Allgemeine Virologie SS Virusdiagnostik

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1 Allgemeine Virologie SS 2016 Virusdiagnostik Rainer G. Ulrich Friedrich-Loeffler-Institut Institut für neue und neuartige Tierseuchenerreger D Greifswald - Insel Riems rainer.ulrich@fli.bund.de

2 Allgemeine Virologie SS Klassifikation und Taxonomie von Viren R. Ulrich Virusdiagnostik R. Ulrich Epidemiologie R. Ulrich Klausur (Nachklausur: )

3 Zusammenfassung Die diagnostische Fragestellung bestimmt die Auswahl der/des Nachweisverfahren/s. Die Virusdiagnostik beinhaltet Verfahren zum direkten Erregernachweis, zum Nachweis von Virusbestandteilen und immunologischen Reaktionen des Wirtes. Der direkte Nachweis von replikationsfähigem Erreger basiert auf der Anzucht des Virus auf suszeptiblen Zellen und dem Nachweis Virusspezifischer cytopathogener Effekte (CPE). Der direkte Nachweis von Virusbestandteilen basiert auf der Antigen- und Nukleinsäure-Detektion (ELISA, Immunfluoreszenztest, Hämagglutinationstest, Hybridisierung, PCR/RT-PCR). ELISA, Immunfluoreszenztest, Immunoblot-Test, Neutralisations- und Hämagglutinationshemmtest dienen dem indirekten Nachweis von Virusinfektionen mittels qualitativer und/oder quantitativer Analyse Virusspezifischer Antikörper.

4 Gliederung der Vorlesung 1. Diagnostische Fragestellungen 2. Überblick über diagnostische Verfahren 3. Direkter Nachweis von replikationsfähigem Erreger 4. Nachweis von Virusbestandteilen 5. Nachweis von immunologischen Reaktionen des Wirtes

5 Gliederung der Vorlesung 1. Diagnostische Fragestellungen 2. Überblick über diagnostische Verfahren 3. Direkter Nachweis von replikationsfähigem Erreger 4. Nachweis von Virusbestandteilen 5. Nachweis von immunologischen Reaktionen des Wirtes

6 1. Diagnostische Fragestellungen I - Erregeridentifikation bei einer Infektion - Frische Infektion? - Akute (selbstlimitierende) Infektion oder chronische Infektion/Reaktivierung? - Therapiebeginn/Therapieverlauf - Resistenz gegen antivirale Substanzen - Unterscheidung von infizierten und immunisierten Tieren (DIVA, Markervakzine) - qualitative/quantitative Bestimmung (Titer): Messung einer schützenden Immunität nach Immunisierung, bei Möglichkeit einer perinatalen Übertragung oder zur Bestimmung des Impfstatus nach Nadelstichverletzung - Ätiologie neuer Erkrankungen - Epidemiologische Untersuchungen (Prävalenz, molekularepidemiologischer Nachweis des ätiologischen Agens)

7 1. Diagnostische Fragestellungen II

8 Gliederung der Vorlesung 1. Diagnostische Fragestellungen 2. Überblick über diagnostische Verfahren 3. Direkter Nachweis von replikationsfähigem Erreger 4. Nachweis von Virusbestandteilen 5. Nachweis von immunologischen Reaktionen des Wirtes

9 2. Überblick über diagnostische Verfahren Direkter Nachweis des replikationsfähigen Erregers Direkter Nachweis von Virusbestandteilen Antigennachweis Nukleinsäurenachweis Indirekter Nachweis von immunologischen Reaktionen des Wirtes Antikörper Zelluläre Immunantwort

10 2. Überblick über diagnostische Verfahren direkter Virusnachweis zeitlich nur limitiert möglich. Bei fortgeschrittenem Krankheitsstadium ist das primär ursächliche Virus häufig nicht mehr nachweisbar. messbares Auftreten einer spezifischen Immunantwort 2-3 Wochen nach Infektion. Diagnostisch verwertbar ist die humorale Immunantwort.

