUbiologische Methoden Rekultivierung von eukaryontischen Zelllinien Ó Kultivierung von eukaryontischen Zelllinien und murinen kortikalen Primärneuronen Kryokonservierung von eukaryontischen Zelllinien...105

4 0.2.Ζ.4 Präparation muriner kortikaler Primärneuronen Ó Aussäen von eukaryontischen Zelllinien Transfektion Transiente Transfektion von eukaryontischen Zelllinien mittels der Calcium-Phosphat (CaP 〇 4)-Methode Transiente Transfektion von PCN mittels der Calcium-Phosphat-Methode...M Transiente Transfektion von eukaryontischen Zelllinien mittels ;etprime Ó.4 Transiente Transfetóion von eukaryontischen Zelllinien mittels Lipofectømin ٠...l Ó Kollektion von APLP2ex-Fc Ó Behandlung mit Kupfer, Zink und Eisen Ó Herstellung stabiler Zelllinien mittels Retrovirusinfetaon Prozessierungsanalyse Biochemische Methoden Zytotoxizitäts Analyse Zelllyse Co-Immunopräzipitation Präparation von k p la sm e n aus Tintenfisch floligo pealeii) Riesenaxonen Radioaktive Markierung von Phosphorylierungsvorgängen in Tintenfisch Riesenaxonen Immunopräzipitation von radioaktiv markiertem Kinesin Bestimmung der Proteinkonzentration Polyacrylamid-GeleleÉphorese [PAGE) Coomassie-Proteinfärbung von Acrylamidgelen Trocknen von SDS-Gelen und Autoradiographie Western Blot und Immunodetektion Stippen von Nifrozellulosemembranen Densitometrische Quantifizierung der Proteinexpression Immunzytochemie immunocytochemistty; ICC Proteinbiochemische Methoden Heterologe Proteinexpression in E. coli Zellen Ą.2 Proteinaufreinigung aus E. coli BL21 Zellen (GST-Pulldown) Aufreinigung von APLP2ex-Fc Bead Aggregation Assay Mikroskopisch-Analytische Methoden Perfusion und Video-Mikroskopie von Tintenfisch Riesenaxonen β Zeifrafferaufnahmen in Primärneuronen LITERATURVERZEICHNIS APPENDIX W eitereabbildungen Ergänzung zu: Kupferfördert die cis- und trans-dimerisierung derapp-familie Ergänzung zu: Die Modulation des axonalen Transports durch dieaicd Abkürzungsverzeichnis Nukleotide...153

5 Aminosäuren Verwendete griechische Buchstaben Sonstige ERK^UNGZURBETEILIGUNGDW ^ DANKSAGUNG LEBENSLAUF