Analyse differenzieller Membranproteine in regulatorischen CD4 + CD25 + und konventionellen CD4 + T-Zellen von Mus musculus.

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1 Analyse differenzieller Membranproteine in regulatorischen CD4 + CD25 + und konventionellen CD4 + T-Zellen von Mus musculus Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften an der Ruhr-Universität Bochum angefertigt im Medizinischen Proteom-Center der Ruhr-Universität Bochum Arbeitsgruppe Brain Proteomics vorgelegt von Diplom-Biologe Stefan Helling aus Herne Bochum Februar 2007

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3 ERKLÄRUNG Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um fünf in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare. Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde. Bochum, Stefan Helling

4 Referent: Juniorprof. Dr. Katrin Marcus Korreferent: Prof. Dr. Günter A. Schaub

5 Für meine Familie

6 Dank an Juniorprof. Dr. Katrin Marcus, für die herzliche Aufnahme in ihre Arbeitsgruppe, die kompetente und engagierte Betreuung und für die kleinen Mysterien, die sich an so manchem Feiertag ereignet haben. Prof. Dr. Helmut E. Meyer, dem ich das interessante Promotionsthema zu verdanken habe und für seinen unermüdlichen Einsatz für das MPC und seine Mitarbeiter. Prof. Dr. Günter A. Schaub, der mich seit meiner Diplomarbeit betreut und mir noch immer mit Rat und Tat zur Seite steht. Prof. Dr. Edgar Schmitt, für die vielen Proben, die freundliche Aufnahme in seine Arbeitsgruppe zwecks weiterführender Experimente, sowie seinen Mitarbeitern Christoph Richter und Tobias Bopp, die mich in die Geheimnisse der qrt-pcr eingeführt haben und Nina Ullrich, die weiterführende Experimente mit meinen Kandidaten durchführt. Dr. Helmut Jonuleit und Jan Kubach, für die Bereitstellung der humanen T-Zellen. Dr. Petra Lutter, die als Leiterin des T-Zell-Projektes hervorragende Arbeit geleistet hat und mir bei so manch kniffeliger Frage helfen konnte sowie Anja, Elke und Melanie für ihre unermüdliche Hilfsbereitschaft. Gabi, Conny, Thomas, Caroline, Eva und allen anderen lieben Leuten des MPC. Paul und meine Mutter Irene, die mir stets zur Seite standen. meine wunderbare Maggy, meinen Süßen, Julia und Klara, und dem kleinen Gummibärchen.

7 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Mechanismen der Immunabwehr Mechanismen der immunologischen Toleranz Subtypen regulatorischer T-Zellen Mechanismen der Suppression von CD4 + T-Zellen durch CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen Proteom-Studien zur differenziellen Analyse von Proteinen Mehrdimensionale gelelektrophoretische Methoden zur Proteinauftrennung Nachweis geringer Proteinmengen durch die satdige-methode Massenspektrometrische Methoden zur Identifikation von Proteinen 14 2 Zielsetzung der Arbeit 17 3 Material und Methoden Material Chemikalien Lösungsmittel und Kits Geräte und weitere Materialien Herkunft der Zellen und Organe Methoden Kultivierung der Jurkat T-Zellen Isolierung muriner regulatorischer CD4 + CD25 + T-Zellen und konventioneller CD4 + T-Zellen Isolierung humaner regulatorischer CD4 + CD25 + T-Zellen und konventioneller CD4 + T-Zellen Stimulation humaner und muriner T-Zellen Bestimmung der Lebendzellzahlen Zelloberflächenmarkierung mit EZ TM -Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Zellaufschluss in hypotonischen Puffern und Anreicherung der Plasmamembranen Zellaufschluss und Membranproteinextraktion mit Triton X

8 Inhaltsverzeichnis II Aminosäureanalyse zur Proteinkonzentrationsbestimmung Eindimensionale Polyacrylamid Gelelektrophorese Proteinmarkierung mit CyDye TM DIGE Fluor Saturation Dyes D-IEF/SDS-PAGE zur differenziellen Analyse Triton X-114 angereicherter Membranproteine muriner T-Zellen D-CTAB/SDS-PAGE zur differenziellen Analyse Triton X-114 angereicherter Membranproteine muriner T-Zellen Visualisierung der Proteine Ermittlung differenzieller Proteinspots In-Gel Verdau mit spezifischen Endoproteasen NanoLC-ESI Massenspektrometrie zur Proteinidentifizierung MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie zur Proteinidentifizierung Proteinnachweise mit Western-Blot Analysen Quantitative RT-PCR zur Ermittlung von mrna-regulationen 48 4 Ergebnisse Auswirkung der Zellaufarbeitung auf die Detektion des Plasmamembran Proteoms von T-Zellen Effizienz der Plasmamembran-Anreicherung mit differenzieller Zentrifugation Effizienz der Plasmamembran-Anreicherung mit Dichtegradienten- Zentrifugationen Effizienz Triton X-114 Detergenz-basierter Anreicherung von Plasmamembranproteinen Auswirkungen der Stimulation auf die Proteinregulation humaner und muriner T-Zellen sowie Unterschiede im Proteom CD4 + und CD4 + CD25 + T-Zellen Auswirkung der Phytohaemagglutinin-Stimulation auf das Proteom humaner CD4 + T-Zellen Regulation 1D-SDS-PAGE separierter Proteine Anti-CD3/-CD28 stimulierter muriner CD4 + und CD4 + CD25 + T-Zellen 68

9 Inhaltsverzeichnis III Regulation 2D-IEF/SDS-PAGE separierter Proteine Anti-CD3/- CD28 stimulierter muriner CD4 + und CD4 + CD25 + T-Zellen Regulation 2D-CTAB/SDS-PAGE separierter Proteine ruhender und polyklonal stimulierter muriner CD4 + und CD4 + CD25 + T-Zellen Gesamtbetrachtung der Regulation muriner T-Zell Proteine Regulation von T-Zellproteinen die durch alternative Methoden bestätigt wurden Diskussion Methodische Problematik Besonderheiten der Proteinzusammensetzung zellulärer Kompartimente von CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen Proteininteraktionen zur Ausbildung der suppressiven Eigenschaft CD4 + CD25 + regulatorischer T-Zellen Zusammenfassung Literatur 136 Anhang 150 Abkürzungsverzeichnis 150 Monoisotopische und durchschnittliche Molekülgewichte der Aminosäuren 152 Veröffentlichungen und Präsentationen 153 Lebenslauf 154

