Vasold. phie II 011/12 R. WS 20
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- Victoria Ackermann
- vor 6 Jahren
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Transkript
1 Chromatogra HPLC Seminar 1 Chromatograp
2 Chromatogra HPLC Praktikum I.1 Einleitung (siehe Skript Praktikum) I.2 Ziele des Praktikums I3 I.3 Die stationäre Phase I.4 Die mobile Phase I5 I.5 Die Pumpe(n) I.6 Die Injektionseinheit I.7 Die Detektoreinheit I.8 Die Software I.9 Die Methode des ISTD I10 I.10 Aufgaben zum theoretischen Teil 2
3 Chromatogra I.2 Ziele des Praktikums 3 Nach diesem Praktikum soll man u.a.: Ziel 1 Über den Aufbau einer HPLC-Anlage, sowie über stationäre und mobile Phase Bescheid wissen. Ziel 2 Über die Einzelbestandteile (wie z.b. Pumpen, Injektoreinheit und Detektoren) Bescheid wissen. Ziel 3 Ziel 4 Wichtige chromatographische Kenngrößen (z.b. t m, t R (X), V m, V R (X), u m, u(x) (X), k etc.) bestimmen können. Eine quantitative Bestimmung mit der Methode des Internen Standards durchführen können.
4 Kapitel I Theoretischer Teil 4 Chromatograp
5 I21Komponenten I.2.1 der HPLC Anlage
6 I21Komponenten I.2.1 der HPLC Anlage Abb. I.2.1: 21 Komponenten eines HPLC-Systems CS
7 Chromatographiearten (Auswahl) 7 Trennung durch Adsorption Stationäre Phase Adsorptions-Chromatographie flüssig / fest (NP/RP-HPLC) Mobile Phase Trennung durch Löslichkeit Verteilungs-Chromatographie flüssig / flüssig Stationäre Phase
8 I3DieStationäre I.3 Phase 8 Adsorptions-Chromatographie t hi teilt sich auf in: Normal-Phase Phase-Chomatographie: NP Stationäre ti Phase Mobile Phase polar unpolar Reversed-Phase-Chomatographie: Stationäre Phase unpolar RP Mobile Phase polar
9 I3DieStationäre I.3 Phase 9 Abb. I.3.1: Komponenten eines HPLC-Systems (Säule)
10 I3DieStationäre I.3 Phase 10 Stationäre Phase End-Kartusche Abb. I.3.2: Darstellung einer HPLC-Säule
11 I3DieStationäre I.3 Phase 11 Partikel (z.b.sphärisch) 3µm -10µm Abb. I.3.3: 3 Darstellung der Einzelpartikel l
12 I.3.1 Beispiele stationärer Phasen 12 Chromatograp Norm mal- Phas se Abb. I.3.1.a: Material mit polaren Silanol- (SiOH)- Endguppen
13 I.3.1 Beispiele stationärer Phasen 13 Chromatograp RP-PhPh hase Abb. I.3.1.b: I31b Material mit unpolaren CH 3 -Endgruppen
14 I.3.1 Beispiele stationärer Phasen 14 Chromatograp RP-PhPh hase Abb. I.3.1c: Material mit unpolaren C4-Endgruppen
15 I.3.1 Beispiele stationärer Phasen 15 Chromatograp RP-PhPh hase Abb. I.3.1.d: I31d Material mit unpolaren C8-Endgruppen C8E
16 I.3.1 Beispiele stationärer Phasen 16 Chromatograp RP-PhPh hase Abb. I.3.1e: Material mit C18-Endgruppen
17 I.3.1 Beispiele stationärer Phasen 17 Im Praktikumsversuch wird folgende Säule eingesetzt: t Hersteller: Fa. Phenomenex Dimensionen: 150 mm x 4.6 mm (ID) Material: 3 µm stationäre Phase: C18
18 I.4 Die mobile Phase 18 Adsorptions-Chromatographie t hi teilt sich auf in: Normal-Phase Phase-Chomatographie: NP Stationäre ti Phase Mobile Phase polar unpolar Reversed-Phase-Chomatographie: Stationäre Phase unpolar RP Mobile Phase polar
19 I.4 Die mobile Phase 19 Abb. I.4.1: 41 Komponenten eines HPLC-Systems CS (Eluenten)
20 I.4.1 Die Eluotrope Reihe 20 = Anordnung der Laufmittel nach steigender Elutionskraft E 0 ( Polarität) bezogen auf NP-Phase Phase (empirisch i bestimmt) t) Eluent Polarität [E 0 (Al 2O 3 3)] UV-Grenze [nm] hauptsäc chliche Verwen ndung in tographie NP-Chromat RP-Chromat tographie n-hexan Toluol Chloroform Dichlormethan Aceton Essigsäureethylester Dimethylsulfoxid Diethylamin Acetonitril 2-Propanol Methanol Wasser Abb. I.4.1.a: 0,00 0, ,40 0,42 0, ,58 0,62 0, ,65 0,82 0,95 >1, <190 Die Eluotrope Reihe (Auszug)
