ENZYMKINETIK, ENZYMIMMUNTEST EINES HORMONS

Transkript

1 100 PLATZ 9: ENZYMKINETIK, ENZYMIMMUNTEST EINES HORMONS Die Messung der Enzymaktivität, wie sie im Experiment 1.6 und 1.8 vorgenommen wird, liefert Information über die Geschwindigkeit einer Enzymreaktion unter standardisierten, optimalen Bedingungen mit Substrat in sättigender Konzentration. Einen besseren Einblick in den Mechanismus einer Enzymreaktion gewinnt man aus der Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit v von der Substratkonzentration [S] (Exp. 9.1), vom ph-wert (Exp. 9.2), von Temperatur, Ionenstärke usw. Unsere heutigen Kenntnisse über den Reaktionsmechanismus von Enzymen (vgl. Chymotrypsin, Exp. 10.1) basieren auf solchen kinetischen Untersuchungen und auf Daten über die Struktur der Enzyme (Aminosäurensequenz und Kristallstruktur-Aanalyse). Die hier untersuchten Phosphatasen zeigen geringe Substratspezifität. Ihre natürlichen Substrate sind Phosphatester wie AMP, Zuckerphosphate usw. Für kinetische Untersuchungen eignen sich auch künstliche Substrate, so der hier verwendete synthetische p-nitrophenylphosphatester. Das bei der Hydrolyse dieses Esters freiwerdende p-nitrophenol kann im alkalischen ph-bereich als gelbes p- Nitrophenolat-Anion bei 405 nm photometrisch bestimmt werden. Saure Phosphatasen kommen in Leukozyten, in der Prostata und in Osteoklasten vor. Alkalische Phosphatasen findet man im Darm, in der Leber, in Nierentubulus-Zellen und in Osteoblasten. Beim Mensch sind mehrere Isoenzyme der alkalischen Phosphatase als auch der sauren Phosphatase bekannt. Die Isoenzyme kommen teilweise in unterschiedlichen Zellen vor. Einige der Isoenzyme können getrennt nachgewiesen werden. Aktivitätsmessung dieser Enzyme im Blut hat eine grosse diagnostische Bedeutung und gehört zu den häufig durchgeführten Laboruntersuchungen in der Medizin. Immunologische Bestimmungsmethoden werden zum Nachweis von Stoffen verwendet, die nur in sehr geringen Mengen in biologischem Material vorkommen (z.b. Hormone). Radioimmunoassay und Enzymimmunoassay sind ebenfalls zu Routineverfahren im biochemischen und klinischchemischen Labor geworden. Als Beispiel für einen Enzymimmunoassay wird in Exp. 9.5 die Thyroxinkonzentration im Serum "in silico" bestimmt. Theoretische Grundlagen: Enzymreaktionen S Photometrie S. 31 Immunologische Bestimmungsmethoden (S. 56) Bezug zu anderen Plätzen: Aktivität und Substratspezifität von Alkoholdehydrogenase, Exp. 1.7 Aktivität von Kreatinkinase, Exp. 1.8 Titrationskurven von Aminosäuren, Exp. 2.2

