INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

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1 INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VI 1 EINLEITUNG Biofilme Allgemeines Biofilmbildung Allgemein Der conditioning film oder Die reversible Bindung Die irreversible Bindung Zusammensetzung eines Biofilms Lebensraum für Mikroorganismen Ablösung und Verteilung Verhindern und Beseitigen von Biofilmen Problematik der Biofilme im Hinblick auf gesundheitliche Gefährdung Nutzen von Biofilmen Studium von Biofilmen Resistenzfaktoren im Biofilm Pseudomonas aeruginosa Allgemeines Epidemiologie/Transmissionspfade Virulenzfaktoren Diagnose und Therapie VBNC-Zustand Anforderungen an das Trinkwasser Desinfektionsverfahren Technische Verfahren Mechanische Verfahren Physikalische Verfahren Thermische Desinfektionen Ultraviolette-Strahlung Impuls-Luftdruck-Verfahren Chemische Desinfektion Freies Chlor Elektrochemisch aktiviertes Wasser (ECA - Verfahren) Chlordioxid Ziel der Arbeit MATERIAL UND METHODEN Materialien Geräte Verbrauchsgüter 33 I

2 2.1.3 Chemikalien Lösungen und Puffer Bakterienstämme Nährmedien (Nährböden/ Nährbouillon) Gel-Marker für DNA-Größenstandards Oligonukleotide Enzyme Molekularbiologische Kits Software Das Silikonschlauchmodell Varianten des Silikonschlauchmodells zur Simulation von Praxisfällen 44 a) Das Kreislaufsystem 44 b) Dosieranlage zur Simulation einer kontinuierlichen Behandlung 45 c) Kreislaufsystem als Simulation einer Stoßbehandlung Angewandte Desinfektionsverfahren Formeln zur Berechnung Bestimmung der koloniebildenden Einheiten (KBE)/cm Bestimmung der Gesamtzellzahl (GZZ)/cm Bestimmung des Reduktionsfaktors (RF) Mikrokopie Lupe Fluoreszenzmikroskopie Rasterelektronenmikroskopie Mikrobiologische Methoden Stammhaltung von Pseudomonas aeruginosa (DSM 939) Kultivierung von Pseudomonas aeruginosa Bestimmung der Anzahl koloniebildender Einheiten bei Pseudomonas aeruginosa Mikrobiologische Untersuchung auf Pseudomonas aeruginosa in Biofilmen Probenahme am Silikonschlauchmodell Bestimmung der Anzahl koloniebildender Einheiten in Biofilmen Anzucht von Reinkulturen aus Biofilmmaterial Biofilmgenerierung im geschlossenen Kreislaufsystem Aufkonzentrierung von Zellen und DNA Vakuumfiltration 52 a) Vakuumfiltration von Pseudomonas aeruginosa 52 b) Aufkonzentrierung von Pseudomonas aeruginosa aus geringen Volumina 52 c) Vakuumfiltration zur Bestimmung der Gesamtzellzahl im Biofilm Rückgewinnung der Mikroorganismen durch Aufreinigung von DNA aus Filterproben 52 II