21 I.4.1 Die Eluotrope Reihe 21 n-hexan CHCl 3 CH 2 Cl 2 2-Propanol E 0 =0,00 E 0 = 0, 40 E 0 = 0,42 E 0 =0,82 Für die Normalphasen-(NP) (NP)-Chomatographie gilt: Elutionskraft = Fähigkeit des Fließmittels Substanzen in der Säule weiter zu befördern
22 I.4.1 Die Eluotrope Reihe 22 Beispiel für die Normalphasen-(NP): E 0 =0,00 E 0 =0,82 lutionskr raft sink kt 50% Hexan + 50% 2-Pr 60% Hexan + 40% 2-Pr 70% Hexan + 30% 2-Pr Rete entionsz zeiten st El Abb. I.4.1.b: 80% Hexan + 20% 2-Pr 90% Hexan + 10% 2-Pr teigen Entwicklung einer NP-Trennung (isokratisch)
23 I.4.1 Die Eluotrope Reihe 23 THF CH 3 CN Methanol H 2 O E 0 =0,45 E 0 = 0, 65 E 0 = 0,95 E 0 > 1 Für die Reversed-Phase-(RP) (RP)-Chomatographie gilt: Elutionskraft = Fähigkeit des Fließmittels Substanzen in der Säule weiter zu befördern
24 I.4.1 Die Eluotrope Reihe 24 Beispiel für die Reversed-Phase-(RP) (RP)-Chomatographie: E 0 = 0,65 E 0 > 1 El lutionskr raft sink kt Abb. I.4.1.c: 70% CH 3 CN + 30% H 2 O Nebenprodukt 60% CH 3 CN + 40% H 2 O % CH 3 CN + 50% H 2 O 40% CH 3 CN + 60% H 2 O Entwicklung einer RP-Trennung (isokratisch) Rete entionsz zeiten st teigen
25 I42Dieisokratische-Elution I.4.2 isokratische-elution 25 Die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der chromatographischen Trennung nicht: Abb. I.4.2.: Eluentenverlauf bei isokratischer Elution
26 I43DieGradienten-Elution I Die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der chromatographischen Trennung: Abb. I.4.3: Eluentenverlauf bei Gradienten Elution
27 I5DiePumpe I.5 / Injektor / Detektor 27 Abb. I.5.a: Komponenten eines HPLC-Systems (Pumpe, Detektor, Injektionseinheit)
28 I5DiePumpe I.5 Auslaßventil Kolben Einlaßventil Abb. I.5.b: Kolbenpumpe 28 Chromatograp
29 I5DiePumpe I.5 29 Auslaßventil Kolben Kolbenantrieb Einlaßventil Abb. I.5.c: Einkolben-Pumpe
30 I5DiePumpe I.5 30 Membran Kolben Hydraulik-Flüssigkeit Abb. I.5.e: Diaphragma-Pumpe
31 I6DieInjektionseinheit I.6 Injektionseinheit 31 Injektionsnadel Ventil Probengläschen Abb. I.6.a: Funktionsweise Autosampler Pumpe Säule Proben -Schleife
32 I7DieDetektoreinheit I.7 Detektoreinheit I.7.1 Der UV/VIS-Detektor 32 Spalt Gitter Flußzelle Deuteriumlampe Photozelle Abb. I.7: UV/VIS - Detektor (VWD oder MWD) jeweils nur eine Wellenlänge einstellbar
33 I7DieDetektoreinheit I.7 Detektoreinheit I.7.2 Der Diodenarray-Detektor Detektor (UV/VIS) 33 Spalt Gitter Photodioden ode Flußzelle Deuteriumlampe Abb. I.7.2: Der Photodiodenarray-Detektor
34 I721DerISO I ISO-Plot (DAD-Detektor) Detektor) 34 0 mau Absorption 100 mau Wellenlänge enlänge e [nm] Zeit [min] Abb. I.7.2.1: Isoplot einer chromatographischen Trennung
35 I722Der3D I D-Plot (DAD Detektor) 35 Chromatograp Absorptio on [mau] Abb. I.7.2.2: 3-D-Plot einer chromatographischen Trennung
36 I73DerMS I.7.3 MS-Detektor 36 Ionenquelle Quadrupol Ionenfalle HPLC Abb. I.7.3: Vereinfachte Darstellung eines HPLC-MS-Detektors