10 Einleitung 1 1 Einleitung 1.1 Mechanismen der Immunabwehr Das Immunsystem der Mammalia ist ein komplexes Zusammenspiel von Zellen und Organen, die das Eindringen und die Vermehrung von Pathogenen verhindern (Janeway et al., 2002a). Die wichtigsten Pathogene sind Bakterien, Viren, Pilze sowie Parasiten, die ohne einen effektiven Abwehrmechanismus im Körper ideale Bedingungen vorfinden. Zur aktiven Bekämpfung dieser Pathogene verwendet das Immunsystem der Mammalia zwei verschiedene Strategien, die angeborene und die adaptive Immunabwehr. Mit angeborenen Immunantworten reagiert das Immunsystem direkt. Hierzu können humorale Faktoren an Pathogene binden, diese zerstören oder zur Eliminierung durch Phagozyten markieren. B-Zellen, Dendritische Zellen oder Makrophagen können durch Phagozytose und Pinozytose Pathogene aufnehmen, nach Verschmelzung von Endosomen mit Lysosomen proteolytisch verdauen und die Peptid-Antigene der Pathogene über MHC Klasse II Moleküle auf der Zelloberfläche präsentieren. Diese Zellen dienen dann als Antigen-präsentierende-Zellen (APZ), die bei Mammalia für die adaptive Immunantwort über T-Lymphozyten benötigt werden. Lymphozyten unterteilen sich in die beiden Hauptgruppen der B-Lymphozyten (B-Zellen) und T- Lymphozyten (T-Zellen). B-Zellen die durch Pathogene aktiviert werden, differenzieren zu Plasmazellen, die Antikörper sezernieren sowie zur weiteren Antigenerkennung Antikörper in der Plasmamembran (PM) einlagern. T-Zellen unterteilen sich in zwei Klassen die anhand bestimmter für den Aktivierungsprozess essenzieller Proteine der Plasmamembran unterschieden werden. Hierzu gehören Zellen die das Oberflächenmolekül CD4 exprimieren und als CD4 + T- Zellen bezeichnet werden, sowie CD8 exprimierende Zellen die als CD8 + T-Zellen bezeichnet werden. Für den Aktivierungsprozess werden CD4 + T-Zellen über Antigen-beladene MHC Klasse II Moleküle der APZ stimuliert. Hierbei bindet der T-Zell-Rezeptor (TZR) an den Antigen-MHC-Komplex, wobei ebenfalls das Oberflächenprotein CD4 an das MHC-Molekül binden muss, um den Klasse II Typ zu erkennen. Im Gegensatz hierzu erkennt die zweite Klasse der T-Zellen, die CD8 + T-Zellen, über den TZR-CD8-Komplex Antigene, die über MHC Klasse I Moleküle in Virus infizierten oder karzinogenen Zellen präsentiert werden. Aktivierte CD8 + T-Zellen differenzieren in zytotoxische T-Lymphozyten, die in

11 Einleitung 2 einem inflammatorischen Abwehrprozess Zellen lysieren. Die Funktion aktivierter CD4 + T-Zellen ist hingegen die Steuerung der Immunantwort über Zytokine, lösliche Peptide mit regulatorischen bzw. effektorischen Eigenschaften. Diese Zellen werden auch als T-Helfer (Th) Zellen bezeichnet, wobei sie sich je nach Wirkung der sezernierten Zytokine in Th1- und Th2-Zellen unterscheiden lassen. Th1-Zellen produzieren vorwiegend Zytokine, die eine zytotoxische und inflammatorische Immunantwort auslösen, wie z.b. Interleukin-2 (IL-2), IL-12, Interferon-γ (IFN-γ) und den Tumornekrosefaktor-β (TNF-β). Die Zytokine der Th2- Zellen (IL-4, IL-5, IL-6, IL-9 und IL-10) bewirken hauptsächlich eine B-Zellen vermittelte Immunantwort und können z.b. über IgE-Antikörper-aktivierte eosinophile Granulozyten bei der Abwehr parasitischer Würmer mitwirken (Janeway et al., 2002a; Janeway et al., 2002b). Diese Antikörper können aber auch zur Bildung von Allergien beitragen, wie z.b. allergischem Bronchialasthma, Heuschnupfen und atopischer Dermatitis. Bei der Ausbildung von Allergien reagiert das Immunsystem übermäßig auf harmlose Antigene. Hierbei ist die immunologische Toleranz gegenüber nicht pathogenen körperfremden Antigenen beeinträchtigt. Eine gestörte immunologische Toleranz kann aber auch lebensbedrohliche Ausmaße annehmen. Dies wenn eine Immunreaktion gegen körpereigene Antigene nicht unterdrückt wird, woraus Autoimmunerkrankungen mit gravierenden Organschädigungen hervorgehen können. 1.2 Mechanismen der immunologischen Toleranz Um die mannigfaltigen Antigenstrukturen potenzieller Pathogene zu erkennen, steht dem Immunsystem ein TZR Repertoire mit ungefähr 25 x 10 6 verschiedenen Spezifitäten zur Verfügung, von denen jede potenziell mehrere ähnliche Antigen- MHC-Komplexe erkennen kann (Mason, 1998; Arstila et al., 1999). Diese große Vielfalt der Antigenerkennung birgt allerdings die Gefahr, dass auch körpereigene Proteine erkannt werden, wodurch die Ausbildung von Autoimmunerkrankungen möglich ist. Um Autoimmunkrankheiten zu vermeiden, sind verschiedene Mechanismen der immunologischen Toleranz notwendig. Hierzu gehören die zentrale und die periphere Toleranz. Ein wichtiger Mechanismus der zentralen Toleranz ist die Erkennung von körpereigenen Strukturen. Pluripotente Zellen des Knochenmarks differenzieren

12 Einleitung 3 im Thymus zu CD4 + sowie CD8 + T-Zellen aus. In diesem Organ unterliegen die Zellen zwei wichtigen Selektionsmechanismen. Vorwiegend im Kortex des Thymus findet eine positive Selektion statt, bei der T-Zellen körpereigene MHC- Moleküle mit ihrem TZR erkennen müssen. Vorwiegend in der Medula des Thymus findet des Weiteren eine negative Selektion statt, bei der über 98 % der T-Zellen depletiert und über Apoptose (programmierter Zelltod) eliminiert werden. Hierzu werden von den Thymusepithelzellen Peptide körpereigener Proteine über MHC-Moleküle präsentiert und T-Zellen, die eine hohe Affinität für diese Proteine aufweisen, depletiert (Doffinger et al., 1997; Kojima et al., 1997; Smith et al., 1997; Hanahan, 1998; Klein et al., 1998; Derbinski et al., 2001). Bei dieser Selektion führen hohe Affinitäten gegen das Autoantigen sehr wahrscheinlich zur Depletion, geringe Affinitäten hingegen nicht, wodurch potenzielle Effektor T-Zellen den Thymus verlassen können (Jameson & Bavan, 1998; Utting et al., 1998; Mariathasan et al., 2000; Stefanski et al., 2001). Des Weiteren werden im Thymus nicht alle Autoantigene präsentiert, denen T-Zellen in der Körperperipherie begegnen können. Neben dem Selektionsmechanismus im Thymus, der ein wichtiger Bestandteil der zentralen Toleranz ist, benötigt das Immunsystem daher zusätzlich Mechanismen zur Ausbildung einer peripheren Toleranz. Für die periphere Toleranz sind Ignoranz, Anergie, AICD (activation induced cell death) und die Suppression der Immunantwort durch regulatorische T-Zellen wichtige Mechanismen. Werden Autoantigene an immunpriviligierten Stellen wie Auge, Plazenta und Hoden präsentiert oder kommen in Organen mit nicht beeinträchtigter Immunabwehr in zu geringer Anzahl vor, können T-Zellen nicht ausreichend stimuliert werden. Dieses Verhalten wird als Ignoranz bezeichnet. Bei der Anergie hingegen führt die Erkennung von Autoantigenen zur funktionellen Inaktivierung von T-Zellen. Wichtig ist hierbei, dass die T-Zellen nur über den TZR und nicht zusätzlich über kostimulierende Zelloberflächenproteine wie CD28 stimuliert werden (Jenkins & Schwartz, 1987; Schwartz, 2003). Für eine produktive Aktivierung benötigen T-Zellen einen Kostimulus. CD28 erkennt hierbei B7-1 (CD80) und B7-2 (CD86) bei der Interaktion mit APZ. Wird diese Interaktion in Kombination mit dem TZR durchgeführt, der an Antigen-MHC Klasse II- Komplexe bindet, erfolgt eine produktive Aktivierung der T-Zellen, die durch eine starke Proliferation und Produktion von Zytokinen gekennzeichnet ist. Ein in