11 2. Diagnostische Marker im Infektionsverlauf HIV

12 Gliederung der Vorlesung 1. Diagnostische Fragestellungen 2. Überblick über diagnostische Verfahren 3. Direkter Nachweis von replikationsfähigem Erreger 4. Nachweis von Virusbestandteilen 5. Nachweis von immunologischen Reaktionen des Wirtes

13 3. Nachweis von replikationsfähigem Erreger Virusanzucht: Zellkultur embryoniertes Hühnerei Versuchstier Morphologische Sichtbarmachung: Mikroskopie Elektronenmikroskopie Kuhpockenvirusinfektion, Chorioallantoismembran

14 3. Nachweis von replikationsfähigem Erreger Virusanzucht in Zellkultur dient dem Infektiositätsnachweis nicht bei allen Viren möglich langsame, aber hochsensitive Methode Voraussetzung: Virusvermehrung führt zu charakteristischen Veränderungen in der Zellkultur (cytopathogener Effekt, CPE)

15 3. Zellkulturtechniken Primäre Zellkultur keine oder wenige Passagen Sekundäre Zellkultur Zellen eines einheitlichen Typs bis zu 50 Passagen z.b. embryonale Lungenzellen Permanente Zelllinien Tumorgewebe oder transformiert Auswahl (potentiell) suszeptibler Zellen für die Virusanzucht

16 3. Zellkulturen für die Virusanzucht Wirtszellen Abkürzung Geeignet zur Vermehrung folgender Viren Primäre Affennierenzellen PRMK Pockenviren, Mumpsvirus, Masernvirus, Rhinoviren, Influenzaviren Primäre Hühnerfibroblasten PCEC Tollwutvirus, FSME-Virus Affennierenzellen Vero Pockenviren, Marburg-Virus, Ebola-Virus, Rötelnvirus, Polioviren, Coxsackie-B-Viren, ECHO-Viren Hundenierenzellen MDCK Influenzaviren Humane diploide Fibroblasten HDCS HSV, VZV, HCMV, Rhinoviren, Rabiesvirus Humane Tumorzellen HEp2, HeLa Adenoviren, Parainfluenzaviren, Mumpsvirus, RSV, Polioviren, Coxsackie-B-Viren, Rötelnvirus, Coronaviren Moskitozellen Alphaviren, Dengueviren

17 3. Cytopathogene Effekte (CPE) Syncytienbildung Proliferativer CPE z.b. Respiratorisches Syncytial-Virus Diffuser cytolytischer CPE mit Abkugelung z.b. Paramyxoviren, Orthomyxoviren Cytoplasmatische Einschlusskörperchen z.b. Enteroviren z.b. Pockenviren

18 3. Plaque- und Focustest zur Quantifizierung Vacciniavirus/AGMK-Zellen MoMSV/3T3-Mausfibroblasten

19 Viren <250nm, keine lichtmikroskopische Darstellung Ausnahme: Pockenviren Elektronenmikroskopie mindestens 10 6 Partikel/ml erforderlich sehr hoher apparativer Aufwand die Morphologie allein kann meistens nur die Virusfamilie definieren, nicht aber Subfamilien oder Virusspezies schnelles Ergebnis 3. Direkter Erregernachweis Open view -Methode: Entdeckung neuer Erreger Anwendung: Stuhldiagnostik

20 3. Elektronenmikroskopie und Immunelektronenmikroskopie Elektronenmikroskopie (Kotprobe): Immunelektronenmikroskopie (Kotprobe): Rotaviruspartikel Caliciviruspartikel

21 Gliederung der Vorlesung 1. Diagnostische Fragestellungen 2. Überblick über diagnostische Verfahren 3. Direkter Nachweis von replikationsfähigem Erreger 4. Nachweis von Virusbestandteilen 5. Nachweis von immunologischen Reaktionen des Wirtes

22 4. Nachweis von Virusbestandteilen - Nachweis viraler Antigene: - (direkter) Immunfluoreszenztest, Immunhistochemie - capture-enzymimmunoassay (EIA) - Hämagglutinationstest - Nachweis von viraler Nukleinsäure: - Polymerasekettenreaktion (konventionelle und Echtzeit- (real-time) PCR/RT-PCR) - Hybridisierung (Chip/Array-Technologie)

23 4.1. Nachweis viraler Antigene - Sandwich-Enzymimmunoassay (EIA) direkte Verfahren: Verwendung von spezifischen Antikörpern, die enzymmarkiert vorliegen indirekte Verfahren: Verwendung eines Sekundärantikörpers, welcher enzymmarkiert vorliegt - (Direkter) Immunfluoreszenztest, Immunhistochemie Markierung mit Peroxidase, Alkalischer Phosphatase oder Fluoreszenzfarbstoffen (z.b. FITC) - Hämagglutinationstest

24 4.1. Antigennachweis mittels ELISA Sandwich-ELISA

25 4.1. Immunfluoreszenztest (IFT) und Immunhistochemie (IHC) Tollwutvirus-Antigennachweis in Gehirnprobe eines Hundes. Tollwutvirus-Antigennachweis im Gehirn-Paraffinschnitt eines Hundes.

