Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde des Fachbereichs Humanmedizin der Freien Universität Berlin

Transkript

1 1 Centrum Somatische Gentherapie in der Abteilung Molekularbiologie und BioInformatik Institut für Molekularbiologie und Biochemie der Freien Universität Berlin Abteilungsleiter: Professor Dr. Burghardt Wittig Geschäftsführender Direktor: Professor Dr. Werner Reutter Entwicklung und Charakterisierung einer Methode zum direkten ballistischen Transfer von Genen in Tumorzellen zur Herstellung von autologen Anti-Tumorvakzinen Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde des Fachbereichs Humanmedizin der Freien Universität Berlin Vorgelegt von Andreas Albers aus Bremen

2 2 Referent: Professor Dr. Burghardt Wittig Koreferent: Professor Dr. Werner Rosenthal Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs Humanmedizin der Freien Universität Berlin Promoviert am:

3 3 DANKSAGUNG Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Professor Dr. Burghardt Wittig, für die Möglichkeit diese Arbeit in seiner Abteilung anfertigen zu dürfen und für die über den Themenbereich der Arbeit hinausreichende Motivation wissenschaftlich zu arbeiten. Ich bedanke mich bei allen Mitgliedern und Sponsoren des Centrum Somatische Gentherapie e.v. für die Gewährung eines großzügigen Stipendiums. Für die Einarbeitung in den Themenbereich, die tolle Zusammenarbeit und die unzähligen hilfreichen Diskussionen bedanke ich mich bei Herrn Tomislav Dorbic, dem Leiter des Centrum Somatische Gentherapie e.v. Herrn Priv. Doz. Dr. Reinhardt Wanner danke ich für die Durchsicht des Manuskriptes und all die hilfreichen Fragezeichen am Rande des Textes. Dr. Matthias Schroff sei herzlich für die Überlassung der verwendeten Plasmide gedankt. Der gesamten Arbeitsgruppe Wittig und den Mitarbeitern des Centrum Somatische Gentherapie sei für die freundliche Unterstützung bei der Arbeit und das gute Arbeitsklima gedankt. Meinem Freund Dr. Ilan Schnell sei für die Unterstützung bei allen Berechnungen und die Hilfe bei der Realisierung der Computersimulation gedankt. Meiner Mutter danke ich für die liebevolle Motivation und konstante Unterstützung während des gesamten Studiums, ohne die nichts möglich gewesen wäre. Meinem Vater danke ich für das Interesse und die Neugier, die er mir an der Wissenschaft vermittelt hat.

4 4 Die selbständige Anfertigung versichere ich an Eides statt Berlin, den (Datum) (Andreas Albers)

5 5 1 ZUSAMMENFASSUNG EINLEITUNG Hintergrund: Karzinogenese Einführung zum Thema Gentherapie Definition der Gentherapie Übersicht über Gentherapiestrategien und Beispiele für Kandidatengene Substitutionstherapie Vermittlung einer zusätzlichen Funktion Suizidgentherapie Tumorsuppressor- und Anti-Onkogentherapie Supportive Gentherapiemaßnahmen Aktive Krebs-Immungentherapie Tumorzellvakzine Immunologische Grundlagen und Hintergründe Tumor Antigene Zytokin-Gentherapie von Krebs Prinzipien zytokininduzierter Tumorimmunität Schlußfolgerungen Klinische Studien mit IL-7 und GM-CSF exprimierenden autologen Tumorzellen zur Gentherapie metastasierender Karzinome GM-CSF Interleukin-7 (IL-7) Gentransfer in der Gentherapie Sicherheitsaspekte beim Gentransfer Chemische Gentransfersysteme Liposomaler Gentransfer Calcium-Phosphat Transfektion DEAE-Dextran Technik Biologische Gentransfersysteme Rezeptorvermittelter Gentransfer Viraler Gentransfer Physikalische Gentransfersysteme Elektroporation Mikroinjektion Ballistischer Gentransfer Ballistomagnetischer Gentransfer Zielsetzung der Arbeit MATERIALIEN Verwendete Geräte Verwendete Materialien und Chemikalien Bakterienstämme und Zellinien Zellkulturmedien Plasmidkonstrukte und Oligodesoxyribonukleotide Puffer, Lösungen und Medien METHODEN DNA-Präparation und Aufreinigung Herstellung elektrokompetenter Bakterien...49