2 101 EXPERIMENT 9.1: Bestimmung von K m und V max der sauren Phosphatase Prinzip: Für die Bestimmung von K m und V max wird die Reaktionsgeschwindigkeit bei verschiedenen Substratkonzentrationen gemessen. Temperatur, ph und Enzymkonzentration werden konstant gehalten. Die Substratkonzentration wählt man gewöhnlich zwischen dem 0.1-fachen und 10-fachen des mutmasslichen K m -Wertes. Die in diesem Versuch verwendeten Konzentrationen sind so gewählt, dass ihre reziproken Werte in der 1/v gegen 1/[S]-Darstellung vernünftig verteilt sind. Lösungen: Na-Acetatpuffer (0.2 M), ph 5.0; saure Phosphatase aus Kartoffeln (11 µg/ml); p-nitrophenylphosphat (30 mm); p-nitrophenylphosphat (3 mm); p-nitrophenylphosphat (0.5 mm); NaOH (0.25 M). Ausführung: Folgende Inkubationsansätze vorbereiten: A B C D E F G H I Puffer ml Substrat, 30 mm ml Substrat, 3 mm ml Substrat, 0.5 mm ml Wasser ml RG A bis I mischen und ins 37EC-Wasserbad stellen. In einem weiteren RG ca. 2 ml des Enzyms ebenfalls ins 37EC-Wasserbad stellen. Nach 5 min in genau 0.5-minütigen Abständen je 0.2 ml des vorgewärmten Enzyms zu den Proben A - I geben. Nach 15 min bei 37EC (d.h. 15 min nach der Zugabe von Enzym zu Probe A) 3.4 ml NaOH aus automatischer Pipette wiederum in genau 0.5- minütigen Abständen zu den Proben A - I geben. Extinktionen bei 405 nm gegen Probe I (Blindwert) ablesen und Werte in untenstehende Tabelle eintragen. Daraus die Konzentration des Produktes, [P], in den Inkubationsansätzen berechnen (Volumen = 0.6 ml). Der Extinktionskoeffizient des p-nitrophenolat-anions, ε 405, beträgt 18.4 mm -1 cm -1. Unter Annahme, dass die Reaktionsgeschwindigkeit v während der 15-minütigen Inkubationsdauer konstant geblieben ist, Werte für den Umsatz pro Minute (= v) und reziproke Werte (l/v) berechnen.

3 102 Probe [S] (mm) 1/[S] (mm -1 ) E 405 [P] (mm) v (mm min -1 ) 1/v (mm -1 min) A *) *) *) B C 1 1 D E F G H *) Es steht eine Auswertungsvorlage zu Exp. 9.1 im Bipweb zur Verfügung. Werte berechnen und in der Tabelle festhalten, falls Ihnen kein Zugang zu Bipweb möglich ist! Resultate in die Auswertungsvorlage Exp.9.1 im Bipweb eingeben. Aus der Darstellung 1/v gegen 1/[S] wird V max und K m bestimmt (bzw. falls nicht möglich, manuell 1/v gegen 1/[S] auf Millimeterpapier auftragen und daraus V max und K m bestimmen; Theorie S.38). Das in der Auswertungsvorlage verwendete Programm kann auch die den Messwerten am besten angepasste Michaelis-Menten-Kurve berechnen (Hyperbolische Anpassung). Die mit den beiden Methoden bestimmten Werte für V max und K m miteinander vergleichen. Die molekulare Aktivität (min -l ) des Enzyms bezogen auf eine Molekularmasse von 100'000 Da berechnen. S Wie gross ist die Dissoziationskonstante K d des Enzymsubstrat-Komplexes im Vergleich zu K m (siehe Theorieteil)? EXPERIMENT 9.2 ph-abhängigkeit der sauren und alkalischen Phosphatase Prinzip: Saure und alkalische Phosphatasen katalysieren beide die hydrolytische Spaltung von Phosphatestern, unterscheiden sich aber durch ihr ph-optimum und den Mechanismus der Spaltung. Im folgenden Experiment wird die ph-abhängigkeit der durch die beiden Enzyme katalysierten Hydrolyse von p-nitrophenylphosphat verglichen. Der Phosphatester wird bei verschiedenen ph-werten mit saurer bzw. alkalischer Phosphatase inkubiert. Die Reaktion wird am Ende der Inkubationszeit durch Zugabe von NaOH abgebrochen. Die enzymatische Aktivität wird durch photometrische Bestimmung des freigesetzten p-nitrophenols ermittelt. Lösungen: - Saure Phosphatase (aus Kartoffeln, 30 µg/ml); alkalische Phosphatase (aus Kälberdarm, 0.02 mg/ml); Substrat = p-nitrophenylphosphat (10 mm); NaOH, 0.25 M.

4 - Pufferlösungen (0.1 M): ph 2, HCl-Glycin; ph 4 und ph 5, Essigsäure-Natriumacetat; ph 6, HCl- Histidin; ph 8, HCl-Tris; ph 10, Natriumbicarbonat-Natriumcarbonat; ph 12, Arginin-KOH. 103 Ausführung: 3 Reihen von je 6 RG für saure Phosphatase (A), alkalische Phosphatase (B) und Blindwert (C) vorbereiten und nach folgendem Schema beschriften: ph 2 ph 4 ph 5 ph 6 ph 8 ph 10 ph 12 Reihe A Reihe B (saure Phosphatase) (alkalische Phosphatase) Reihe C (Blindwert) In jedes RG 0.2 ml Substrat pipettieren. Nach obenstehendem Schema je 0.2 ml der entsprechenden Pufferlösung zugeben. Alle Röhrchen zum Vorwärmen ins 40EC-Wasserbad stellen. Daneben in 3 entsprechend markierten Röhrchen 2 ml saure Phosphatase, 2 ml alkalische Phosphatase sowie 2 ml bidestilliertes Wasser (für Blindwerte) ebenfalls vorwärmen. Nach 5 Minuten der Reihe nach in genau 0.5-minütigen Abständen je 0.2 ml vorgewärmte saure Phosphatase zu den Proben der Reihe A geben. Anfangszeit registrieren. In gleicher Weise in 0.5-minütigen Abständen zu den Proben der Reihe B je 0.2 ml vorgewärmte alkalische Phosphatase und zu den Proben der Reihe C (Blindwerte) je 0.2 ml vorgewärmtes Wasser zugeben. Jede Probe genau 15 Minuten ins 40EC-Wasserbad stellen. Reaktion durch Zugabe von 3.4 ml NaOH (automatische Pipette) zu jedem RG in der gleichen Reihenfolge wie oben in genau 0.5-minütigen Abständen abbrechen. Extinktionen aller Proben von Reihe A und B gegen C als Blindwert bei 405 nm ablesen, in Tabelle festhalten und in die Auswertungsvorlage im Bipweb eingeben( bzw. auf Millimeterpapier graphisch darstellen, falls Zugang zu Bipweb nicht verfügbar ist). S Die experimentell erhaltene Kurve hat eine Form, die an zwei Säure-Basen-Titrationskurven von Aminosäureseitenketten erinnert (vgl. Exp. 2.2). Man kann deshalb aus der ph-abhängigkeit der Enzymaktivität Rückschlüsse ziehen auf funktionelle Aminosäureseitenketten, die für die Enzymaktivität notwendig sind. Welche Seitenketten könnten für die ph-optima der beiden Phosphatasen verantwortlich sein? Welche Ladung tragen diese Seitenketten im aktiven Enzymmolekül?

5 104 EXPERIMENT 9.5: Enzymimmuntest zur Thyroxin-Bestimmung im Serum (in silico) Prinzip: Thyroxin im Serum wird mittels eines Enzymimmunoassays vom Typ ELISA (Enzyme-Linked- Immuno-Sorbent-Assay) bestimmt. Der Antikörper (AK) ist kovalent an die Innenwand von Plastikröhrchen (coated tubes) gebunden. Freies und gebundenes Antigen (AG) können somit einfach voneinander getrennt werden. Durch Ausgiessen oder Absaugen der Flüssigkeit werden die freien Antigenmoleküle entfernt, während die an die Röhrchenwandung gebundenen Antigen-Antikörper- Komplexe zurückbleiben. Gemäss dem Massenwirkungsgesetz stellt sich folgendes Gleichgewicht ein: Die enzymmarkierten Antigenmoleküle (AG* = T4-Enzym), die in konstanter Konzentration vorliegen, konkurrieren mit den zu bestimmenden unmarkierten Antigenmolekülen (AG = T4) um die in konstanter Menge vorliegenden Bindungsstellen des Antikörpers. Die Menge des unmarkierten Antigens bestimmt, wieviel enzymmarkiertes Antigen gebunden wird. Je mehr unmarkiertes Antigen in der untersuchten Probe vorhanden ist, desto weniger enzymmarkiertes Antigen kann gebunden werden. Das bei diesem Test zur Markierung des Antigens verwendete Enzym ist eine Peroxidase (POD) ähnlicher Art, wie sie bei der Glucose-Bestimmung (Exp. 1.3) verwendet wird. Der immunologischen Reaktion folgt eine Indikatorreaktion, mit der die gebundene Enzymaktivität erfasst wird. Dabei wird die Peroxidase-Aktivität im wandfixierten Enzym-Antigen-Antikörperkomplex (AG*-AK-Komplex) nach Zugabe der Substrate (Wasserstoffperoxid und Chromogen) photometrisch bestimmt.

6 Der bisher verwendete T4-ELISA der Firma Boehringer Mannhein wird leider nur noch für ein vollautomatisch arbeitendes Analysegerät hergestellt. Ein Ersatz-ELISA steht nicht zur Verfügung. Der T4-Immuntest wird deshalb mit einer Animation im Bipweb in silico, d.h. virtuell, dargestellt (siehe Bipweb, Exp. 9.5). Der Tests wird "in silico" durchgeführt (Auswertung von Versuchsergebnissen, wie in Exp. 10.3!). Im virtuellen Test werden die selben Arbeitsschritte durchgeführt und die gleichen Materialien eingesetzt wie im realen Testverfahren. Material/Reagenzien: - Plastikröhrchen mit Thyroxin-Antikörpern (aus Kaninchen) beschichtet (coated tubes) - Inkubationslösung (Thyroxin-POD-Konjugat in Pufferlösung, ph 8.6) - Substratlösung (H 2 O 2 und Chromogen in Pufferlösung, ph 5.0) - Standard- und Probenlösungen Die Konzentration der Standardlösungen ist auf den Originalfläschchen angegeben. Sie ist je nach Lieferung der Vertreiberfirma etwas verschieden. a: 0 µg/dl b: 3-4 µg/dl c: 7-8 µg/dl d: µg/dl e: µg/dl 105 Ausführung:

7 Pipettieren Standard Probe Standardlösung a Standardlösung b Standardlösung c Standardlösung d Standardlösung e Patientenprobe Inkubationslösung 1a 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml Bei rascher Zugabe der Inkubationslösung zu den Röhrchen erfolgt ausreichende Vermischung mit dem Probematerial. 2. Inkubieren 30 min bei Raumtemperatur. 3. Aussaugen des Röhrcheninhalts (Pasteurpipette an Wasserstrahlpumpe verwenden). 4. Waschen des Röhrchens mit Leitungswasser aus der Spritzflasche: bis zum Rand füllen und ca. 10 min stehen lassen, aussaugen (Pasteurpipette an Wasserstrahlpumpe verwenden). 5. Pipettieren von 1 ml Substratlösung in konstanten Zeitintervallen (30 s) in die 6 Röhrchen, anschliessend mit Parafilm verschliessen. Mischen durch Kippen der Röhrchen. Nicht schütteln, wegen Schaumbildung! 6. Exakt 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. 7. Pipettieren von 0.1 ml Stoppreagens in gleichen Zeitintervallen (30 Sekunden) wie Substratlösung, sofort mischen durch Kippen der Röhrchen. Messung: Photometer bei einer Wellenlänge von 405 nm gegen Luft auf Null abgleichen. Inhalt der Teströhrchen vor der Messung durch Kippen gut mischen. Extinktionsbestimmung der Standards a-e sowie der Probe (Werte in umstehende Tabelle eintragen).

8 107 Auswertung: Graphische Ermittlung einer Eichkurve durch Auftragen der gemessenen Standard-Extinktionen (E a-e ) gegen die entsprechenden Standard-Konzentrationen (a-e): x-achse = Konzentration y-achse = Extinktion Probenkonzentration aus der experimentell ermittelten Eichkurve ablesen. Umrechnungsfaktor: µg/dl x = nmol/l Konzentration µg/dl Extinktion 405 nm a b c d e Probe Pat.1... Probe Pat.2... S S Wie kann gezeigt werden, dass die AG-AK-Bindung reversibel ist? Worin unterscheidet sich der Enzymimmuntest vom Radioimmuntest?