Transgene Tiere: Genmodifikation in der Maus

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1 Transgene Tiere: Genmodifikation in der Maus Gentechnik und Genomics WiSe 2007/2008 Kristian M. Müller Institut für Biologie III Albert-Ludwigs-Universität Freiburg

2 Nobelpreis Physiologie und Medizin 2007

3 Gene targeting in Embryonalen Stamm (ES) Zellen Herstellung eines Targeting Vektors und transformation (Elektroporation) in ES Zellen Homologe Rekombination Positiv/Negativ- Selection

4 Herstellung der Knockout -Mäuse Transfer der modifizierten ES Zellen in Blastocysten und Implantierung in pseudoschwangere Leihmütter schwarz braun Kreuzung der Chimäre, um reinerbige Linien zu erhalten braun braun braun braun braun schwarz

5 Der Anfang: Embyonale Carcinoma (EC) Zellen Aus testikulärem Terato-Karzinomen einer bestimmten Mauszelline konnten Zellen gewonnen und kultiviert werden, die sich in viele Zelltypen differenzieren konnten. Diese Zellen werden als Embyonale Carcinoma (EC) Zellen bezeichent. Implantierung der EC Zellen in Balstocysten und Einsetzen derselben in Leihmütter ergab chimäre Kinder. Evans charakterisierte mit monoklonalen Antikörpern Oberflächenmoleküle der EC Zellen und definierte Marker der frühen Differenzierung. Auch aus gesunden Tieren konnten dann Zellen mit embryonalen Eigenschaften gewonnen werden.

6 Die ersten embryonalen Stammzellen in der Maus Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature Jul 9;292(5819): Embryonale Stammzellen verhalten sich wie EC Zellen und können Chimäre erzeugen.

7 Es Zellen könne in die Keimbahn eingehen Bradley A, Evans M, Kaufman MH, Robertson E. Formation of germ-line chimaeras from embryoderived teratocarcinoma cell lines. Nature May 17-23;309(5965):255-6

8 ES Zellen könne mit einem rekombinanten Retrovirus infiziert und dann eingebaut werden Robertson E, Bradley A, Kuehn M, Evans M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature Oct 2-8;323(6087):445-8 Lokaler Bezug: Gossler A, Doetschman T, Korn R, Serfling E, Kemler R. Transgenesis by means of blastocyst-derived embryonic stem cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A Dec;83(23):9065-9

9 Microinjektion der DNA (Capecchi) Capecchi MR. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell Nov;22(2 Pt 2):

10 Homologe Rekombination in Eukaryonten Folger KR, Wong EA, Wahl G, Capecchi MR. Patterns of integration of DNA microinjected into cultured mammalian cells: evidence for homologous recombination between injected plasmid DNA molecules. Mol Cell Biol Nov;2(11):

11 Gen Targeting und Korrektur eines Gens Thomas KR, Folger KR, Capecchi MR. High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome. Cell Feb 14;44(3):

12 Smithies O, Gregg RG, Boggs SS, Koralewski MA, Kucherlapati RS. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature Sep 19-25;317(6034): Homologe Rekombination (Smithies)

13 Selektion der Integration Mansour SL, Thomas KR, Capecchi MR. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature Nov 24;336(6197):

14 Konditionaler Knockout: Floxed Gene Genkonstrukt mit 3 loxp Stellen wird durch homologe Rekombination in ES Zellen eingebaut Typ I Systemische Deletion - Knockout mit Elemination der Neo- und HSV-TK-Kassette (keine Beeinflussung der Expresssion) Typ II Konditioneller Knockout Typ III ungewünschte Deletion, Gegenselektion mit Ganciclovir (Bilder von Dr Eve Lutz, UK)

15 Kreuzung einer floxed Gen -Maus mit einer Cre -Maus Kreuzung von floxed Gen und Cre tragende Mäusen erlaubt die Generierung Konditionaler Knockout-Mäuse Cre kann unter einem induzierbaren Promotor angeschaltet werden (zeitliche Kontrolle). z.b. mit Tetrazyklin oder Tamoxifen Promotor Cre kann unter einem Gewebespezifischen Promotor exprimiert werden (räumliche Kontrolle), z.b. T-Zellen (lck Promotor), Epithelien (Cytokeratin Promotor)

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