13 Einleitung 4 diesem Zusammenhang wichtiges Zytokin ist der T-Zell-Wachstumsfaktor IL-2. Bei T-Zellen kann die Kostimulation über CD80/CD86 der APZ aber auch zur Anergie führen. Dies allerdings dann, wenn nicht CD28 sondern CTLA-4 (cytotoxic T- Lymphocyte-associated antigen-4) der Bindungspartner auf Seite der T-Zellen ist (Krummel & Allison, 1995; Walunas et al., 1996; Perez et al., 1997; Walunas & Bluestone, 1998). Auf anergisierten T-Zellen wurde zudem PD-1 (programmed cell death-1) gefunden, das mit den Liganden PDL1/2 interagiert. Wie bei CTLA-4 defizienten Mäuse bildeten sich auch bei PD-1 defizienten Mäusen autoimmune Erkrankungen aus (Tivol et al., 1995; Waterhouse et al., 1995; Lechner et al., 2001; Nishimura et al., 2001). In diesem Zusammenhang resultiert die Interaktion zwischen PD-1 und PDL1/2 in einem anergen Phänotyp der entweder im Zellzyklusarrest oder in einer gestörten Zytokinproduktion resultiert (Freeman et al., 2000; Latchman et al., 2001). Periphere Toleranz kann auch über die Induktion von AICD in autoreaktiven T- Zellen vermittelt werden. Hierzu ist die Bindung von Fas (CD95) auf der T-Zelle mit dem Liganden FasL (CD95L) auf der APZ von Bedeutung (Watanabe- Fukunaga et al., 1992; Suda et al., 1993). Über Fas werden intrazellulär Caspasen zur Proteindegradation aktiviert, die wiederum DNA-spaltende DNAsen aktivieren, wodurch die Zellen absterben (Janeway et al., 2002c). Als letzten Mechanismus der peripheren Toleranz wird im Folgenden näher auf die Suppression der Immunantwort durch regulatorische T-Zellen eingegangen, da sie eine wichtige Funktion bei diesem Prozess haben und Gegenstand der Untersuchungen der vorliegenden Arbeit sind. Zum besseren Verständnis wird im Folgenden näher auf die Entdeckung regulatorischer T-Zellen eingegangen. Bereits 1969 konnte durch Thymektomie an Mäusen drei Tage nach der Geburt die Ausbildung von Autoimmunerkrankungen nachgewiesen werden (Nishizuka et al. 1969). Diese bildeten sich nicht aus, wenn bis spätestens zwei Wochen nach dem Eingriff Milzzellen oder Thymozyten adulter Mäuse in diese Tiere transferiert wurden. Hiermit war zum ersten Mal eine vom Thymus abhängige Ausbildung von Autoimmunkrankheiten belegt worden. Bereits ein Jahr später wurden Suppressor T-Zellen beschrieben, die in der Lage waren, neben T-Zellen auch B-Zellen und APZ in ihrer Aktivierung zu supprimieren (Gershon & Kondo 1970, 1971). Erst über 20 Jahre später führten Untersuchungen von Sakaguchi und Koautoren

14 Einleitung 5 (1995) diese Eigenschaft auf CD4 + T-Zellen zurück, die im naiven Zustand die α- Kette des Interleukin-2 Rezeptors (CD25) auf der Zelloberfläche tragen. Diese Subpopulation der CD4 + T-Zellen wird seither als CD4 + CD25 + regulatorische T- Zellen bezeichnet. Bei einer Wiederholung der 1969 von Nishizuka und Koautoren durchgeführten Experimente reichte allein der Transfer von CD4 + CD25 + T-Zellen adulter Mäuse zur Vermeidung schwerer Autoimmunkrankheiten bei thymektomierten Mäusen aus (Asano et al., 1996). Neben diesem Experiment weisen auch weitere Veröffentlichungen darauf hin, dass CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen im Thymus gebildet werden (Itoh et al., 1999; Seddon & Mason, 2000; Besinger et al., 2001; Shevach, 2002). Nach bisherigen Kenntnissen ist es sehr wahrscheinlich, dass regulatorische T-Zellen mit intermediärer Affinität und Avidität für körpereigene Peptide - im Gegensatz zu konventionellen CD4 + T- Zellen - im Thymus nicht depletiert werden. Diese Hypothese beruht auf Untersuchungen an Mäusen, die einen transgenen TZR exprimieren, der MHC Klasse II assoziierte Autoantigene erkennt (Jordan et al., 2001; Kawahata et al., 2002). Nach diesen Untersuchungen war zwar ein großer Anteil von T-Zell- Vorläuferzellen negativ selektiert worden, der Anteil CD4 + CD25 + regulatorische T- Zellen erhöhte sich allerdings stark. Diese Befunde verdeutlichen, dass der Mechanismus der negativen Selektion im Thymus nicht auf alle T- Zellpopulationen gleichermaßen übertragbar ist. Demnach können im Gegensatz zu konventionellen CD4 + T-Zellen die CD4 + CD25 + regulatorischen T-Zellen mit intermediären Affinitäten zu Autoantigenen diesem Selektionsmechanismus entgehen. Dieser Umstand bietet dem Immunsystem die Möglichkeit, in der Körperperipherie auftretende Autoimmunreaktion zu erkennen und zu verhindern. Aus dem Thymus entlassen, haben CD4 + CD25 + T-Zellen einen Anteil von 5-10 % der Gesamtpopulation peripherer CD4 + T-Zellen. 1.3 Subtypen regulatorischer T-Zellen Bisher wird zwischen zwei gut charakterisierten Subtypen regulatorischer T-Zellen unterschieden. Den im Thymus differenzierten CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen und den regulatorischen T-Zellen, die in der Peripherie durch Induktion von CD4 + T-Zellen entstehen. Diese beiden Zelltypen unterscheiden sich darin, welche Mechanismen zur Suppression verwendet werden. Die im Thymus differenzierten

15 Einleitung 6 regulatorischen T-Zellen sind nicht in der Lage, nach einem TZR-Stimulus zu proliferieren oder Zytokine zu sezernieren (Shevach, 2002). D.h. zur effektiven Suppression ist bei diesem Zelltyp ein direkter Zellkontakt mit der Zielzelle notwendig (Takahashi et al., 1998; Thornton & Shevach, 1998). Beim zweiten Subtyp regulatorischer T-Zellen, der durch Induktion der CD4 + T-Zellen in der Peripherie entsteht, ist der Mechanismus der Suppression nicht abhängig vom Zellkontakt, sondern von der Sekretion löslicher Faktoren. Bei diesem Zelltyp sind zwei Populationen zu unterscheiden: die Tr1-Zellen und die Th3-Zellen. Tr1-Zellen produzieren vorwiegend das Zytokin IL-10 und Th3-Zellen als weiteres immunsuppressives Zytokin das TGF-β, wobei IL-10 und TGF-β ebenfalls die Differenzierung in Tr1- und Th3-Zellen induzieren können (Groux et al., 1997; Inobe et al., 1998; Roncarolo et al., 2001; Weiner, 2001; Chen et al., 2003). Weiterhin kann eine Induktion von Tr1- und Th3-Zellen durch eine Zellkontaktabhängige Interaktion mit zwei Varianten im Thymus differenzierter CD4 + CD25 + regulatorischer T- Zellen erfolgen. So induzierten aus dem Thymus stammende Integrin α 4 β 7 positive humane regulatorische T-Zellen Zellen des Tr1-Typs und eine α 4 β + 1 Variante Zellen des Th3-Typs (Stassen et al., 2004). Zellkontaktabhängige Suppressionsprozesse können somit gezielt durch die Bildung bestimmter in der Körperperipherie induzierter Subtypen regulatorischer T-Zellen und der damit verbundenen Ausschüttung immunsuppressiver Zytokine gesteigert werden (Abb. 1).

