Moleküle nach Maß. Evolutive Entwicklung von Wirkstoffen und Biokatalysatoren durch bakterielles Surface Display

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1 Moleküle nach Maß Evolutive Entwicklung von Wirkstoffen und Biokatalysatoren durch bakterielles Surface Display Die Arbeiten in der Gruppe von Prof. Dr. Joachim Jose haben 3 Schwerpunkte: 1. Entwicklung neuer Wirkstoffe durch Bibliothekscreening (Evolutives Design) 2. Enantioselektive, biokatalytische Synthese (Enzym Display) 3. Evaluierung von Wirkstoffen in zellulären Testsystemen (Assay Entwicklung) In allen drei Schwerpunkten spielt das Autodisplay System, ein in der Gruppe entwickeltes und zur Patentreife gebrachtes Oberflächenexpressionssystem für Escherichia coli eine große Rolle. Die Expression eines Moleküls an der Oberfläche einer lebenden Zelle bietet dabei, unabhängig davon ob es sich bei dem Molekül um einen Enzyminhibitor, ein Enzym, einen Antikörper, einen Rezeptor oder ein anderes Protein handelt, einige interessante Vorteile. Das Molekül ist unmittelbar zugänglich für jede Art von Aktivitäts- oder Bindungsstudien. Es ist in der Regel stabiler in dieser immobilisierten Form denn als freies Molekül und es kann durch Zentrifugation der entsprechenden Zellen einfach aus einem Reaktionsansatz entfernt und in den nächsten überführt werden. Im Falle der Oberflächenexpression von Bibliotheken und der darauf folgenden Selektion von ganzen Zellen mit bestimmten Varianten, lässt sich die Struktur des Oberflächen-exprimierten Moleküls einfach durch Analyse der korrespondierenden DNA Sequenz bestimmen (Abb. 1). Abb. 1: Oberflächenexpression von Peptidbibliotheken durch Autodisplay und Selektion durch Target Enzym Bindung (nach 2,3 ). [1] Autodisplay eines Peptides mit bekannten inhibitorischen Eigenschaften an der Zelloberfläche. [2] Erzeugung einer Bibliothek von Varianten durch Variation der entsprechenden kodierenden Region. Resultat ist eine Bibliothek von E. coli Zellen, worin jede einzelne E. coli Zelle nur eine Variante, aber in hoher Zahl trägt. [3] Diese Bibliothek wird mit dem Targetenzym, für das eine neue Leitstruktur gesucht wird, gescreent. Aufgrund der inhärenten Affinität eines Enzyms zu seinem Inhibitor findet das Enzym die Zelle mit der korrekten Struktur und markiert diese durch Bindung. [4] Die markierte Zelle wird über Durchflusszytometrie aussortiert und die selektierte Struktur bestimmt. 1

2 Das Autodisplay System beruht auf dem Translokationsmechanismus der Autotransporter Proteine (Abb. 2), einer Familie von Proteinen, die durch Jose et al erstmal beschrieben wurde 4. Es konnte anhand einer Vielzahl von Beispielen gezeigt werden, dass durch Austausch der kodierenden Region für den natürlichen Passagier durch die kodierende Region für ein rekombinantes Protein, dieses sehr effektiv an die Zelloberfläche von E. coli transportieren werden kann (zur Übersicht s. 5 ) A SP passenger linker β-barrel autotransporter B Abb. 2: Transportmechanismus der Autotransporterproteine in gramnegativen Bakterien. A) Die Autotransporter Proteine werden als Vorläufer synthetisiert in denen alle Informationen zum Transport an die Zelloberfläche enthalten sind. B) Mit Hilfe eines typischen Signalpeptides erfolgt der Transport über die Cytoplasmamembran. Im Periplasma angekommen, faltet sich der C terminale Teil als β-barrel in die äußere Membran ein. Durch die so gebildete Porin-ähnliche Struktur wird der Passagier an die Zelloberfläche transportiert. Der Transport eines rekombinanten Proteins erfolgt durch den Einsatz der kodierenden Sequenz an der entsprechenden Stelle des Vorläufergens (nach 1 ) Es ist uns gelungen, Enzyminhibitoren in hoher Kopienzahl mittels Autodisplay in aktiver Form an der Zelloberfläche zu exprimieren 2, 3, 6 und am Beispiel der humanen Targets Leukozyten Elastase aus neutrophilen Granulozyten 3 und Cathepsin G 2 zu zeigen, dass die Affinität zwischen Inhibitor und Enzym dazu ausgenutzt werden kann, um Zellen, die Inhibitoren tragen, über die Bindung des Targetenzyms zu markieren. War das Targetenzym mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt, so ließen sich die Zellen mit Inhibitoren an der Zelloberfläche anschließend in der Durchflußzytometrie eindeutig identifizieren. Positive Zellen konnten aus einem Gemisch mit negativen Kontrollzellen durch FACS aussortiert und wieder klonal expandiert werden. Diese Prinzip wurde anschließend angewandt um mit Autodisplay an der Oberfläche exprimierte Zufallspeptidbibliotheken zu screenen. Auf diese 2