26 Influenzavirus 4.1. Hämagglutinationstest

27 4.2. Nachweis viraler Nukleinsäuren Erreger können direkt ohne vorherige Virusanzucht und Vermehrung nachgewiesen werden empfindlicher als der Nachweis eines viralen Antigens Nukleinsäurenachweis ohne Vervielfältigung der Nukleinsäure Hybridisierung (Southern Blot - DNA, Northern Blot - RNA, in situ- Hybridisierung, Chip/Array-Technologie) Nukleinsäurenachweis mit Vervielfältigung der Nukleinsäure Polymerasekettenreaktion (konventionelle und Echtzeit-PCR/RT-PCR)

28 4.2. Southern Blot zum Virus-DNA-Nachweis

29 4.2. In situ-hybridisierung (ISH)

30 4.2. Polymerasekettenreaktion Methode zur selektiven in vitro-vermehrung definierter DNA- Abschnitte unter Verwendung einer thermostabilen DNA- Polymerase I (Direktnachweis kleinster Mengen von DNA) Sequenz des zu vervielfältigenden DNA-Abschnitts muss bekannt sein (Auswahl der Primer) Zyklische Wiederholung von 3 Schritten: 1. Denaturierung der DNA in Einzelstränge 2. Anlagerung von synthetischen Polymeren (Oligonukleotiden) 3. Synthese komplementärer DNA-Stränge

31 4.2. PCR-Technologie Konventionelle PCR/RT-PCR Pan-PCR/RT-PCR nested/semi-nested PCR/RT-PCR Kompetitive (semiquantitative) PCR/RT-PCR Random-priming, Klonierung, Sequenzierung (Abgleich gegen Datenbanken) Quantitative Echtzeit-PCR (-RT-PCR)

32 4.2. Indikationen für den Einsatz der PCR Quantitative Bestimmung der HBV-DNA oder HCV- RNA als Verlaufsparameter der antiviralen Therapie. Feststellung der Viruslast (viral load) zur Therapieüberwachung bei einer HIV-Infektion oder bei Verdacht auf eine perinatale Übertragung. Verdacht auf eine Herpesvirusinfektion (HSV-PCR oder VZV-PCR). Molekularepidemiologische Untersuchungen.

33 4.2. Spezifitätsnachweis Längenscreening in der Gelelektrophorese und Anfärbung der PCR- Produkte Hybridisierung mit einer Gensonde (Southern Blot; ELISA) Sequenzspezifische Amplifikatspaltung durch Restriktionsenzyme (Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus, RFLP) nested/seminested PCR (RT-PCR) Nukleinsäuresequenzierung

34 4.2. Produktdetektion mittels Echtzeit-PCR Detektion von Fluoreszenzsignalen, die mit der Amplifikatbildung im direkten Zusammenhang stehen Verwendung von fluoreszenzmarkierten Hybridisierungssonden (Spezifitätsnachweis) oder Doppelstrang-DNA-bindenden Fluoreszenzfarbstoffen (z.b. SYBR Green I) Quantifizierung mittels Software-gestützter Berechnung eines Fluoreszenzschwellenwertes Threshold Zyklus, bei dem der berechnete Fluoreszenzschwellenwert gekreuzt wird Threshold Cycle (TC) Schwellenwert wird umso eher erreicht, je mehr Zielsequenzen sich in der zu untersuchenden Probe befinden

35 4.2. Real-time PCR: 5 -Exonuklease-Assay TaqMan-Sonden

36 4.2. Real-time PCR: absolute Quantifizierung Well Name Dye Well Type Ct (drn) Final Call (drn) Quantity (copies) #_00 FAM Unknown 20,21 + 7,94E+05 #_03 FAM Unknown 27,03 + 6,73E+03 DI9 FAM Standard 16,46 + 1,00E+07 DI9 FAM Standard 23,12 + 1,00E+05 DI9 FAM Standard 30,24 + 1,00E+03 DI9 FAM Standard 36,02 + 1,00E+01 NTC FAM NTC No Ct - No Ct Unbekannte Probe Standards NTC

37 4.2. Vorteile der Echtzeit (real-time)-pcr Extrem sensitiv - Amplifikation sehr kleiner Fragmente Spezifitätsgewinn - Detektion über Sonden Sehr schnell - gleichzeitige Amplifikation und Detektion Deutlich verminderte Kreuzkontaminationen - kein Öffnen der PCR-Reaktionsgefäße nach der Amplifikation notwendig Sehr gut automatisierbar - Hochdurchsatzverfahren Quantifizierung möglich - Viruslastbestimmung

38 4.2. Prinzip von DNA-Mikroarrays

39 4.2. DNA-Chip-Technologie Glas-Objektträger mit Mikroarray: Messpunkte (Spots) mit individuellen DNA-Oligomeren bekannter Sequenz DNA-Chip auf Oligonukleotid-Basis