16 Einleitung 7 Abb. 1: Eigenschaften regulatorischer CD4 + CD25 + T-Zellen. Im Thymus differenzieren T-Zellen in konventionelle CD4 + und regulatorische CD4 + CD25 + T-Zellen. Durch Stimulation in der Körperperipherie proliferieren CD4 + T-Zellen im Gegensatz zu CD4 + CD25 + T-Zellen stark. Die Proliferation aktivierter CD4 + T-Zellen kann durch den Zellkontakt mit CD4 + CD25 + T-Zellen supprimiert werden. Zusätzlich können durch diesen Zellkontakt-abhängigen Prozess CD4 + T- Zellen in IL-10 produzierende Tr1-Zellen bzw. hauptsächlich TGF-β produzierende Th3-Zellen transformiert werden. Diese induzierten Zelltypen können wie die im Thymus differenzierten regulatorischen T-Zellen FoxP3 exprimieren, entfalten aber ihre immunsuppressive Wirkung über die Zytokine IL-10 und TGF-β. Die Unterscheidung der im Thymus differenzierten regulatorischen T-Zellen mit denen aus der Körperperipherie ist über Zelltyp-spezifische Markerproteine alleine nur unzureichend möglich. Beide tragen auf ihrer Zelloberfläche die Proteine CD4, CD25 und CTLA-4. Auch der Zellkern-lokalisierte Transkriptionsfaktor FoxP3, das wichtigste Markerprotein regulatorischer T-Zellen, wurde teilweise bei den in der Peripherie induzierten Zellen gefunden. Im Thymus differenzierte regulatorische T- Zellen können mit Antikörpern isoliert werden, die CD25 erkennen. Allerdings dürfen die Versuchstiere zuvor nicht immunisiert worden sein, da CD25 nach der Aktivierung ebenfalls von CD4 + T-Zellen exprimiert wird. Funktionale Tests sind zur Charakterisierung der Zellisolate notwendig. Hierzu werden neben Untersuchungen zur suppressiven Eigenschaft der T-Zellen ebenfalls Proliferations-

17 Einleitung 8 Assays angewandt, da regulatorische T-Zellen des Thymus nach in vitro Aktivierung nicht proliferieren. 1.4 Mechanismen der Suppression von CD4 + T-Zellen durch CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen Da in der vorliegenden Arbeit regulatorische T-Zellen untersucht wurden, die sich im Thymus differenzierten, beziehen sich die weiteren Erläuterungen nur auf diesen Zelltyp, der im Folgenden auch als Treg bezeichnet wird. Der zentrale Mechanismus der Tregs ist abhängig vom Zellkontakt, der die Fähigkeit zur Proliferation und Zytokinproduktion aktivierter CD4 + sowie CD8 + T-Zellen supprimiert (Thornton & Shevach, 2000; Piccirillo & Shevach, 2001). Die genauen Mechanismen der Suppression sind derzeit allerdings nur unzureichend verstanden. Als ein wesentlicher Prozess wird die Inhibierung der IL-2 Expression und der daraus resultierende anerge Phänotyp der CD4 + T-Zellen angesehen (Thornton & Shevach, 1998). Des Weiteren ist die Suppression konventioneller CD4 + T-Zellen von verschiedenen kostimulatorischen Molekülen abhängig, wie z.b. CD28 und GITR (glucocorticoid-induced TNF receptor), die nach erneuter Stimulation zur Aufhebung der Suppression dienen können (Thornton & Shevach, 1998; Ji et al., 2004; Stephens et al., 2004; Zheng et al., 2004). An diese Aufhebung ist wiederum eine gesteigerte IL-2 Produktion und eine vermutlich damit einhergehende Proliferation konventioneller T-Zellen geknüpft. Zum besseren Verständnis der suppressiven Eigenschaften sind besonders Unterschiede zwischen CD4 + T-Zellen und Tregs wichtig, die sich auf die bei der Zellinteraktion notwendigen Zelloberflächenproteine beziehen. In diesem Zusammenhang wurde ein gutes Dutzend Proteine bei regulatorischen T-Zellen gefunden, allerdings waren dies alles keine Treg-spezifischen Proteine, da sie auch in bestimmten Aktivierungs- bzw. Differenzierungsstadien konventioneller CD4 + T-Zellen zu finden sind. Bisher ist nur FoxP3 (scurfin) aus der Familie der Forkhead/winged-helix Transkriptionsfaktoren als spezifisches Protein regulatorischer CD4 + CD25 + T-Zellen beschrieben. Dieses Protein ist essenziell für die suppressiven Eigenschaften von Treg. So bilden FoxP3 defiziente scurfy- Mäuse schwere Autoimmunerkrankungen aus, die Tage nach der Geburt zum Tod der Mäuse führen (Brunkow et al., 2001). Die FoxP3 Defizienz beim

18 Einleitung 9 Menschen führt unbehandelt ebenfalls zum raschen Tod Neugeborener und wird als IPEX-Syndrom (immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X- linked syndrome) bezeichnet (Wildin et al., 2002). CD4 + T-Zellen aus scurfy- Mäusen weisen eine Hyperresponsivität gegenüber einem TZR-Stimulus auf, der CD28-unabhängig sein kann und eine starke Proliferation dieser Zellen bewirkt (Clark et al., 1999). Damit einhergehend wurde eine gesteigerte Produktion von Th1- und Th2-Zytokinen festgestellt, die sich entscheidend auf den Krankheitsverlauf auswirken könnte (Blair et al., 1994). Aktuelle Untersuchungen belegen einen direkten Zusammenhang zwischen FoxP3 und der Differenzierung CD4 + CD25 + regulatorischer T-Zellen. So erfolgte in vitro und in vivo durch Transduktion der CD4 + T-Zellen mit FoxP3 die Differenzierung zu CD4 + CD25 + T- Zellen mit anergem Phänotyp und regulatorischen Eigenschaften (Fontenot et al., 2003; Hori et al., 2003; Khattri et al., 2003). Die suppressiven Eigenschaften und die damit verknüpfte Rolle von Tregs auf die Regulation von Immunantworten ist derzeit gut beschrieben. Welche molekularen Interaktionen regulatorische T-Zellen dafür benötigen, ist derzeit hingegen nur unzureichend erforscht. Dies gilt im Besonderen für die an der Zellinteraktion beteiligten Proteine der Zelloberflächemembran. Mit Proteom- Studien kann eine Vielzahl der von den Zellen unterschiedlich regulierten Proteine identifiziert werden, wodurch die funktionellen Mechanismen dieser T- Zellpopulation besser verstanden werden können. 1.5 Proteom-Studien zur differenziellen Analyse von Proteinen Grundlegende Methoden differenzieller Proteom-Studien werden im Folgenden zum Verständnis der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Techniken näher erläutert. Als Äquivalent zum Begriff Genom wurde Mitte der 90er Jahre erstmals der Begriff Proteom geprägt (Wilkins et al., 1996). Mit dem Proteom wird die Gesamtheit aller Proteine in einem Lebewesen, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment unter exakt definierten Bedingungen und zu einem bestimmten Zeitpunkt bezeichnet. Im Gegensatz zum statischen Genom verhält sich das Proteom sehr flexibel auf Veränderungen der inneren und äußeren Bedingungen. Durch solche Veränderungen wie einer Stimulation von T-Zellen können z.b. Gene den Anforderungen entsprechend aktiviert bzw. deaktiviert