3 Weise wurden neue peptidische Leitstrukturen für Inhibitoren des humanen Enzyms Cathepsin G mit K i -Werten im Bereich von 1 µm identifiziert 2, 6. Zum anderen konnten wir verschiedene Enzyme und Elektronen-übertragende Proteine in aktiver Form und hoher Zahl mittels Autodisplay an der Zelloberfläche von E. coli exprimieren 5. Dazu gehören die Esterasen EstA 7, EstE 8, und EsjA 9, die 10, 11 Sorbit-Dehydrogenase (SDH) aus Rhodobacter sphaeroides und das mitochondriale Ferredoxin aus dem Rind, Adrenodoxin (Adx) 1, 12. Die enzymatische Aktivität der Oberflächen-exprimierten Enzyme ließ sich ohne weiteres über die Umsetzung verschiedener Substrate mit ganzen Zellen nachweisen. Die so mit Autodisplay entwickelten Ganzzell-Biokatalysatoren konnten effizient zur Synthese von Steroiden und Zuckern eingesetzt werden, die synthetisch sonst nur bedingt zugänglich sind 1, 11. Abb. 3: Spontane Dimerisierung von Passagierproteinen, die als Monomere mittels Autodisplay an der Zelloberfläche exprimiert werden am Beispiel der SDH, ein natürlicherweise als funktionelles, cytoplasmatisches Dimer vorkommendes Proteins 10,11. Es gibt derzeit nur eine überschaubare Anzahl von zellulären Oberfächenexpressionssystemen in Hefen, Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien, die für wissenschaftliche oder kommerzielle Anwendungen zur Verfügung stehen (zur Übersicht s. 13,14 ). Das in unserer Arbeitsgruppe entwickelte Autodisplay System hebt sich in drei wesentlichen Punkten von allen anderen ab 5 : 1. Die Zahl der an der Oberfläche präsentierten Moleküle liegt in der Größenordnung von ,11,12. Trotz dieser immensen Expression kommt es nicht zu spontanen Zelllysen oder Viabilitätsverlusten wie bei anderen Systemen beobachtet. Die Zellen bleiben stabil und überstehen ohne weiteres Ganzzellscreeningverfahren wie FACS, wobei sortierte Einzelzellen zu klonalen Populationen heranwachsen und analytischen und präparativen Zwecken zugeführt werden können. 2. Zwei (oder mehrere) als Monomere exprimierte Untereinheiten, die Affinität zueinander haben, können sie sich an der Zelloberfläche spontan zu funktionellen Dimeren (oder Multimeren) zusammenlagern 5,11,12. Diese sog. Passagiergetriebene Dimerisierung ist bisher für kein anderes System beschrieben worden und hängt mit der freien Beweglichkeit der als Membrananker dienen β-barrel Struktur in der äußeren Membran von E. coli zusammen. Dies bietet zum einen die Möglichkeit, wichtige eukaryontische Proteine, die aus mehreren 3

4 Untereinheiten aufgebaut sind, wie z.b. Antikörper oder Rezeptoren der funktionellen Oberflächenexpression in E. coli zugänglich zu machen. Zum anderen ergibt sich dadurch die Option, Kombinatorik an der Zelloberfläche von E. coli zu betreiben, beispielsweise beim Einsatz des Autodisplay Systems in der gerichteten Evolution. 3. Es können anorganische prosthetische Gruppen in Apoproteine, die an der Zelloberfläche exprimiert sind, nachträglich eingebaut werden, ohne dass die Zellen geschädigt werden. Dies erlaubt, das Spektrum der dem zellulären Surface Displays zugänglichen Proteine gegebenenfalls auf solche mit FAD- oder Häm-Gruppen zu erweitern 1, 12. Abb. 3.: Ganzzellbiokatalysator zur Synthese von Pregnenolon und Corticosteron durch Autodisplay von bovinem Adx und Zugabe von CYPs und AdR (aus 1 ). Für die Entwicklung des Autodisplay Systems und seine Anwendung wurde Joachim Jose 1998 mit dem Innovationspreis in Medizinischer Chemie ausgezeichnet, der von der GDCH und der DPhG gemeinsam verliehen wird und 2004 erhielt er den mit dotierten SaarLB Wissenschaftspreis. Die Publikation Autodisplay: One-component-system for efficient surface display and release of soluble recombinant proteins from Escherichia coli. J Bacteriol (1997), 179: wurde von der ASM als Journal Highlight of the Month ausgewählt (ASM News, 63:206, 1997) und der Beitrag Synthesis of rare sugars by whole cells of E. coli using Autodisplay of Sorbit Dehydrogenase wurde auf GDCH Tagung Frontiers in Medicinal Chemistry 2003 in Fulda mit dem Posterpreis ausgezeichnet. Zitierte Arbeiten 1. Jose, J.; Bernhardt, R.; Hannemann, F., Cellular surface display of dimeric Adx and whole cell P450-mediated steroid synthesis on E. coli. J Biotechnol 2002, 95, (3), Jose, J.; Betscheider, D.; Zangen, D., Bacterial surface display library screening by target enzyme labeling: Identification of new human cathepsin G inhibitors. Anal Biochem 2005, 346, (2), Jose, J.; Zangen, D., Autodisplay of the protease inhibitor aprotinin in Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun 2005, 333, Jose, J.; Jahnig, F.; Meyer, T. F., Common structural features of IgA1 protease-like outer membrane protein autotransporters. Mol Microbiol 1995, 18, (2),

5 5. Jose, J., Autodisplay: efficient bacterial surface display of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol 2006, 69, (6), Jose, J.; Betscheider, D.; Ray, S.; Lengauer, T.; Zangen, D., New inhibitors of human cathepsin G identified by surface display library screening and peptide-protein docking. Tasarim Basim: Ankara, 2003; p Schultheiss, E.; Paar, C.; Schwab, H.; Jose, J., Functional esterase surface display by the autotransporter pathway in Escherichia coli. Journal of Molecular Catalysis B. Enzymatic 2002, 18, Talker-Huiber, D.; Jose, J.; Glieder, A.; Pressnig, M.; Stubenrauch, G.; Schwab, H., Esterase EstE from Xanthomonas vesicatoria (Xv_EstE) is an outer membrane protein capable of hydrolyzing long-chain polar esters. Appl Microbiol Biotechnol 2003, 61, (5-6), Heinzle, E.; Weiss, S.; Wolfbeis, O.; Arain, S.; Klimant, I.; John, G.; Räbiger, T.; Müller, G.; Waltenberger, H.; Schultheiss, E.; Jose, J., Mikrotiterplatten-Reaktoren mit integrierten ph-sensoren und Autodisplay in E. coli zur evolutiven Enzymentwicklung. transkript 2003, 9, (Biokatalyse), Jose, J.; von Schwichow, S., "Cystope tagging" for labeling and detection of recombinant protein expression. Anal Biochem 2004, 331, (2), Jose, J.; von Schwichow, S., Autodisplay of active sorbitol dehydrogenase (SDH) yields a whole cell biocatalyst for the synthesis of rare sugars. ChemBioChem 2004, 5, Jose, J.; Hannemann, F.; Bernhardt, R., Functional display of active bovine adrenodoxin on the surface of E. coli by chemical incorporation of the [2Fe-2S] cluster. ChemBioChem 2001, 2, Lee, S. Y.; Choi, J. H.; Xu, Z., Microbial cell-surface display. Trends Biotechnol 2003, 21, 1), Wernerus, H.; Stahl, S., Biotechnological applications for surface-engineered bacteria. Biotechnol Appl Biochem 2004, 40, (Pt 3), Auswahl weiterer aktueller Projekte im AK Jose Autodisplay funktioneller Antikörper. Ziel: evolutive Entwicklung gegen Tumorzellassoziierte Antigene gerichteter Antikörper (gefördert durch die Dr. Jürgen Manchot Stiftung) Autodisplay eines Rheuma-assoziierten Antigens zur Entwicklung eines Serum Screening Assays im Mikrotiterplattenformat (Kooperation: Rheumatologie, Düsseldorf). Epitop- und Adhärenzmapping eines Oberflächenproteins von Helicobacter pylori (Kooperation: Pettenkofer Institut München). Autodisplay einer FAD-haltigen Oxidase (Kooperation: FZ Jülich). Design, synthesis and biological evaluation of new potent inhibitors of human hyaluronidases (Kooperation: Mercin University, Turkey). New inhibitors of human protein kinase CK2 (Kooperation: Med. Biochemie, Homburg, Ankara University, Turkey). Autodisplay und evolutives Design von Esterasen (Kooperation: Zentrum für angewandte Biokatalyse, TU Graz). 5