40 4.2. Diagnostisches DNA-Chip-System für AIV Hämagglutinin Neuraminidase, Matrixprotein Reporter Alexa 555 Reporter Alexa 647 Bio. Streptavidin Amplikon PanHA Capture H1-16 HPAIV H5 und H7 I. Identifizierung II. Subtypisierung III. Pathotypisierung Bio. Streptavidin Amplikon PanNA, M Capture (Sonde) M N1-9 A. Gall (FLI)

41 Gliederung der Vorlesung 1. Diagnostische Fragestellungen 2. Überblick über diagnostische Verfahren 3. Direkter Nachweis von replikationsfähigem Erreger 4. Nachweis von Virusbestandteilen 5. Nachweis von immunologischen Reaktionen des Wirtes

42 5. Antikörpernachweis Nachweis einer frischen Infektion (IgM-Ak, Titeranstieg IgG-Ak) z.b. anti-hav-igm Nachweis einer stattgefundenen Infektion (IgG-Ak) z.b. HIV, HCV, HBV, HDV Nachweis einer Immunität (IgG-Ak) z.b. Poliovirus, FSMEV, anti-hbs (HBV) Nachweis einer Virusreaktivierung (IgM-Ak) z.b. HSV, HCMV

43 5. Antikörper-Nachweisverfahren ELISA/EIA Enzyme-linked Immunosorbent Assay Herpesviren, Hepatitis B-Virus iifa HHT IB NT indirekter Immunfluoreszenzassay Hantaviren Hämagglutinationshemmtest Rötelnvirus Immunoblot, Western Blot, Lineassay HIV, HCV, EBV, HEV Neutralisationstest Enteroviren, Hantaviren

44 5. Neutralisationstest

45 5. Hämagglutinationshemmtest (HHT)

46 5. Rötelnvirus-Hämagglutinationshemmtest

47 5. Antikörpernachweis mittels ELISA - indirekter ELISA - capture ELISA (µ, mak) - kompetitiver ELISA

48 5. ELISA zur qualitativen Bestimmung von Virus-spezifischen Antikörpern Quantifizierung von Antikörpern durch Endpunkttitration

49 5. Immunoblot: Western Blot-Test Bestätigungstest für HIV-Diagnostik HIV-Blot mit positiver Kontrolle (1), negativer Kontrolle (2) und 3 Patientenseren (A,B,C)

50 5. Diagnostische Bewertung Der Nachweis virusspezifischer Antikörper in einer klinischen Probe ist nur ein indirekter Hinweis auf eine virale Infektion. Da Virus-spezifische IgG-Antikörper oftmals lebenslang persistieren, ist ihr Nachweis in einer einzelnen Serumprobe kein ausreichender Beweis für eine akut stattfindende Infektion. Nur der Nachweis von Virus-spezifischen IgM-Antikörpern und/oder die Bestimmung der Titer Virus-spezifischer IgG-Antikörper in zwei aufeinanderfolgenden Proben (mindestens 14 Tage Abstand) kann Auskunft über den Zustand der Infektion geben (Titerunterschiede größer oder gleich einem Faktor 4 sprechen für eine akute Infektion). Da bei vielen Virusinfektionen eine signifikante Antikörperbildung erst 8-12 Tage nach der Infektion einsetzt, ist bei negativem Befund unter Umständen eine Verlaufsprobe erforderlich (Diagnostisches Fenster).

51 Zusammenfassung Die diagnostische Fragestellung bestimmt die Auswahl der/des Nachweisverfahren/s. Die Virusdiagnostik beinhaltet Verfahren zum direkten Erregernachweis, zum Nachweis von Virusbestandteilen und immunologischen Reaktionen des Wirtes. Der direkte Nachweis von replikationsfähigem Erreger basiert auf der Anzucht des Virus auf suszeptiblen Zellen und dem Nachweis Virusspezifischer cytopathogener Effekte (CPE). Der direkte Nachweis von Virusbestandteilen basiert auf der Antigen- und Nukleinsäure-Detektion (ELISA, Immunfluoreszenztest, Hämagglutinationstest; Hybridisierung, PCR/RT-PCR). ELISA, Immunfluoreszenztest, Immunoblot-Test, Neutralisations- und Hämagglutinationshemmtest dienen dem indirekten Nachweis von Virusinfektionen mittels qualitativer und/oder quantitativer Analyse Virusspezifischer Antikörper.

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53 Danksagung Gisela Flunker (Greifswald), Astrid Gall und Bernd Hoffmann (Riems) für die Bereitstellung von Folien