19 Einleitung 10 werden und/oder bereits gebildete Proteine durch Modifikationen eine veränderte funktionelle Rolle übernehmen. Als häufigste posttranslationale Modifizierungen sind Phosphorylierungen, Glykosylierungen oder Acetylierungen zu nennen, die zusammen mit dem alternativen Spleißen von mrna oder proteolytischer Entfernung von Signalpeptiden die hohe Komplexität des Proteoms widerspiegeln. Die Proteom-Analyse setzt sich aus mehreren Arbeitsschritten zusammen. Hierzu gehört eine gut reproduzierbare Probenvorbereitung, bei der Proteine angereichert und solubilisiert werden. Dem schließt sich eine Auftrennung der Proteine mittels gelelektrophoretischer oder chromatographischer Methoden an, wobei eine Kombination beider Techniken möglich ist. Um die Effizienz der Proteinauftrennung zu erhöhen werden i.d.r. mindestens zwei Dimensionen verwendet wie z.b. die Auftrennung über Ionenaustausch-Chromatographie in der ersten Dimension gefolgt von einer Umkehrphasen-Chromatographie (reversed phase LC) in der zweiten Dimension. Wegen ihrer guten Reproduzierbarkeit und relativ kurzen Analysedauer werden für differenzielle Proteom-Analysen allerdings meist gelelektrophoretische Methoden angewandt. Diese erlauben die Analyse von Vergleichsproben aus mehreren Replikaten, wodurch statistisch signifikante Unterschiede ermittelt und die Proteine mittels Massenspektrometrie anschließend identifiziert werden können Mehrdimensionale gelelektrophoretische Methoden zur Proteinauftrennung Am Beginn einer Proteom-Studie können verschiedene Methoden zur Auftrennung von Proteinen eingesetzt werden, um Proteine zu ermitteln, die durch Veränderung bestimmter Parameter eine andere Regulation aufweisen. Für diese differenziellen Proteom-Analysen werden meist zunächst komplexe Proteingemische aufgetrennt, um im Idealfall die Quantität einzelner Proteine zu bestimmen. Neben chromatographischen Methoden werden hierzu häufig auf zweidimensionale Gelelektrophoresen basierende Techniken verwendet. Die am häufigsten angewandte gelelektrophoretische Methode für solche differenziellen Analysen ist die 2D-IEF/SDS-PAGE bei der Proteine in einer ersten Dimension (isoelektrische Fokussierung (IEF)) anhand ihres isoelektrischen Punktes (pi) aufgetrennt werden. Bei der IEF werden Proteine bei angelegtem Gleichstrom

20 Einleitung 11 separiert; dabei wird die Eigenladung eines Proteins in Abhängigkeit vom ph-wert des umgebenen Mediums genutzt. Bei der Wanderung eines Proteins in einem elektrischen Feld entlang eines ph-gradienten gelangt das Protein an seinen isoelektrischen Punkt und verliert seine Nettoladung. Deshalb wandert das Protein nicht mehr im elektrischen Feld weiter, sondern wird an diesem ph-punkt fokussiert. Diesem ersten Trennschritt folgt eine weitere Separation des Proteins relativ zum Molekulargewicht mittels SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid Gelelektrophorese) in der zweiten Dimension. Für die Auftrennung in der zweiten Dimension werden die Proteine mit SDS beladen. SDS ist ein anionisches Detergenz und überdeckt die Eigenladung von Proteinen. Hierbei bindet proportional zur Molekülgröße ca. die 1,4fache Masse SDS an Proteine. Die Separationseigenschaft der Proteine wird bei der SDS-PAGE neben dem Molekulargewicht durch die Acrylamidkonzentration und dem verwendeten Puffersystem bestimmt und resultiert in Separationsweiten, die ungefähr proportional zur Molekülgröße sind. Bei diesem Prozess werden bei angelegtem Gleichstrom kleine Proteine weniger stark am Durchtritt durch die Acrylamidvernetzung des Gels gehindert als große Proteine und demzufolge auch weiter von der Kathode entfernt separiert. Bei dieser 2D-IEF/SDS-PAGE kann grundsätzlich in zwei, in der ersten Dimension, abweichenden Varianten unterschieden werden, zum einen in der IEF mit einem immobilisierten ph- Gradienten, der über basische bzw. saure Acrylamidmonomere hergestellt wird (Görg et al., 1988), zum anderen mit der IEF unter Verwendung von Trägerampholinen, bei der sich der ph-gradient während der Auftrennung ausbildet (Klose et al., 1975; O Farrell, 1975). Die 2D-IEF/SDS-PAGE ist ein hochauflösendes Verfahren, mit dem bis zu Protein-Spots in einem Gel separiert werden können (Klose & Kobalz, 1995). In diesen Spots ist i.d.r. nur jeweils ein Protein aufgetrennt, wodurch sich diese Methode ideal für die quantitative Proteom-Analyse eignet. Allerdings ist diese gute Trennleistung der 2D-IEF/SDS-PAGE nicht allgemeingültig auf alle Proteine zu übertragen. Eine besondere Herausforderung stellen hydrophobe Proteine dar, die trotz optimierter Bedingungen nur in einem geringen Umfang dargestellt werden können (Chevallet et al., 1998; Rabilloud, 1998; Molloy, 2000; Santoni et al., 2000). Dies verdeutlichte ein Vergleich der 1D-

