Gebrauchsinformation FLUORIMMUN Influenza
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- Lena Christa Möller
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1 Gebrauchsinformation FLUORIMMUN Influenza Indirekter Immunfluoreszenztest (IFT) für Influenza A oder B Best.-Nr.: FI-100, FI-200 Verwendungszweck Die FLUORIMMUN-Influenza A und B Testpackungen und Einzelreagenzien sind zur Bestimmung der Influenza-Antikörper vorgesehen, um damit den Zustand eines Infektionsschutzes oder einer Frischinfektion mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz unter Verwendung gebrauchsfertiger oder lyophilisierter Reagenzien festzustellen. Anwendungsbereich Die FLUORIMMUN-Influenza Testpackung ist ein indirekter Immunfluoreszenz-Test zum Nachweis von Typ-Immunglobulinklassen-spezifischen Influenzavirus-Antikörpern im Serum. Die Reagenzien und Objektträger sind auch einzeln zu beziehen. Bei Verwendung von Einzelreagenzien ist eine Standardisierung im Anwender-Labor erforderlich. Der Test ist zur Verwendung durch Fachpersonal vorgesehen. Diagnostische Bedeutung Ein grippaler Infekt kann durch eine Vielzahl viraler, z. T. auch bakterieller Erreger hervorgerufen werden. Es treten dabei zumeist Krankheitssymptome der oberen Luftwege sowie Fieber und Gliederschmerzen auf. Die Zeichen einer echten Grippe dagegen beginnen überwiegend systemisch, mit plötzlich auftretendem allgemeinen Krankheitsgefühl, Kopfschmerzen, Myalgien, Schüttelfrost, Husten und hohem Fieber. Dabei können Pneumonien auftreten, die entweder durch Influenza A- oder Influenza B-Viren oder durch bakterielle Superinfektionen ausgelöst werden. Mit diesem Test können frische oder kürzlich zurückliegende Influenza-Infektionen durch Unterscheidung der Virus-spezifischen Immunglobulinklassen erkannt werden. Dadurch können auch niedrige KBR-Titer interpretiert werden (1, 3, 4). Störfaktoren wie z. B. hämolytische Seren, antikomplementäre Serumaktivität oder unspezifische Seruminhibitoren beeinflussen den Test nicht. Epidemiologisch kann der Nachweis von Influenza A-Virus- Subtypen bedeutungsvoll sein (2). Testprinzip Grundlage des Tests ist die Bindung Influenzavirus-spezifischer Antikörper an mit Influenzavirus-Antigen beschichtete Hühner-Erythrozyten auf Objektträgern. Der Bindungsnachweis erfolgt durch FITC-markierte anti-human-iga- bzw. anti-human-igg-antikörper. Bei den Antigenen handelt es sich um die von der WHO für die jeweilige Saison empfohlenen Influenzavirus-Impfstämme. FI-100, FI-200 / Seite: 1 / 10
2 Sicherheitsmaßnahmen Gefahrenhinweise und Vorsichtsmaßnahmen Dieses Produkt ist ein In-vitro-Diagnostikum. Die FLUORIMMUN-Influenza A und B Testpackungen sowie die Einzelreagenzien sind nur für die Anwendung durch Fachpersonal vorgesehen, welches die Arbeitstechniken einwandfrei beherrscht. Das Influenza-Antigen zur Beschichtung der Hühner-Erythrozyten wurde chemisch inaktiviert. Dennoch müssen alle Proben, biologischen Reagenzien und für die Testdurchführung verwendeten Materialien grundsätzlich als potentiell infektiös angesehen und entsprechend behandelt und entsorgt werden. Bitte beachten Sie die Laborvorschriften für die Handhabung von infektiösem Material! Nicht mit dem Mund pipettieren. In den Bereichen, in denen mit den Testreagenzien und Patientenproben gearbeitet wird, nicht Rauchen, Essen oder Trinken. Beim Umgang mit den Testreagenzien und Patientenproben geeignete Schutzkleidung und Einweghandschuhe tragen. Entsorgung Bitte beachten Sie die jeweils geltenden gesetzlichen Vorschriften! Reagenzien FLUORIMMUN-Influenza A (H 1 N 1 + H 3 N 2 ): FI-100 Reagenz Menge Best.