3 Bestimmung geeigneter Neutralisationsmittel zum Abstoppen der Desinfektionswirkung Quantitativer Suspensionsversuch Methode zur Testung der Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln angelehnt an den Quantitativen Suspensionsversuch mittels Micro-Plate-Reader Mikroskopische Methoden Nativ-Präparate Gramfärbungen Bestimmung der Gesamtzellzahl mittels DAPI Färbung Life/Dead-Färbung PNA-FISH PNA FISH Prinzip PNA FISH Prozedur Rasterelektronenmikroskopie Molekularbiologische Methoden DNA-Isolierung Aufkonzentrierung von DNA DNA-Konzentrations- und Reinheitsbestimmung Berechnung der Genomäquivalente Primer- und Sondendesign Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Agarosegelelektrophorese Aufreinigung amplifizierter DNA aus PCR-Ansätzen und Agarosegelen Quantitative real-time Polymerase-Kettenreaktion (qpcr) DNA-Sequenzierung DNA-Sequenzvergleich 62 3 ERGEBNISSE Charakterisierung von Biofilmen unterschiedlichen Alters Verlauf von Gesamtzellzahl und der Anzahl koloniebildenden Einheiten bei Biofilmen unterschiedlichen Alters Rasterelektronenmikroskopische Darstellung der Biofilmbeschaffenheit Identifikation der Biofilmpopulation durch Sequenzierung Einfluss chemischer Desinfektionsmittel auf die Entwicklung von Biofilmen Einfluss chemischer Desinfektionsmittel als Stossbehandlung zur Anlagendesinfektion Prüfprodukt 1: freies Chlor aus einem Verfahren zur Herstellung von Elektrochemisch aktiviertem Wasser (ECA-Produkt 1) Prüfprodukt 2: freies Chlor aus einem Verfahren zur Herstellung von elektrochemisch aktiviertem Wasser (ECA-Verfahren 2) Prüfprodukt 3: Chlordioxid (ph2) 77 III

4 3.2.2 Subletale Dosierung von chemischen Desinfektionsmitteln in kontinuierlicher Behandlung 82 von Biofilmen Prüfprodukt 4: Natriumhypochlorit Prüfprodukt 2: freies Chlor aus Verfahren zur Herstellung von 86 elektrochemisch aktiviertem Wasser (ECA-Verfahren 1) 3.3 Untersuchungsmodelle zur Einnistung von P. aeruginosa in Trinkwasserbiofilme Untersuchung des Silikonschlauchmodells auf natürliches Vorkommen des Zielorganismus Einnistung von P. aeruginosa in Modellbiofilme Modellbiofilm A Übersicht Modellbiofilm B Übersicht Modellbiofilm C Übersicht Modellbiofilm D Übersicht Etablierung eines Verfahrens zur Detektion möglicher vbnc-zustände bei Pseudomonas aeruginosa nach der Behandlung mit Desinfektionsmitteln Etablierung des Micro-Plate-Reader Modells Prüfprodukt 2: ECA-Wasser Prüfprodukt 3: Chlordioxid Prüfprodukt 4: Natriumhypochlorit Test auf vbnc-zustände Einsatz des Micro-Plate-Reader Verfahrens zur Detektion von vnbc-zuständen Test auf vbnc-zustände DISKUSSION Charakterisierung der Biofilme unterschiedlichen Alters Verlauf von Gesamtzellzahl und Anzahl koloniebildender Einheiten in Biofilmen unterschiedlichen Alters Rasterelektronenmikroskopische Darstellung der Biofilmbeschaffenheit Identifikation der Biofilmpopulation durch Sequenzierung Einfluss chemischer Desinfektionsmittel auf die Entwicklung von Biofilmen Einfluss chemischer Desinfektionsmittel als Stossbehandlung zur Anlagendesinfektion Vergleich der Prüfprodukte 1 (ECA-Produkt 1), Prüfprodukt 2 (ECA-Produkt 2) und Prüfprodukt 3 (Chlordioxid) Subletale Dosierung von chemischen Desinfektionsmitteln in kontinuierlicher Behandlung von Biofilmen Vergleich der Prüfprodukte 1 (ECA-Produkt 1) und 4 (Natriumhypochlorit) Untersuchungsmodelle zur Einnistung von fakultativ-pathogenen Erregern in Trinkwasserbiofilme des Silikonschlauchmodells Einnistung von P. aeruginosa in Modellbiofilme 120 IV

5 4.4 Etablierung eines Verfahrens zur Detektion möglicher vbnc-zustände bei Pseudomonas 121 aeruginosa nach der Behandlung mit Desinfektionsmitteln Etablierung des Micro-Plate-Reader Modells Einsatz des Micro-Plate-Reader Verfahrens zur Detektion von vnbc-zuständen Test auf vbnc-zustände Falsch-positive vbnc-zustände Umkehr des vbnc-zustands ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS DANKSAGUNG 154 V