37 I.7.4 weitere HPLC-Detektoren 37 HPLC-Detektoren Anwendung Nachweisgrenze Linearität UV-VIS (VWD. MWD) DAD (Diodenarray-Detektor) nm selektiv nur für einzelne UV-aktive Komponenten selektiv für fast alle UV-aktiven Komponenten ca. 0,3 ng/ml ,3 ng/ml 10 4 RI universell ca. 0,7 g/ml 3 x 10 3 (Brechungsindex- Detektor) (stark temperaturabhängig, keine Gradientenelution möglich, relativ unempfindlich) FLD selektiv 0,8 pg/ml (Fluoreszenz-Detektor) nur für fluoreszierende Komponenten ECD (Elektrochemischer Detektor) CD Leitfähigkeitsdetektor selektiv, nur für oxidierbare oder reduzierbare Komponenten ca. 1,0 pg/ml -- ionenselektiv bis zu ca 0,2% untersch. Leitfähigkeit ca Abb. I.7.4: weitere häufig eingesetzte HPLC-Detektoren
38 I.8. Software Abb. I.8: Software ChemStation B Chromatograp
39 Kenngrößen des Chromatogramms 39 t R (X 2 ) t (X) t (X) t R (X) S (X) m t R (X 1 ) t m t S (X 1 ) t S (X 2 ) Kenngrößen eines Chromatogramms Zeit [s]
40 I.9 Die Methode des Internen Standards 40 Chromatographische hi h Läufe sind nie 100% identisch denn: Es kann zu ganz normalen Schwankungen zwischen den Läufen kommen, wie: Geringe Unterschiede im Injektionsvolumen (Luftblasen, manuelle Injektion). Veränderungen des Säulenmaterials im Laufe des Meßbetriebes. Veränderungen der Umgebungstemperatur etc.
41 I.9 Die Methode des Internen Standards 41 t R (X 1 ) t R (X 2 ) t (X) t (X) t R (X) S (X) m Interner Standard t m Abb. I.9: t S (X 1 ) t S (X 2 ) Zeit [s] Zugabe eines internen Standards (Tracer)
42 I.9 Die Methode des Internen Standards 42 Die Fläche eines Peaks ist mit der eingespritzten Stoffmenge bzw. der Masse m i des Stoffes proportional: i a = f m (1) i f i i Fläche der Komponente i Responsefaktor der Komponente i Masse der Komponente i
43 I.9 Die Methode des Internen Standards 43 Beliebige Substanz Tracer Substanz f i = a i m i (2) f Tr = a Tr m Tr (3) Tr = Tracer KF = i f Tr fi = K K Tr K Tr K i m i a Tr m Tr a Kalibrierfaktor der Komponente i (4) K = Kalibrierlösung
44 I.9 Die Methode des Internen Standards 44 f Tr f i = m m i x x Tr a a x Tr x i (5) x = Probenlösung Auflösen nach Masse der Komponente i m x f = Tr a KF i m i x Tr f i i a x a Tr Tr (6)
45 I.10 Fragen zum Theoretischen Teil 45 1.) In welche zwei grundlegenden Typen von Phasensystemen kann die Adsorptionschromatographie unterschieden werden? 2) 2.) Eklä Erklären sie den Begriff endcapping. 3.) Welche Effekte hinsichtlich der Peakform können auftreten, wenn z.b. basische Substanzen (Amine, Phenole) auf schlecht endgecappten RP-Phasen chromatographiert werden (2 Beispiele)? 4) 4.) Nennen Sie mindestens drei Vorteile, die RP-Phasen Ph im Vergleich zu NP-Phasen Ph aufweisen. 5.) Was versteht man unter der Eluotropen Reihe, wie wurde sie bestimmt, und welchem Ordnungsprinzip folgt sie? 6) 6.) Welcher Zusammenhang besteht zwischen Eo (Al 2 O 3 ) und Eo (SiO 2 )? 7.) Zwischen welchen beiden grundlegenden Arbeitsweisen wird beim Einsatz der mobilen Phase während einer chromatographischen Trennung unterschieden und wie nennt man diese Formen der Elution? 8) 8.) Erläutern sie in diesem Zusammenhang die Begriffe binärer, ternärer und quaternärer Gradient. 9.) Nennen sie zwei Gründe, warum Eluenten entgast werden sollten. 10.) Nennen sie vier mögliche Verfahren der Eluentenentgasung 11.) Wie ist der Kalibrierfaktor i KFi einer Komponente i definiert i? 12.) Nennen sie mindestens vier Eigenschaften, die ein geeigneter Tracer aufweisen muß. 13.) Nennen sie einen wesentlichen Unterschied zwischen dem Bauprinzip eines VWD-Detektors D und eines DAD-Detektors. D 14.) Erläutern sie in diesem Zusammenhang der Ausdruck: Inverse Optik. Nennen sie neben UV/VIS vier weitere Arten von HPLC-Detektoren.
46 Kapitel II Experimenteller Teil 46 Chromatograp
47 Kapitel II: Experimenteller Teil 47 II.1 II.2 II.2.1 II II II II.2.2 II.3 Einleitung (siehe Skript Praktikum) Versuchsdurchführung Vorbereitung der Lösungen (siehe Skript) Vorbereitung der Stammlösungen (siehe Skript Praktikum) Vorbereitung der Eich-(Kalibrierlösung) (siehe Skript Praktikum) Vorbereitung der Probenlösungen (siehe Skript Praktikum) Durchführung der HPLC-Analysen Aufgaben zum experimentellen Teil
48 II Experimenteller Teil O CH 3 H 3 C N N Coffein O N N CH 3 48 Chromatograp
49 II Experimenteller Teil II Durchführung der HPLC-Analysen 49 Abb. II.2.2.1: 2 Die Pumpen-Programmierung P
50 II Experimenteller Teil II Durchführung der HPLC-Analysen 50 Abb. II.2.2.2: Die Programmierung des Injektionsvolumens
51 II Experimenteller Teil II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen 51 Abb. II.2.2.3: Die Detektorprogrammierung (DAD)
52 II Experimenteller Teil II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen 52 Abb. II.2.2.4: 2 Die Programmierung des Säulenthermostaten t t
53 II Experimenteller Teil II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen 53 Abb. II.2.2.5: 2 Die Einstellung der Integrationsparameter ti t
54 II Experimenteller Teil I.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen 54 Abb. II.2.2.6: Die Programmierung des Autosamplers
55 II Experimenteller Teil II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen 55 Abb. II.2.2.7: 2 Das Starten t der Probensequence
56 II Experimenteller Teil II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen 56 Abb. II.2.2.8: 2 Der Menüpunkt: Data-Analysis
57 II Experimenteller Teil II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen 57 Abb. II.2.2.9: Das Erstellen der Kalibriertabelle
58 II Experimenteller Teil II.3.1 Durchführung der HPLC-Analysen 58 Abb. II : Das Erstellen des Quantitativen Reports
59 II Experimenteller Teil II.3.1 Durchführung der HPLC-Analyse 59 1.) Was versteht man unter der chromatographische Durchbruchszeit t m. 2.) Welche apparativen Einflüsse können zu einer deutlichen Beeinflussung der Durchbruchszeit führen (nennen sie 2 Beispiele)? 3.) Ermitteln sie aus dem Tracer-Chromatogramm die Retentionszeit t R (X) von Benzophenon, sowie die Durchbruchszeit t m des chromatographischen Systems. 4.) Berechnen sie daraus die Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen Phase u m in [cm/min] (Länge der Säule = 150 mm). 5.) Berechnen sie das Durchbruchsvolumen V m der mobilen Phase sowie das Retentionsvolumen V R von Benzophenon. 6.) Berechnen sie den Kapazitätsfaktor k für Benzophenon. 7.) Berechnen sie ausgehend von den erhaltenen chromatographischen Ergebnissen der Kalibriermessung den KF-Wert für Coffein. 8.) Berechnen sie mit Hilfe des ermittelten KF-Wertes die Konzentration an Coffein [mg/ml] in den jeweils untersuchten Originallösungen (Caffee- Lösung / Red Bull / Coca-Cola). 9.) Der Energy-Drink Red-Bull enthält neben Coffein auch die Substanz Taurin. Chemisch gesehen handelt es sich hierbei um 2-Amino-ethan- sulfonsäure. Zeichnen sie die Strukturformel von Taurin. 10.) In welchem Teil des Chromatogramms würden sie Taurin relativ zum Coffeinpeak tendentiell erwarten (niedrigere oder höhere Retentionszeit). Begründen sie ihre Aussage. 11.) Wie würden sie die Detektionsfähigkeit von Taurin im UV-Detektor einschätzen (Begründung)? Nennen sie eine alternative Detektionsmethode für Taurin. 12.) Welche Auftragung stellt ein Isoplot dar?
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