6 Elektroporation von Bakterien Großpräparation von Plasmiden Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Restriktionsverdau Auftrennung von DNA in Agarosegelen Photographie von Agarosegelen Zellkulturarbeiten Anzucht der Zellen Adhärente Monolayerkulturen Suspensionskulturen Etablierung von Primärkulturen aus Nierenzellkarzinomen und malignen Melanomen Kultivierung der einzelnen Zellinien Einfrieren von Zellen Auftauen von eingefrorenen Zellen Bestimmung von Zellzahl und Zellgröße nach der Coulter-Methode Beschichtung von Petrischalen mit Zellen nach Burkholder et al Ballistomagnetischer Gentransfer Vorbereitungen zum ballistomagnetischen Gentransfer Herstellung der Plasmid- oder Oligonukleotidsuspension zum Beschichten der Microcarrier Beschichten der Micro- und der Macrocarrier Durchführung des ballistomagnetischen Gentransfers Isolieren der magnetisch markierten Zellen nach dem ballistomagnetischen Gentransfer Vorbereitung der Trennsäule zur Selektion der magnetisch markierten Zellen Isolieren der magnetisch markierten Zellen Antikörperfärbung zum Nachweis der CD40L-Expression im Durchflußzytometer Messungen mit dem Durchflußzytometer Aufbau und Prinzip des Durchflußzytometers Vorbereitung und Messung der Proben Auswertung der Messungen ELISA zur in vitro Quantifizierung der Zytokin-Expression Sammeln und Lagern der Proben Prinzip des hgm-csf und hil-7 ELISA von BioSource Grenzen der Methode bei hohen Zytokinkonzentrationen Sensitivität/ Spezifität Näherungsformel zur Bestimmung der bei der MIP-Methode maximal einsetzbaren Zellzahl Herleitung der Formel Computerprogramm zur Simulation des Beschießens von Zellen Ziel des Experiments Beschreibung des Programms Programm: Fehlerbetrachtung der Versuchsergebnisse ERGEBNISSE Begriffsdefinitionen...84

7 7 5.2 Die MIP-Methode ermöglicht ballistischen Gentransfer in Zellen unabhängig von ihrer Fähigkeit zu adhärieren Die MIP-Methode Vorbereitung der Zellen Equilibrieren der Polycarbonat-Membraneinsätze: Berechnung der auszusäenden Zellzahl Aussäen der Zellen Ablösen der Zellen von der Polycarbonatmembran Vergleich der MIP-Methode mit der Burkholder-Methode Vergleich der Zellausbeute nach ballistischem Gentransfer mit der MIP- Methode oder der Burkholder-Methode nach magnetischer Anreicherung der Zellen Vergleich der Transfektionsraten mit Reportergenen Vergleich der Kotransfektion von CD40L und egfp Kotransfektion von Primärkulturen mit GM-CSF und IL Computersimulation des ballistischen Gentransfers Darstellung der Treffer pro Zelle bei unterschiedlichen Trefferraten Trefferverteilung bei unterschiedlichen Gesamttrefferraten Zusammenhang zwischen Zellgröße, Zellzahl und Partikelzahl Zusammenhang zwischen Goldmenge und Partikelzahl- und größe DISKUSSION Statistische Auswertung der Ergebnisse Auswertung der durchflußzytometrischen Messungen MIP-Methode Berechnung der auszusäenden Zellzahl Vergleich der MIP-Methode mit der Burkholder-Methode Aussäen der Zellen Effizienz der magnetischen Separation Ballistischer Gentransfer Transfektionsrate mit einem Reportergen Kotransfektion von CD40L und egfp Kotransfektion von Primärkulturen mit GM-CSF und IL Computersimulation des ballistischen Gentransfers LITERATURVERZEICHNIS ANHANG Abkürzungsverzeichnis Protokoll: Ballistomagnetischer Gentransfer mit der MIP-Methode CURRICULUM VITAE PUBLIKATIONSLISTE...135