21 Einleitung 12 SDS-PAGE mit der 2D-IEF/SDS-PAGE von mikrosomalen Proteinen der Rattenleber, bei dem nur drei Membranproteine nach 2D-IEF/SDS-PAGE detektiert werden konnten, gegenüber 22 Membranproteinen, die nach 1D-SDS- PAGE identifiziert worden sind (Galeva & Alterman, 2002). Eindimensionale Auftrennungen nach der von Laemmli 1970 beschriebenen Methode der SDS- PAGE (1D-SDS-PAGE) haben allerdings den Nachteil, dass sie ein geringes Auflösungsvermögen haben. Nach Auftrennung komplexer Proteingemische werden daher aus einzelnen Proteinbanden meist mehrere Proteine identifiziert. Wodurch eine differenzielle Analyse mit der 1D-SDS-PAGE ungeeignet ist. Alternativ sind in der Literatur verschiedene gelelektrophoretische Methoden mit zweidimensionalen Auftrennungen beschrieben, die sich für die Darstellung von Membranproteinen eignen. So können Membranproteinkomplexe z.b. mithilfe von nichtionischen Detergenzien solubilisiert und in einer Kombination aus nativer Gelelektrophorese (Blue-nativ-PAGE) und Tricin SDS-PAGE aufgetrennt werden (Schägger & von Jakow, 1991). Des Weiteren ist die zweidimensionale Auftrennung hydrophober Proteine durch Kombination einer SDS-PAGE mit 6 M Harnstoff und einer SDS-PAGE ohne Harnstoff möglich (Rais et al., 2004). Bei diesen gelelektrophoretischen Methoden zur Auftrennung hydrophober Proteine fehlt allerdings der Beleg, dass sie sich für differenzielle Studien eignen. Als sinnvolle Alternative könnte eine weitere 2D-PAGE Methode dienen, bei der durch den Wechsel einer Auftrennung mit kationischen Detergenzien (z.b. Benzyldimethyl-n-hexadecylammoniumchlorid oder Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)) in der ersten Dimension und einer Auftrennung mit dem anionischen SDS in der zweiten Dimension hydrophobe Proteine auftrennt werden (Macfarlane, 1989; Hartinger et al., 1996; Navarre et al., 2002). Dieser kombinierte Einsatz kationischer und anionischer Detergenzien führt in der zweiten Dimension zu einer breit gefächerten diagonalen Auftrennung der Proteine Nachweis geringer Proteinmengen durch die satdige-methode Mit dem Computerprogramm Toppred 2.0 wurden anhand der offenen Leserahmen (ORFs, open reading frames) des Genoms von Eubakteria bis hin zu Eukaryoten % integrale Membranproteine prognostiziert (Wallin & Heijne, 1998). Trotz einer Vielzahl unterschiedlicher integraler Membranproteine ist ihre

22 Einleitung 13 Konzentration in der Zelle sehr gering. Bei der Untersuchung von z.b. hochreinen T-Zellpopulation wird die Detektion von Membranproteinen zusätzlich durch geringe Probenmengen erschwert. Neben einer effektiven Anreicherung von Membranproteinen müssen die differenziellen Analysen daher über sensitive Detektionsmechanismen verfügen. Die Detektion von Proteinen zur differenziellen Analyse erfolgt bei gelelektrophoretischen Analysen meist durch verschiedene Färbemethoden, z.b. kolloidale Coomassie-Färbung oder die sensitivere Silberfärbung (Neuhoff et al., 1988; Jungblut & Seifert, 1990). Die einzelnen Gele werden anschließend durch den Einsatz von Computerprogrammen zur Bildanalyse verglichen um differenziell exprimierte Proteine zu detektieren. Allerdings werden selbst für sensitive Silberfärbungen noch mindestens µg Gesamtprotein in zweidimensionalen Gelen benötigt (Banks et al., 1999; Craven et al., 2002), eine Menge, die bei bestimmten Fragestellungen nicht generiert werden kann. Um dieser Problematik zu begegnen wurde eine neue Methode entwickelt die satdige Technik (GE Healthcare, Uppsala, Schweden) - die eine Detektion von sehr geringen Proteinmengen nach gelelektrophoretischer Auftrennung erlaubt. Dabei werden die Proteine vor der Auftrennung an den Thiolgruppen der Cystein-Reste durch nukleophile Addition mit Maleimid-substituierten Fluorophoren markiert. Diese Methode erlaubt eine hochsensitive 2D-PAGE zur Detektion geringster Proteinmengen. So ist es beispielsweise möglich von Proteinmengen unter 10 µg, differenzielle 2D-IEF/SDS-PAGE Studien durchzuführen (Kondo et al., 2003; Sitek et al., 2005). Für die differenzielle Analyse können Cy TM 3 und Cy TM 5 Fluoreszenzfarbstoffe für Saturation-DIGE (fluorescence difference gel electrophoresis) Experimente eingesetzt werden. Hierbei wird ein Farbstoff für die Fluoreszenzmarkierung einer Probe und ein anderer Farbstoff für die Markierung eines Referenzgemisches (interner Proteinstandard) verwendet, wobei Probe und Proteinstandard nach Vereinigung in einem Gel aufgetrennt werden. Der Proteinstandard ist im optimalen Fall ein Gemisch aus den Zelllysaten aller innerhalb einer differenziellen Studie analysierten Proben. Da der interne Standard mit jeder Probe kosepariert wird und somit ortsgleich für jeden Protein-Spot der Probe ein Protein-Spot des Standards existiert, können diese Standard-Spots zur Normalisierung der Spot-Intensitäten der Proben verwendet werden. Diese

23 Einleitung 14 Strategie ermöglicht es, die Genauigkeit der ermittelten Regulationen zu erhöhen. Die beiden unterschiedlichen Fluoreszenzfarbtsoffe Cy TM 3 und Cy TM 5 besitzen unterschiedliche Extinktions- und Emissionswellenlängen und werden somit unabhängig voneinander mit einem Fluoreszenz-Scanner detektiert. Es entstehen nach dem Scan-Vorgang eines Gels demnach zwei Gelbilder. Jede einzelne Probe einer Studie wird mit dem internen Standard in einem Gel kosepariert und die einzelnen Gele werden mithilfe geeigneter Computerprogramme, die eine Spot-Erkennung, Spot-Quantifizierung und den Vergleich mit Daten anderer Gele erlauben, verglichen. So kann eine Bestimmung der Regulationen einzelner Proteine erfolgen. Neben hoher Sensitivität ist der dynamische Bereich, d.h. der Bereich, in dem die Detektion hoch-abundanter Proteine keine Sättigungen aufweist, bis hin zur Detektion niedrig- abundanter Proteine, bei der Fluoreszenzmarkierung sehr hoch. Bei 1D-SDS-PAGE aufgetrennten Markerproteinen liegt nach Markierung mit dem Cy TM 5 Fluorophor ein dynamischer Bereich von bis zu 1:10 4 bei der Detektion unterschiedlicher Proteinmengen vor, bei Silberfärbungen war er hingegen nur bei 1:10 2 (Shaw et al. 2003). Nach der differenziellen Analyse der Gelbilder schließt sich die Identifizierung der unterschiedlich exprimierten Proteine an Massenspektrometrische Methoden zur Identifikation von Proteinen Die Massenspektrometrie zur Proteinidentifizierung löst immer mehr die älteren Verfahren, wie den Edman-Abbau zur Bestimmung von N-terminalen Aminosäuresequenzen einzelner Peptide ab. Die Vorteile der Massenspektrometrie sind die relativ kurzen Analysezeiten, eine bis in den attomol Bereich reichende hohe Empfindlichkeit und die Möglichkeit zur automatisierten Durchführung der Experimente. Zur Erhöhung des Informationsgehaltes werden hierzu i.d.r. vor der Messung Proteine durch spezifische Endoproteasen gespalten. Hierzu wird meist die Serinprotease Trypsin eingesetzt, die spezifisch Peptidbindungen an den Carboxyl-Gruppen von Arginin und Lysin spaltet. Für die massenspektrometrische Messung werden die generierten Peptide ionisiert. Hierzu haben sich in der Protein- und Peptidanalytik zwei unterschiedliche Verfahren durchgesetzt, die als MALDI-MS bezeichnete Matrixunterstützte Laser-Desorptions/-Ionisations Massenspektrometrie (Karas &

