Analytische Chemie für Biologie Pharmazie Bewegungswissenschaften

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1 G HS007 nalytische Chemie für Biologie Pharmazie Bewegungswissenschaften und Sport Theoretische Grundlagen Teil Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren Oct-9-07 C BPBS HS07 1 Fundmentale Konzepte Gleichgewicht / Kinetische Eigenschaften Mobile Phase: gasförmig, flüssig Stationäre Phase: flüssig, fest dsorption/desorption S Beweglichkeit 1 m Zwischen beiden Phasen: Verteilungsgleichgewicht (flüssige stationäre Phase) Mobile Phase [] m Verteilungs gleichgewicht Mobile Phase dsorption/desorption Gleichgewicht (feste stationäre Phase) Flüssige stationäre Phase Feste stationäre Phase Oct-9-07 C BPBS HS07 [] s Verteilung dsorption/desorption 1

2 Trennmethoden auf Unterschied in Gleichgewicht / Kinetische Eigenschaften Typen von Trennmethoden: Klassifizierung dsorption/desorption S m Verteilung 1 Beweblichkeit in Einzelphase Gleichgewicht & Beweblichkeit Eindringengeschwindigkeit Elektrophorese (Kap. 4) Gas Chromatographie Membrantrenn- Isoelektrische Fokussierung GC (Kap. ) verfahren Isotachophorese Flüssig Chromatographie Dialyse Kapillarzonenelektrophorese HPLC (Kap. 3) Elektrodialyse Oct-9-07 C BPBS HS07 3 Übersicht Trennmethoden Zweite Phase gasförmig fluid flüssig fest gasförmig thermische Diffusion Gas-Flüssigkeits- Chromatographie (GC) Gas-dsorptions- Chromatographie fluid Fluid-Flüssigkeits- Chromatographie Fluid-dsorptions- Chromatographie Erste Phase flüssig Destillation Flotation fest Sublimation Fluid-Fest- Extraktion Flüssigkeits- Flüssigkeits- Chromatographie (LC, HPLC) Dialyse Flüssig-Flüssig- Extraktion Ultrafiltration Flüssig-Fest- Extraktion Flüssigkeits- dsorptions- Chromatographie Ionenaustausch usfällen Kristallisieren bscheiden (Zonenelektrophorese) Oct-9-07 C BPBS HS07 4

3 Übersicht Chromatographische Methoden MP Gas Überkritisches Fluid Flüssigkeit SP flüssig fest flüssig fest flüssig fest dsorbens molekularsieb dsorbens Gebundene Phase dsorbens Gebundene Phase Harz Gel Form Säule Säule Säule Säule planar Säule planar Säule Säule Säule GLC GSC SFC LLC TLC LSC BPC IEC SEC GC LC/TLC/HPLC Oct-9-07 C BPBS HS07 5 Übersicht Chromatographische Methoden Chemische Trennmethode beruht auf chemische Eigenschaften von der zu trennenden Substanzen. Physikalische Trennverfahren basiert an kinetische oder Gleichwichts eigenschaften von der zu trennenden Substanzen. Oct-9-07 C BPBS HS07 6 3

4 Illustrationen aus Tswetts erster Publikation Entwicklung der ersten chromatographischen Technik durch Mikhail Semenovich Tswett im Jahr 1903 (Trennung verschiedener Chlorophylle aus Blättern an Calciumcarbonat) Chromatographie: chroma Farbe graphein schreiben Mikhail Semenovich Tswett Oct-9-07 C BPBS HS07 7 Geschichte der Chromatographie 1903 Tswett: rbeiten zur Trennung von Chlorophyll mittels dsorptionschromatographie - Namensgebung für die Methode 1938 Iszmailov und Schraiber: Grundlagen der DC 1938 Kuhn: Nobelpreis 1938 für seine nwendung der Tswettschen dsorptionschromatographie an Carotinoiden und Vitaminen 1940 Martin und Synge: Nobelpreis 195 für rbeiten zur Verteilungschromatographie, theoretische Grundlagen durch nalogieerklärungen zur Extraktion, Einführung der HETP als chromatographische Kenngröße 1951 Erster Gaschromatograph von Martin und James 1956 Van-Deemter-Gleichung von der Gruppe Klingenberg (Shell) 1965 Stahl: Einzug der DC in die chemische nalytik Oct-9-07 C BPBS HS07 8 4

5 Bestandteile einer Säulenchromatographie Säule Kieselgel ElutionsLM Sand Glaswolle Oct-9-07 C BPBS HS07 9 Trennsäule Hauptteil Oct-9-07 C BPBS HS

6 Theoretische Grundlagen zum Chromatographie nschauliches Konzept Nernst-Verteilung Craig-Verteilung Einflussfaktoren etentionszeit (, t und t ) etentionsfaktor (k) oder Kapazitätsfaktor (k) Trennfaktor () Phasenverhältnis () Klassische Theorie: (HETP) uflösung () Kinetische Theorie: Van-Deemter-Gleichung Optimieren Quantitative Methoden Oct-9-07 C BPBS HS07 11 Verteilungskoeffizient K Mobile Phase Stationäre Phase [] m [] s K = [ ] stationär [ ] mobil einstufig Nernst-Verteilung Oct-9-07 C BPBS HS07 1 6

7 Craig-Veteilung K = K = 1 7.3% 1.9% 10.9% 3.1% 0.4% K = 9 80% K = % Oct-9-07 C BPBS HS Probe Prinzip der Chromatographie Transport durch mobile Phase mobile Phase (gas oder flüssig) Stoffaustausch HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate) t stationäre Phase (flüssig oder fest) Wand aus fused silica mit Polyimidbeschichtung Flüssigkeitsfilm lle chromatographischen Verfahren basieren auf einer wiederholten Einstellung des Gleichgewichts in mobiler und stationärer Phase und Transport durch MP. Oct-9-07 C BPBS HS

8 Stoffgemisch Ein Chromatogramm Mobile Phase Mobile Phase Stationäre Phase + B B B K = [ ] S [ ] M K M = 0 K < K B M B t t B Oct-9-07 C BPBS HS07 15 etentionszeit solvent delay or dead time Durchschnittlich linear Geschwindigkeit u = L t etentionszeit t reduzierte retentionszeit v = L t ; t N = j t (in GC, j Kompressionskorrektorfaktor); t (in LC)) Oct-9-07 C BPBS HS

9 Kapazitäts- / etentionsfaktor k Migrationsrate eines nalytes: c v = u M 1 1 = u c M + c s V s 1+ c V = u s s 1+ K V s c M v = u 1 1+ k L t = L 1 1+ k oder etentionsfaktor k k = t v = L t ; u = L = t k zwischen 1 5, k = K V s Kapazitätsfaktor Siehe. Kellner, et al., S 56-8 < 1 zu schnell ohne Trennung > 0 unerträglich langsam Oct-9-07 C BPBS HS07 17 Trennfaktor und Phasenverhältnis Trennfaktor = K B K Phasenverhältnis GC LC = k B k = t = V G V S = V S = d c 4d f ( ) B ( t ) V G V S d c d f normierte Signalhöhe h t t t M t B B t B w Volumen der Gasphase Volumen der Stationären Phase Durchflussvolumen Innendurchmesser der Kapillarsäule Filmdicke der stationären Phase Zeit Oct-9-07 C BPBS HS

10 Klassische Theorie normierte Signalhöhe h Idealer gaussförmiger Peak w b = 4 y = y 0 e w h =.354 Idealer gaussförmiger Peak und daraus ableitbare Parameter: w b = Basisbreite, w h = Peakbreite in halber Peakhöhe, = Standardabweichung. 4 x x Peakbasisbreite und Standardabweichung w = w 1 = 4 Varianz (ein Mass für die Breite des Peaks) = w 16 bweichungsfälle: Fronting Tailing Oct-9-07 C BPBS HS07 19 nzahl theoretischen Böden (N) HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate) t HETP nzahl theoretischen Böden (N) definiert als: N = t =16 t w H = L w 16 t N = L H w: die Basispeakbreite t : die etentionszeit : die Standardabweichung der Peakbreite L: die Säulenlänge (m) H: die Bodenhöhe (mm) Effektive Bodenzahl k +1 N = N eff = t k +1 k k Oct-9-07 C BPBS HS

11 = t B t + w wenn w : = t B t Bodenzahl = t B t t B = k B k 1+ k B = (t B t ) + w N 4 etentionsfaktor N 4 t N =16 w t = t k = t uflösung + = k B k Trennfaktor normierte Signalhöhe h t t t B t B w 1 k = B N 1+ k B 4 t = 16 H 1+ k B u 1 k B B ( ) 3 Zeit Oct-9-07 C BPBS HS07 1 Die chromatographische uflösung? = t + w < 1 keine Trennung = 1 gute Trennung aber mit wenig Überlagerung = komplette Trennung Oct-9-07 C BPBS HS07 11

12 Zusammenfassung (1) Verteilungskoeffizient K = [ ] S [ ] M etentionszeit / Geschwindigkeit t u = L v = L = t t etentionsfaktor / Kapazitätsfaktor k = t Trennfaktor = K B K = t = k B k k = K V s ) B (t ) = (t Bodenzahl und Bodenhöhe N = L H = t =16 t w H = L w 16 t k +1 N = N eff = t k +1 k k uflösung = t t B + w 1 k = B 1+ k B = (t B t ) + w N 4 Oct-9-07 C BPBS HS07 3 1

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