-Nr. FLUORIMMUN-Influenza Influenza A (H 1 N 1 + H 3 N 2 ) mit Influenzavirus-Antigen beschichteten Erythrozyten und unbeschichteten Kontroll-Erythrozyten Verhältnis 40 % zu 60 % Influenza-Kontrollserum positiv 1:10 vorverdünnt Titer siehe beiliegendes Titerblatt Influenza-Kontrollserum negativ gebrauchsfertig anti-human-iga-konjugat anti-human-igg-konjugat 6 x Objektträger à 12 Felder FI x 0,2 ml FI x 0,2 ml FI x 0,5 ml FI x 0,5 ml FI-002 Phosphat-Puffer 20 x konzentriert 3 x 7,0 ml P-040 Einbettungsmedium mit Fluoreszenzverstärker 1 x 1,5 ml FI-007 FI-100, FI-200 / Seite: 2 / 10
3 FLUORIMMUN-Influenza B: FI-200 Reagenz Menge Best.-Nr. FLUORIMMUN-Influenza Influenza B mit Influenzavirus-Antigen beschichteten Erythrozyten und unbeschichteten Kontroll-Erythrozyten Verhältnis 20 % zu 80 % Influenza-Kontrollserum positiv 1:10 vorverdünnt Titer siehe beiliegendes Titerblatt Influenza-Kontrollserum negativ gebrauchsfertig anti-human-iga-konjugat anti-human-igg-konjugat 6 x Objektträger à 12 Felder FI x 0,2 ml FI x 0,2 ml FI x 0,5 ml FI x 0,5 ml FI-002 Phosphat-Puffer 20 x konzentriert 3 x 7,0 ml P-040 Einbettungsmedium mit Fluoreszenzverstärker 1 x 1,5 ml FI-007 FI-100, FI-200 / Seite: 3 / 10
4 FLUORIMMUN-Influenza Einzelreagenzien Reagenz Menge Best.-Nr. FLUORIMMUN-Influenza Influenza A (H 1 N 1 + H 3 N 2 ) mit Influenzavirus-Antigen beschichteten Erythrozyten und unbeschichteten Kontroll-Erythrozyten Verhältnis 40 % zu 60 % FLUORIMMUN-Influenza Influenza B mit Influenzavirus-Antigen beschichteten Erythrozyten und unbeschichteten Kontroll-Erythrozyten Verhältnis 20 % zu 80 % Objektträger à 12 Felder Objektträger à 12 Felder FI-510 FI-520 Influenza-Kontrollserum positiv1:10 vorverdünnt Titer siehe beiliegendes Titerblatt Influenza-Kontrollserum negativ gebrauchsfertig anti-human-iga-konjugat anti-human-igg-konjugat 1 x 0,2 ml FI x 0,2 ml FI x 0,5 ml FI x 0,5 ml FI-002 Phosphat-Puffer 20 x konzentriert 3 x 7,0 ml P-040 Einbettungsmedium gebrauchsfertig mit Fluoreszenzverstärker 1 x 1,5 ml FI-007 Zusätzlich erforderliches Material Übliche Laborausrüstung Aqua purificata und steriles Aqua purificata Magnetrührer Färbewännchen Fluoreszenz-Mikroskop (Auflicht, Filterkombination für FITC) Brutschrank mit 37 C (± 1 C) Pipetten mit Einmalspitzen (100 µl, 1000 µl) FI-100, FI-200 / Seite: 4 / 10
5 Lagerung und Haltbarkeit der Reagenzien Reagenzien bis zur Anwendung bei 2 C 8 C aufbewahren. Haltbar bis zu dem auf den Etiketten angegebenen Datum. Reagenzien nach Ablauf der Haltbarkeit nicht mehr verwenden. Haltbarkeit nach dem Öffnen Um Kontaminationen zu vermeiden sollten aseptische Techniken zur Entnahme der Reagenzien angewandt werden. ID-Nr. Bezeichnung Stabilität nach Öffnen FI-510 FI-520 FI-001 FI-002 FLUORIMMUN-Influenza A Objektträger FLUORIMMUN-Influenza B Objektträger rekonstituiertes anti-human-iga-konjugat rekonstituiertes anti-human-igg-konjugat bis zu einer Woche haltbar bei Lagerung 2 C 8 C bis zu einer Woche haltbar bei Lagerung 2 C 8 C einen Monat bei Lagerung 2 C 8 C einen Monat bei Lagerung 2 C 8 C Transportstabilität Die Transportstabilität der Reagenzien ist für 1 Tag bei 37 C gegeben. Probenmaterial Im FLUORIMMUN-Influenza Test wird Serum untersucht. Kontaminierte Proben oder Proben, die Partikel enthalten, sind für den Test nicht geeignet. Die Proben können bei 2 C 8 C bis zu 5 Tagen oder bei 20 C für längere Zeit gelagert werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden. Vorbereiten der Reagenzien Vor Testansatz folgende Reagenzien vorbereiten. ID-Nr. Bezeichnung Vorbereitung FI-001 FI-002 anti-human-iga-konjugat FITC markiert, lyophilisiert anti-human-igg-konjugat FITC markiert, lyophilisiert P-040 Phosphat-Puffer 20 x konzentriert Lyophilisat mit 0,5 ml sterilem Aqua purificata rekonstituieren Lyophilisat mit 0,5 ml sterilem Aqua purificata rekonstituieren 1 x 7 ml Konzentrat 1:20 mit Aqua purificata verdünnen (z. B. 7 ml Pufferkonzentrat ml Aqua purificata) FI-100, FI-200 / Seite: 5 / 10
6 Testdurchführung Für die sachgemäße Anwendung des FLUORIMMUN Influenza Tests sind ausschließlich die Reagenzien von Labor Dr. Merk & Kollegen zu verwenden. Bei Verwendung von Reagenzien anderer Hersteller muss die Kombination der Reagenzien vom Anwender neu validiert werden. Proben und Reagenzien vor Verwendung sorgfältig schütteln. Beim Öffnen und bei der Entnahme der Reagenzien mikrobielle Kontamination vermeiden. Die strikte Einhaltung der Arbeitsvorschrift gewährleistet korrekte Ergebnisse. Testdurchführung zum Nachweis von IgA-Antikörpern Patientenseren 1:150 in PBS verdünnen = Screeningverdünnung (z. B. 5 µl Serumprobe µl PBS-Puffer). Positives Kontrollserum (liegt 1:10 vorverdünnt vor) entsprechend den Angaben auf dem beiliegenden Datenblatt in PBS verdünnen. Negatives Kontrollserum unverdünnt einsetzen. 10 µl Kontroll- bzw. Patientenserum pro Feld pipettieren. Pro Ansatz je 1 Feld für das positive und negative Kontrollserum ansetzen. 90 min bei 37 C in einer feuchten Kammer inkubieren. Waschen der Objektträger: Objektträger gründlich zuerst mit PBS und anschließend mit Aqua purificata vorsichtig abspülen, wobei ein starker Wasserstrahl vermieden werden muss. Bei Verwendung einer Spritzflasche nicht direkt auf die beschichteten Felder spritzen, sondern auf die dazwischen liegenden Stege. Alternativ kann so verfahren werden: Objektträger kurz 1 x in PBS tauchen, 10 min in einem Färbewännchen mit Magnetrührer (800 Upm) in PBS inkubieren. Danach in einem zweiten Färbewännchen mit Aqua purificata 1 min auf Magnetrührer (800 Upm) inkubieren. Nach dem Waschen werden die Objektträger luftgetrocknet oder mit dem Fön getrocknet, dabei den warmen Luftstrom nicht länger auf eine Stelle richten. 10 µl Anti-human-IgA-Konjugat pro Feld pipettieren. 60 min bei 37 C in einer feuchten Kammer inkubieren. Waschen und trocknen wie oben beschrieben. Einbetten mit Einbettungsmedium, Deckglas auflegen. Testdurchführung zum Nachweis von IgG-Antikörpern Patientenseren in PBS verdünnen = Screeningverdünnungen 1:2500 bei Influenza A (bei Verdacht auf akute Infektion) 1:5000 bei Influenza B (bei Verdacht auf akute Infektion) Positives Kontrollserum (liegt 1:10 vorverdünnt vor) entsprechend den Angaben auf dem beiliegenden Datenblatt in PBS verdünnen. Negatives Kontrollserum unverdünnt einsetzen. 10 µl Kontroll- bzw. Patientenserum pro Feld pipettieren. Pro Ansatz je 1 Feld für das positive und negative Kontrollserum ansetzen. 90 min bei 37 C in einer feuchten Kammer inkubieren. Waschen der Objektträger wie oben beschrieben (Nachweis IgA-Antikörper). 10 µl Anti-human-IgG-Konjugat pro Feld pipettieren. 60 min bei 37 C in einer feuchten Kammer inkubieren. Waschen und trocknen wie oben beschrieben. Einbetten mit Einbettungsmedium, Deckglas auflegen. FI-100, FI-200 / Seite: 6 / 10
7 Siehe Kurzanweisung Seite 10 Ablesen der Ergebnisse Objektträger unter dem Fluoreszenz-Mikroskop (Auflicht, Filterkombination für FITC) bei 200- bis 400-facher Vergrößerung mikroskopieren. Eine Ablesehilfe mit Fotos ist auf Anfrage erhältlich. Die Ablesung darf nicht im Randbereich des Objektträgerfeldes erfolgen, da hier unspezifische Fluoreszenz auftreten kann Beurteilung der Test-Ergebnisse Mikroskopisches Bild Strahlend leuchtende, gelbgrüne Fluoreszenz der mit Influenzavirus-Antigen-beschichteten Erythrozyten; negative Kontroll-Erythrozyten sind rot Leuchtende, gelbgrüne Fluoreszenz der mit Influenzavirus- Antigen-beschichteten Erythrozyten; negative Kontroll-Erythrozyten sind rot schwache aber noch deutliche, gelbgrüne Fluoreszenz der mit Influenzavirus-Antigen beschichteten Erythrozyten; negative Kontroll-Erythrozyten sind rot Bewertung +++ stark positiv ++ positiv keine Fluoreszenz, alle Erythrozyten erscheinen rot Ø negativ Gültigkeitskriterien + Schwach positiv = Titer Influenza-Kontrollserum positiv 1:10 vorverdünnt Influenza-Kontrollserum negativ Der im Titerblatt angegebene Endtiter des Kontrollserum muss erreicht werden Das negative Kontrollserum darf keine Fluoreszenz zeigen. Interpretation der Ergebnisse Die Fluoreszenzintensität ist beim IgA-Nachweis meist schwächer als beim IgG-Nachweis. Der Nachweis von IgA-Antikörpern (Titer 1:150) spricht für eine akute oder kürzlich zurückliegende Infektion, jedoch können sie nicht bei jeder frischen Infektion bzw. nicht bei jedem Patienten nachgewiesen werden. Bei einem negativen IgA-Antikörpernachweis kann auch ein hoher IgG-Antikörpertiter auf eine frische oder kürzlich stattgefundene Infektion hindeuten: Antikörpertiter, die für eine akute oder kürzliche Infektion sprechen: IgG Titer IgA Titer Influenza A 1: Influenza B 1: : 150 Die angegebenen Titer dienen nur als allgemeine Richtlinie, da sie sich durch die ständig wechselnden Influenza-Stämme ändern können. Nach Infektionsbeginn wird das Titermaximum 1-2 Wochen nach Infektion erwartet. IgA- Antikörper können bis zu 6 Monate nach Infektion mit einem Titer = 1:80 nachgewiesen werden, während IgG-Titer über einen Zeitraum vom mehr als einem Jahr auf hohem Niveau persistieren können. FI-100, FI-200 / Seite: 7 / 10
8 Fehlerbetrachtung 1. Grau grünlicher Schleier über das ganze Auftragsfeld - mögliche Ursachen: Waschschritt nicht ausreichend. 2. Viele hell fluoreszierende Körnchen zwischen den Erythrozyten - mögliche Ursachen: Waschschritt nicht ausreichend. Testwiederholung wird empfohlen. Unspezifische Serumbestandteile wurden nicht abgewaschen. 3. Positiv Kontrolle erreicht nicht den im Titerblatt angegebenen Endtiter - mögliche Ursachen: Vorverdünnung des positiven Kontrollserums nicht beachtet. Sollten im Zusammenhang mit den Reagenzien Qualitätsmängel oder unklare falsch positive oder falsch negative Ergebnisse auftreten, bitten wir Sie, dies uns zu melden. Leistungsdaten Nachweisempfindlichkeit Die Grenztiter zur Erkennung einer frischen bzw. nur kurze Zeit zurückliegenden Infektion wurden mit Seren ermittelt, bei denen jeweils eine klinisch gesicherte Infektion vorlag (1). 62 Seren wurden auf IgG- und IgA-Antikörper gegen Influenza A getestet, 60 Seren auf Antikörper gegen Influenza B. Influenza A, Antikörper Grenztiter IgG 1: 2500 IgA 1: 150 Influenza B, Antikörper Grenztiter IgG 1: 5000 IgA 1: 150 Spezifität / Sensitivität Zur Bestimmung der Sensitivität wurden Patientenseren mit klinisch gesicherter Infektion verwendet; 62 Seren wurden mit dem FLUORIMMUN Influenza A untersucht, 60 Seren mit dem FLUORIMMUN B. Die Spezifitäten des FLUORIMMUN Influenza A und B wurden mit 103 Prä-Epidemieseren ermittelt. Influenza A, Antikörper Sensitivität Spezifität IgG 83,8 % 95,1 % IgA 77,5 % 99,0 % Influenza B, Antikörper Sensitivität Spezifität IgG 72,5 % 100 % IgA 85,3 % 100 % Interferenzen Störfaktoren wie z. B. hämolytische Seren, antikomplementäre Serumaktivität oder unspezifische Seruminhibitoren beeinflussen den Test nicht. Stammspezifität In einer Versuchsreihe wurden 30 Patientenseren aus einer Influenza A H 3 N 2 Epidemie mit dem FLUORIMMUN Influenza A untersucht. Alle Seren zeigten eine bevorzugte Antikörperantwort für den damals kursierenden Stamm (2). FI-100, FI-200 / Seite: 8 / 10
9 Symbole I In vitro Diagnostikum r Bestell-Nummer L Chargen-Nummer E T Lagerung bei x C bis y C M Hersteller Ungeöffnet verwendbar bis Literatur 1) Döller G., Gerth H-J., (1991) Evaluation of Single Serum Diagnosis after Influenza Infections Lab. med. 15, ) Döller G., Merk C., Gerth H.-J. (1988) Serologische Influenza-Diagnostik: Ist der Immunfluoreszenztest eine Alternative zum Hämagglutionationshemmtest beim stammspezifischen Antikörpernachweis? Lab. med. 12, ) Döller G., Döller P. C., Gerth H.-J. (1986) Diagnostic significance of influenza subtype-specific IgG, IgA and IgM antibodies. J. Biol. Standard. 14, ) Döller P. C., Döller G., Gerth H.-J. (1985) Immunofluorescence test with antigen-loaded erythrocytes: detection of influenza virus specific IgG, IgA and IgM antibodies. Med. Microbiol. Immunol. 173, FI-100, FI-200 / Seite: 9 / 10
10 Kurzanweisung FI-100, FI-200 / Seite: 10 / 10
Gebrauchsinformation für FLU ORIMM U N-Influenza
CE I LABOṚ ~'~ DR MERK Gebrauchsinformation für FLU ORIMM U N-Influenza Indirekter Immunfluoreszenztest (IFT) für Influenza A oder B Best.-Nr.: FI-100, FI-200, FI-110, FI-120 Diagnostische Bedeutung Ein
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