24 Einleitung 15 Hillenkamp, 1988; Karas et al., 2000) und die als ESI-MS bezeichnete Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (Fenn et al., 1989). Als Massenanalysatoren können sowohl bei dem ESI als auch bei dem MALDI Ionisierungsprinzip verschiedene Instrumente verwendet werden, wie z.b. Ionenfallen, TOF-Analysatoren sowie Triple-Quadrupol- und Fourier-Transform Ionen Cyclotron (FTICR)-Instrumente. Zur Analyse mittels MALDI-MS werden Analytmoleküle mit einer geeigneten Matrix kokristallisiert. Für die Analyse von Peptiden wird hierzu z.b. alpha-cyano- 4-hydroxizimtsäure verwendet und über das Laser-Licht eines 337 nm Stickstofflasers angeregt. Die Laser-Energie wird dabei auf die Matrixmoleküle übertragen, was zu einem Übergang von Matrix- und Analytmolekülen in die Gasphase führt. In der Gasphase werden die Analytmoleküle vermutlich bei Interaktionen mit den Matrixmolekülen durch Protonen- und Elektronentransferprozesse ionisiert (Knochenmuss & Zenobi, 2003). In Verbindung mit z.b. TOF (time of flight)- Massenanalysatoren haben MALDI-TOF Massenspektrometer eine sehr hohe Messgenauigkeit, mit der es möglich ist, Proteine allein über die Massen der Peptid-Ionen zu identifizieren (PMF, Peptidmassenfingerprints). Zusätzlich können aber auch die durch spontanen Zerfall entstehenden Fragment-Ionenmassen einzelner Peptide für die Identifizierung verwendet werden (Eckerskorn, 1998). Neben der Masse des Peptid- Ions geben dessen Fragment-Ionen Aufschluss über die Aminosäuresequenz, wodurch der Informationsgehalt für die Proteinidentifikation zunimmt. Für den ESI-Ionisierungsprozess wird zwischen der Kapillare der ESI-Quelle und dem Massenspektrometer eine Spannung von mehreren kv angelegt. Die aus der Kapillare austretende Flüssigkeit verdampft, wodurch die Ladungsdichte in den Flüssigkeitstropfen zunimmt. Dies führt vermutlich zum explosionsartigen Zerfall in viele kleine Tropfen, aus denen letztendlich desolvatisierte Analytmoleküle hervorgehen, die eine Ladung tragen (Eckerskorn, 1998). Bei dem ESI- Ionisierungsprozess liegen die Analytmoleküle in gelöster Form vor, wodurch sich diese Methode gut für eine direkte Kopplung an eine Flüssigkeitschromatographie eignet (Linscheid, 1990). Dies ermöglicht die Auftrennung komplexer Gemische vor der eigentlichen massenspektrometrischen Analyse z.b. mittels HPLC (high-performance liquid chromatography). Durch eine

25 Einleitung 16 weit reichende Miniaturisierung der HPLC-Anlagen in den letzten Jahren kann die Detektion von Proteinmengen bis in den unteren femtomol Bereich erfolgen (Wilm et al., 1996). Differenzielle Proteom-Studien, in denen die Regulationen der in Membranen lokalisierten Proteine untersucht werden, können prinzipiell mit beiden beschriebenen Ionisationsmethoden und unterschiedlichen Massenanalysatoren durchgeführt werden. Problematisch kann allerdings die Generierung von Peptiden sein, da besonders hydrophobe integrale Bereiche der Membranproteine für den enzymatischen Verdau schlecht zugänglich sind. In den kleinen hydrophilen Sequenzabschnitten von Multitransmembranproteinen kann ein Mangel an geeigneten Schnittstellen zudem die Verwendung von Proteasen mit unterschiedlichen Spezifitäten erforderlich machen. Die Untersuchung hydrophober Proteine ist - angefangen bei der Solubilisierung, über die Auftrennung, bis hin zur Identifikation - mit anspruchsvollen Problemen behaftet, die besonders bei der differenziellen Charakterisierung eines Membran-Proteoms bisher nur unzureichend gelöst wurden.

26 Zielsetzung der Arbeit 17 2 Zielsetzung der Arbeit Die suppressiven Eigenschaften regulatorischer CD4 + CD25 + T-Zellen und die damit verbundene immunologische Relevanz machen diesen Zelltyp zu einem wichtigen Kandidaten für klinische Therapien. Besonders bei der Vermeidung von Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßungen und der Bekämpfung von Tumorzellen könnte dieser Zelltyp durch gezielte Aktivierung bzw. Deaktivierung oder Depletion in künftigen Therapieformen eine entscheidende Rolle spielen. Die funktionellen Eigenschaften von CD4 + CD25 + T-Zellen sind derzeit gut charakterisiert. Der vom Zellkontakt abhängige Suppressionsmechanismus, der vermutlich über Zelloberflächenproteine vermittelt wird, ist allerdings weitgehend unverstanden. Ebenso sind die Merkmale dieser Zellen auf molekularer Ebene und besonders für Membranproteine bisher nur in Ansätzen beschrieben. In der vorliegenden Arbeit sollte daher das Membran-Proteom CD4 + CD25 + regulatorischer T-Zellen durch den Vergleich mit dem T-Zellsubtyp der konventionellen CD4 + T-Zellen charakterisiert werden, wobei von beiden Zelltypen ruhende und die durch Stimulation funktionell aktivierten Zustände untersucht wurden. Da für den Anspruch einer differenziellen Analyse hydrophober Membranproteine, die noch dazu aus geringen Mengen hochreiner Zellisolate gewonnen wurden, keine Techniken bekannt waren, war die Entwicklung neuer hocheffizienter und sensitiver Methoden notwendig. Die Identifizierung der differenziellen Proteine erfolgte mit Hilfe moderner massenspektrometrischer Methoden (MALDI- TOF/TOF-MS und ESI-MS/MS). Des Weiteren sollte eine Validierung der erhaltenen Ergebnisse z.b. mittels Immundetektion sowie quantitativer PCR erfolgen.

27 Material und Methoden 18 3 Material und Methoden 3.1 Material Chemikalien Lösungsmittel und Kits Absolute SYBR Green Fluorescein Abgen, Hamburg AccQ Tag Eluent A Waters, Eschborn Acetonitril (HPLC Grade) Merck, Darmstadt Aceton Riedel-de Haën, Seelze Acrylamid (Pulver) Biorad, München Acrylamidlösungen: 30 % AA, 37,5:1 Applichem, Gatersleben 30 % AA; 0,4 % BA. Serva, Heidelberg Agarose (Low Melt) Merck, Darmstadt Ameisensäure ( %) Merck, Darmstadt Ammoniumdihydrogencarbonat Sigma, Steinheim Ammoniumdihydrogenphosphat Fluka, Buchs (Schweiz) Ammoniumpersulfat Biorad, München Ammoniumsulfat J.T. Baker, Deventer (Niederlande) Antikörper: Anti-ATP-Synthase α (51) BD Biosciences, Heidelberg Anti-CD4 (H129.19) Pharmingen, Heidelberg Anti-CD25 (M-19) Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg Anti-CD25 (7D4bio) Pharmingen, Heidelberg Anti-CD45 (MEM-28) Immuno-Tools, Friesoythe Anti-goat IgG-Alkalische Sigma, Steinheim Phosphatase Konjugat Anti-ICAM-1 (G-5) Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg Anti-LPAP (17A5) Acris, Hiddenhausen Anti-mEH (H-300) Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg Anti-mEH (K-16) Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg Anti-mouse IgG-Alkalische Sigma, Steinheim Phosphatase Konjugat Anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488 Invitrogen, Karlsruhe Konjugat

28 Material und Methoden 19 Anti-PE Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach Anti-rabbit IgG-Alkalische Sigma, Steinheim Phosphatase Konjugat Anti-Rap1 (3) BD Biosciences, Heidelberg ASB-14-4 (Amidosulfobetain) Merck, Darmstadt Ascorbinsäure J.T. Baker, Deventer (Niederlande) BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- Sigma, Steinheim phosphat) Biotinderivat (EZ-Link TM Peribo Science, Bonn Sulfo-NHS-LC-Biotin) Bromphenolblau Riedel-de Haën, Seelze BSA (Bovines Serum Albumin) Biorad, München Butanol Merck, Darmstadt CHAPS (3-((3-Cholamidoproplyl)- Applichem, Gatersleben dimethylammonio)-1-propan-sulfonat) Complete EDTA free, Protease Roche, Mannheim Inhibitor Cocktail Coomassie BB G-250 Fluka, Buchs (Schweiz) CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid), Sigma, Steinheim Cy TM 3 und Cy TM 5 Fluor Saturation Dye, GE Healthcare, Freiburg α-cyano-4-hydroxyzimtsäure Sigma, Steinheim DMF (Dimethylformamid) Aldrich, Steinheim Derivatisierungsreagenz AccQ Fluor Waters, Eschborn dntp (2 -Desoxynukleosid-5 - Invitrogen, Karlsruhe Triphosphat) DTT (Dithiotreitol) Biorad, München EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) Merck, Darmstadt Eisen-(II)-sulfat-7-hydrat Riedel-de Haën, Seelze Essigsäure Merck, Darmstadt Ethanol (technisch) Chemikalienlager, Ruhr Univ. Bochum EZ TM -Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Perbio Science, Bonn Formaldehyd Merck, Darmstadt

29 Material und Methoden 20 FBS (Fötales Bovines Serum) Biochrom, Berlin Charge 730G Glu-C (sequencing grade) Roche Diagnostics, Mannheim Glycin Serva, Heidelberg Harnstoff Biorad, München HCl (TRIZMA Hydrochlorid) Sigma, Steinheim Hexanukleotide p(dn6) Roche, Mannheim Iodixanol (Optiprep von Axis-Shield) Progen Biotechnik, Heidelberg Kaliumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt Kaliumhexacyanoferrat Riedel-de Haën, Seelze L-Glutamin Invitrogen, Karlsruhe Methanol Roth, Karlsruhe Mischbettionentauscher (Serdolit MB-3) Serva, Heidelberg NBT (Nitroblue Tetrazoliumchlorid) Biomol, Hamburg Natriumacetat J.T. Baker, Deventer (Niederlande) Natriumcarbonat J.T. Baker, Deventer (Niederlande) Natriumdihydrogenphosphat-1-hydrat Applichem, Gatersleben Natriumdodecylsulfat (SDS) Serva, Heidelberg Natriumpyruvat-Lösung MEM (100 mm) Invitrogen, Karlsruhe Natriumthiosulfat J.T. Baker, Deventer (Niederlande) Neutravidin Horse Raddish Peroxidase Peribo Science, Bonn N, N -Methylenbisacrylamid Fluka, Buchs (Schweiz) Oligo(dT)n (100ng/ml) Roche, Mannheim PBS (Phosphate Buffered Saline ph 7,4) Invitrogen, Karlsruhe Penicillin / Streptomycin Lösung Invitrogen, Karlsruhe Peptidstandard: Bradykinin 1-7 (C 35 H 52 N 10 O 9 ) Sigma, Steinheim Angiotensin I (C 62 H 89 N 17 O 14 ) Bachem, Weil am Rhein Bombesin (C 71 H 110 N 24 O 18 S) Bachem, Weil am Rhein ACTH 1-17 (C 95 H 145 N 29 O 23 S) Bachem, Weil am Rhein Somatostatin 28 (C 137 H 207 N 41 O 39 S 3 ) Sigma, Steinheim Pharmalyte 3,5-10 GE Healthcare, Freiburg Pharmalyte 4-6,5 GE Healthcare, Freiburg

30 Material und Methoden 21 Pharmalyte 5-8 Phenol Phosphorsäure Piperazindiacrylamid Proteinmarker: PageRuler TM Seeblue TM Plus2 PlusOne TM Repel-Silane ES Pyronin Y Reverse Transkriptase M-MLV RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute, Media 1640) Saccharose Sequencing Grade Modified Trypsin Servalyt 2-11 Servalyt 2-4 Servalyt 6,5-9 Silbernitrat Streptavidin-Phycoerithrin Super Signal West-Pico TCA (Trichloressigsäure) TCEP ((Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid) TEMED (N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin) TFA (Trifluoressigsäure, 99 %) Thioharnstoff TRI Reagent Tris-Base Tris-HCl Triton X-114 Trypanblau Trypsin (Sequencing Grade) GE Healthcare, Freiburg Merck, Darmstadt J.T. Baker, Deventer (Niederlande) Biorad, München MBI Fermentas, St. Leon-Rot Invitrogen, Karlsruhe GE Healthcare, Freiburg Sigma, Steinheim MBI Fermentas, St. Leon-Rot Sigma, Steinheim J.T. Baker, Deventer (Niederlande) Promega Corporation, Madison (USA) Serva, Heidelberg Serva, Heidelberg Serva, Heidelberg Merck, Darmstadt Dianova, Hamburg Perbio Science, Bonn Sigma, Steinheim Sigma, Steinheim Biorad, München Sigma, Steinheim Sigma, Steinheim MBI Fermentas, St. Leon-Rot Sigma, Steinheim Sigma, Steinheim Sigma, Steinheim Merck, Darmstadt Promega, Mannheim

31 Material und Methoden 22 Tween 20 Sigma, Steinheim Geräte und weitere Materialien Aminosäureanalyse Fluoreszenz Detektor, 2475 Multi λ Separation Modul, 2695 Trennsäule, XBridge C18 (2,1 x 150 mm) Analysenwaage, CP225D Elektroblotter: Graphitelektroden, NovaBlot Blotting Papier, GB 005 CO 2 -Inkubator, Hera Cell Dounce Homogenisator (Wheaton, 7 ml) Dynabeads Mouse CD8 Dynabeads Mouse pan B (B220) Dynabeads M-450 Elektrophoresekammern: 1. Dimension: nach Klose & Kobalz (1995) 2. Dimension: Desaphor VA300 Novex Mini-Cell Protean II xi Cell Elektrophoresezubehör: Abstandhalter, 1,5 x 10 x 300 mm Gelschienen, 250 mm, angefertigt Glasplatten, 250 x 300 mm Glasröhrchen, 1,5 x 250 mm Insulinspritze, 1ml, H999.1 Klemmschienen mit Halterung FACS, FACScan Waters, Eschborn Waters, Eschborn Waters, Eschborn Sartorius, Göttingen GE Healthcare, Freiburg Schleicher und Schuell, Dassel Kendro, Osterode Fischer Scientific, Schwerte Dynal Biotech, Oslo (Norwegen) Dynal Biotech, Oslo (Norwegen) Dynal Biotech, Oslo (Norwegen) Plexiglas Lehmann, Dortmund Desaga, Wiesloch Invitrogen, Karlsruhe Biorad, München Desaga, Wiesloch Plexiglas Lehmann, Dortmund Desaga, Wiesloch Schott Glas, Mainz Brand, Wertheim Desaga, Wiesloch Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA