ENA Profile EIA Nur für In-Vitro Diagnostik Nur für den Export. Not for Sale in den Vereinigten Staaten CLIA Kompliziertheit: Hoch

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1 QUANTA Lite ENA Profile EIA Nur für In-Vitro Diagnostik Nur für den Export. Not for Sale in den Vereinigten Staaten CLIA Kompliziertheit: Hoch Verwendungszweck Dieser Kit dient zum qualitativen in-vitro-nachweis (Screening) von spezifischen IgG-Antikörpern gegen extrahierbare nukleäre Antigene (ENA), wie SSA/Ro (60 und 52kD), SSB/La, Sm, Sm/RNP, Scl-70 und Jo-1 im Humanserum. Der Test unterstützt die Diagnose von verschiedenen rheumatischen Erkrankungen. Der Kit enthält ausreichend Material, um bei maximal 12 Proben alle 6 aufgeführten ENAs, sowie eine Cut-Off- und Positivkontrolle in Einzelbestimmung zu messen. Informationen zum Test Antikörper gegen ENAs treten bei vielen Patienten mit systemischen rheumatischen Erkrankungen auf 1-6. Bei diesen Erkrankungen findet man typischerweise ein oder mehrere ENA-Autoantikörper wie nachfolgend zusammengefasst: Autoantikörper-Spezifität Krankheit: Häufigkeit % Sjögren-Syndrom SSA/Ro (60 und 52kD) SLE Neonataler Lupus Sjögren-Syndrom SSB/La SLE Systemische Sklerodermie Neonataler Lupus SM SLE MCTD Sm/RNP SLE Sklerodermie 11 Scl-70 CREST-Syndrom Raynaud s Syndrom 12 Jo-1 Polymyositis SLE: Systemischer Lupus erythematodes MCTD: (mixed connective tissue disease) Mischkollagenosen Diese Autoantikörper wurden bei diesen Krankheiten beschrieben, aber genaue Prozentzahlen liegen in der Literatur nicht vor. Testprinzip Jedes Well innerhalb eines 8-Well-Mikrotiterstreifens ist mit einem der in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten ENAs (SSA/Ro (60 und 52kD), SSB/La, Sm, Sm/RNP, Scl-70 und Jo-1) beschichtet. Die vorverdünnten Kontrollen und verdünnten Patientenproben werden in den Vertiefungen inkubiert, dabei werden in diesem ersten Inkubationsschritt Autoantikörper, die das vorgegebene Antigen erkennen, gebunden. Nach dem Waschen der Vertiefungen - um ungebundenes Protein zu entfernen - wird Peroxidase-markiertes Ziege-anti-Human-IgG-Konjugat zugegegeben. Das Konjugat bindet an die immobilisierten humanen Autoantikörper. Ungebundenes Konjugat wird durch einen weiteren Waschschritt entfernt. Das gebundene Konjugat wird mit Hilfe von 3,3,5,5 Tetramethylbenzidin (TMB) sichtbar gemacht. TMB ergibt ein blaues Reaktionsprodukt, dessen Intensität proportional zur Autoantikörper-Konzentration der Probe ist. Um die Reaktion zu stoppen, wird in jede Vertiefung Phosphorsäure pipettiert. Das gelbe Reaktionsprodukt wird bei 450nm gemessen. Antigenbeschichtung/Probenbelegung der Mikrotiterplatte Reihe ENA-Antigen Kontrolle / Proben A Kontroll-Antigen Cut-off-Kontrolle B Kontroll-Antigen Positiv-Kontrolle C SSA (52 & 60kD) Patientenserum D SSB Patientenserum E Sm Patientenserum F Sm/RNP Patientenserum G Scl-70 Patientenserum H Jo-1 Patientenserum Inhalt der Testpackung 1. Mikrotiter-ELISA-Platte beschichtet mit hochgereinigtem ENA Antigene wie in der Tabelle in Testprinzip Abschnitt. Jedes Platte ist wieder verschließbaren Folienbeutel mit Trockenmittel geben verpackt. Hinweis: Die Mikrotiterstreifen können nur in einer Richtung in den Rahmen eingesetzt werden, dadurch wird immer die korrekte Ausrichtung gewährleistet. 2. ENA-Profil ELISA Cut-Off: 1 Flasche Puffer mit Stabilisator und Humanserum, vorverdünnt,1,6 ml 1

2 3. ENA-Profil-Positivkontrolle: 1 Flasche Puffer mit Stabilisator und Humanserum, vorverdünnt,1,6 ml 4. Probendiluens Typ III, 1 Flasche gelb gefärbt mit Tween 20, Proteinstabilisatoren und Konservierungsmittel, 50 ml 5. HRP Wash Concentrate, 1 Flasche mit 40 fachem Konzentrat rot gefärbt mit gepufferter Kochsalzlösung und Tween 20, 25 ml. Zur Verdünnung bitte das entsprechende Kapitel in der Anleitung beachten. 6. HRP ENA-Profil IgG Konjugat, 1 Flasche blau gefärbt mit Puffer, Proteinstabilisatoren und Konservierungsmittel, 10 ml 7. TMB Chromogen, 1 Flasche mit Stabilisatoren, 10 ml 8. HRP Stopplösung, 0,344M Schwefelsäure, 1 Flasche farblos, 10 ml Hinweise 1. VORSICHT: Probendiluens, kontrollen und konjugat enthalten 0,02% Chloramphenicol. Es ist im US- Bundesstaat Kalifornien und allgemein bekannt, daß dieser Stoff Krebs verursachen kann. Probendiluens mit Proclin150. Enthält ein Reizmittel, das bei Inhalation, Einnahme oder Absorbtion durch die Haut gesundheitliche Schäden verursachen kann. Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. 2. Alle Reagenzien für die Herstellung dieses Tests wurden auf Antikörper gegen HIV, HBsAg und HCV getestet und für negativ befunden. Dennoch sollten alle humanen Kontrollen wie potentiell 15 infektiöses Humanserum oder Blutproben behandelt werden. 3. NaN3 wird als Stabilisator verwendet. NaN 3 ist ein Giftstoff und kann bei Einnahme toxische Reaktionen verursachen. Vorsichtig handhaben und Kontakt mit Augen und Haut vermeiden! Den Kontakt mit Metall, basischen Stoffen oder anderen Komponenten, die mit Säure reagieren können, vermeiden. Bei der Entsorgung von Reagenzien ist daher mit viel Leitungswasser nachzuspülen, um Ansammlungen im Abwassersystem zu verhindern. 4. Das HRP ENA Profil IgG Konjugat enthält eine verdünnte Chemikalie, die bei Einnahme toxisch wirken kann. Daher den Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. 5. Das TMB Chromogen enthält ein Reizmittel, das bei Inhalation, Einnahme oder Absorbtion durch die Haut gesundheitliche Schäden verursachen kann. Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. 6. Die HRP Stopplösung besteht aus verdünnter Schwefelsäure. Den Kontakt mit Basen, Metallen und anderen Stoffen, die mit Säure reagieren können, vermeiden. Schwefelsäure ist ein Giftstoff und kann bei Einnahme toxische Reaktionen hervorrufen. Den Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. 7. Die vorgeschriebene persönliche Schutzausrüstung während der Arbeit mit Reagenzien tragen. 8. Verschüttete Reagenzien sofort beseitigen. Bei der Entsorgung von Abfällen alle Umweltvorschriften beachten. Vorsichtsmaßnahmen 1. Dieser Test ist für In-Vitro Diagnostik. 2. Dieser Test sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal durchgeführt werden. 3. Testdurchführung strikt nach Arbeitsanleitung. Jegliche Abweichung kann die Testqualität und Ergebnisse beeinflussen. Beachten Sie die spezifischen Hinweise und Warnungen in dieser Arbeitsanleitung. 4. Reagenzien unterschiedlicher Chargen dürfen NICHT untereinander gemischt oder gemeinsam verwendet werden. Bei großem Testdurchsatz muss darauf geachtet werden, dass alle Reagenzien der GLEICHEN Charge entstammen. Alle Mikrotiterstreifen müssen aus demselben Folienbeutel entnommen werden. Der Austausch einer Testkomponente kann inkorrekte Ergebnisse zur Folge haben. 5. Zur Vermeidung von Kontaminationen der Reagenzien immer saubere Plastik- oder Glasgefäße verwenden. Niemals unbenutztes Reagenz in die Flaschen zurückgeben. 6. Sicherstellen, dass der Waschpuffer in einem sauberen Gefäß verdünnt und aufbewahrt wird. Waschpuffer, der Anzeichen von mikrobieller Kontamination oder eine Trübung zeigt, darf nicht mehr verwendet werden. In diesem Fall den Puffer verwerfen und eine frische Pufferlösung herstellen. 7. Reagenzienflaschen nicht für längere Zeit offen stehenlassen. Die daraus resultierende Verdunstung oder Verunreinigung führt zu widersprüchlichen Ergebnissen. 8. TMB darf weder mit Licht noch mit Wasser in Berührung kommen! 9. Die Verwendung von mikrobiell oder mit Partikeln verunreinigter, hämolytischer oder lipämischer Seren vermeiden. 10. Die Probenverdünnung kann nicht überprüft werden, da die im Kit enthaltenden Kontrollseren gebrauchsfertig sind. Es wird empfohlen, kalibrierte Pipetten und entsprechende interne Kontrollproben zu verwenden. 11. Die Verwendung von ELISA-Automaten, Pipettierautomaten oder anderen automatisierten Geräten kann im Vergleich zur manuellen Testdurchführung zu abweichenden Ergebnissen führen. Jedes Labor muss das System vollständig validieren und sicherstellen, dass die Ergebnisse innerhalb des in dieser Arbeitsanleitung und dem beigefügten QC-Zertifikat aufgeführten Spezifikationen liegen. 12. Die verwendeten Geräte und Pipetten müssen gemäß der Herstellerangaben kalibriert und gewartet werden. Lagerung 1. Den Kit bei 2-8 C lagern, nicht einfrieren. Lagerung bei falscher Temperatur beeinflusst die Ergebnisse. 2. Der verdünnte Waschpuffer ist in einem sauberen Gefäß bei 2-8 C bis maximal 4 Wochen haltbar. Er kann sowohl kalt (2-8 C) als auch warm (Raumtemperatur) verwendet werden, ohne dass die Ergebnisse dadurch beeinflusst werden. 3. Die Haltbarkeit des Kits wird auf dem Außenetikett angegeben. 2

3 Proben 1. Blutproben über Venenpunktur sammeln und auf natürliche Weise gerinnen lassen. Serum vom Gerinnsel trennen. 2. Die Seren können bei 2-8 C bis zu 7 Tage vor dem Test gelagert werden 13. Für eine längere Lagerung empfiehlt es sich, die Seren unverdünnt und aliquotiert bei mindestens -20 C einzufrieren. 3. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben vermeiden. 4. Serumproben nicht hitzeinaktivieren, dies kann zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Testdurchführung In der Testpackung vorhandenes Material Arbeitsanleitung: mit genauen Angaben zur Testdurchführung. QC-Zertifikat: mit chargen-spezifischen Angaben zu den Kontroll-Sollwerten. ENA Profile Coated Wells (ENA-beschichtete Mikrotiterstreifen): 12 Mikrotiterstreifen mit je 8 Wells. In jedem Streifen sind die Wells mit gereinigtem Antigen, wie in der Tabelle in Testprinzip Abschnitt aufgeführt, beschichtet. Die Streifen sind in einem wiederverschließbaren Folienbeutel, der zwei Beutel mit Trockenmittel enthält, verpackt. Hinweis: Die Mikrotiterstreifen können nur in einer Richtung in den Rahmen eingesetzt werden, dadurch wird immer die korrekte Ausrichtung gewährleistet. Type III Sample Diluent (Proben-Diluens Typ III): 1 Flasche mit 50mL gebrauchsfertigem Puffer zum verdünnen der Proben. HRP Wash Concentrate (Waschpuffer HRP, 40-faches Konzentrat): 1 Flasche mit 25mL eines 40-fach konzentrierten Puffers zum Waschen der Vertiefungen. ENA Profile ELISA Cut-off (ENA-Profil ELISA Cut-Off): 1 Flasche mit 1,6mL verdünntem, stabilisiertem Humanserum. Sollwerte sind im QC-Zertifikat angegeben. Gebrauchsfertig. ENA Profile Positive Control (ENA-Profil-Positivkontrolle): 1 Flasche mit 1,6mL verdünntem, stabilisiertem Humanserum. Sollwerte sind im QC-Zertifikat angegeben. Gebrauchsfertig. HRP ENA Profile IgG Conjugate (HRP ENA-Profil-IgG Konjugat): 1 Flasche mit 10mL gereinigtem, Peroxidase-markiertem Antikörper gegen Human-IgG. Farbcodierung: blau. Gebrauchsfertig. TMB Chromogen (TMB-Substrat): 1 Flasche mit 10mL TMB-Lösung. Gebrauchsfertig. HRP Stop Solution (Stopp-Lösung): 1 Flasche mit 10mL 0,344M Schwefelsäure. Gebrauchsfertig. Zusätzliches benötigtes Material Keine Antwort Automatisches Mikrotiterplatten-Waschgerät: ist empfehlenswert, aber die Platten können auch manuell gewaschen werden. Mikrotiterplatten-Reader: Messung der optischen Dichte in den Wells bei 450nm. Referenzmessung erfolgt gegen Luft. Destilliertes oder deionisiertes Wasser: Es sollte von höchster Qualität und frei von Metallionen sein. Kalibrierte Mikropipetten: Zum Pipettieren von 1000, 100 & 10µL. Mehrkanal-Pipette: Zum Pipettieren von 100µL Volumina von Konjugat, TMB-Chromogen und Stopp-Lösung. Glas- oder Plastikgefäße: Zur Probenverdünnung. Methode Testvorbereitung 1. Kit auf Raumtemperatur erwärmen Die optimale Temperatur für die Testdurchführung liegt bei C. Den Kit nach Entnahme aus dem Kühlschrank ca. 60 Minuten auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Die Wells nicht vor Erreichen der Raumtemperatur aus dem Folienbeutel nehmen.hinweis: Der Kit kann bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur gelagert werden. 2. Kit-Komponenten Jede Kit-Komponente vor Gebrauch kurz schütteln. 3. Waschpuffer (40-fach-Konzentrat) verdünnen: Den gesamten Inhalt (25 ml) des Waschkonzentrats mit 975 ml Aqua dest. mischen (1:40 Verdünnung). Die verdünnte Pufferlösung ist bei 2-8 C eine Woche stabil. Soll nicht die gesamte Mikrotiterplatte auf einmal verwendet werden, so können für einen Ansatz von 16 Kavitäten 2 ml Konzentrat mit 78 ml Aqua dest. gemischt werden. Die verdünnte Pufferlösung ist bei 2-8 C eine Woche stabil. Wird der Kit in diesem Zeitraum nicht aufgebraucht, sollte deshalb nur die benötigte Menge verdünnt werden. Waschpuffer, der Anzeichen von mikrobieller Kontamination oder eine Trübung zeigt, darf nicht mehr verwendet werden. In diesem Fall den Puffer verwerfen und eine frische Pufferlösung herstellen. 4. Umgang mit Streifen und Rahmen Beachten Sie, dass für jede zu testende Probe ein kompletter Mikrotiterstreifen benötigt wird. Die benötigte Anzahl Mikrotiterstreifen aus dem Folienbeutel entnehmen und in den Rahmen setzen. Dabei von Position A1 ausgehend die Spalten von links nach rechts auffüllen. Achten Sie darauf, die langen Seiten des Rahmens zusammenzudrücken, damit die Wells nicht herausfallen können. Hinweis: Um die Kontaktzeit mit der Luftfeuchtigkeit zu minimieren die nicht verwendeten Wells sofort in den wiederverschließbaren Folienbeutel mit dem Trockenmittel geben und gut verschließen. Darauf achten, dass der Folienbeutel nicht beschädigt wird.achtung: Kontakt mit Feuchtigkeit oder Verunreinigung durch Staub oder anderen Partikeln kann einen Antigen-Abbau verursachen. Daraus resultiert eine schlechte Präzision und potentiell falsche Ergebnisse. 5. Verdünnung der Proben 10µL jeder Probe mit 1000µL Proben-Diluens verdünnen (1:101) und gut mischen. Hinweis: Die verdünnten Proben müssen innerhalb von 8 Stunden verwendet werden. Hinweis: Die Positiv- und die Cut-off-Kontrollen sind gebrauchsfertig und müssen nicht vor Gebrauch verdünnt werden. 3

4 Testdurchführung Alle Reagenzien in der gleichen Reihenfolge pipettieren. 1. Pipettieren der Kontrollen und Proben Für eine Patientenprobe wird immer ein kompletter Mikrotiterstreifen verwendet. Deshalb je 100µL der gebrauchsfertigen Cut-Off-Kontrolle in Reihe A und die Positivkontrolle in Reihe B der vorgelegten Mikrotiterstreifen pipettieren. Je 100µL der verdünnten Probe (1:101) in die restlichen 6 Wells des jeweiligen Mikrotiterstreifens pipettieren. Hinweis: Die Proben müssen so schnell wie möglich pipettiert werden, um eine Drift des Tests zu minimieren. Die Inkubationszeit läuft ab Zugabe der letzten Probe. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 2. Waschen der Platte Sorgfältiges Waschen der Wells ist wichtig für eine hohe Präzision und genaue Testergebnisse. Bei nicht korrekt gewaschenen Wells können ungenaue Ergebnisse mit schlechter Präzision und hohem Hintergrund auftreten. Nach der Inkubation die Wells dreimal mit µL Waschpuffer waschen. Das Waschen kann mit einem automatischen Platten-Waschgerät oder manuell erfolgen. Nach dem letzten Waschschritt die Wells durch leichtes Klopfen auf eine absorbierende Unterlage (z.b. Papiertücher) trocknen. Manuelles Waschen: a. Den Inhalt der Wells in den Ausguss schütten, dabei die langen Seiten des Rahmens zusammendrücken. b. Die Wells auf einer absorbierenden Unterlage (z. B. Papiertücher) leicht ausklopfen. c µL Waschpuffer in der Arbeitskonzentration in die Wells pipettieren. d. Die Mikrotiterplatte auf einer flachen Unterlage stehend leicht schütteln. e. Zweimaliges Wiederholen der Schritte a bis d. f. Die Wells wie unter a und b entleeren. 3. Pipettieren des Konjugats 100µL Konjugat in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier abtrocknen, um Spritzer zu entfernen. Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges Konjugat in die Konjugat-Flasche zurückgeben. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 4. Waschen der Platte Siehe Abschnitt Pipettieren von Substrat (TMB) Nach dem Waschen 100µL TMB in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier abtrocknen, um Spritzer zu entfernen. Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges TMB in die TMB-Flasche zurückgeben. 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. 6. Reaktionsende 100 µl Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren. Die Farbe schlägt von blau nach gelb um. 7. Farbmessung Die optische Dichte (OD) bei 450nm in jedem Well mit einem Mikrotiterplatten-Reader innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stopp-Lösung bestimmen. Qualitätskontrolle 1. Qualitätskontrolle Nur, wenn alle nachfolgend aufgeführten Kriterien erfüllt sind, ist der Test gültig. Ist dies nicht der Fall, ist der Test ungültig und muss wiederholt werden. Positiv- und Cut-Off-Kontrolle müssen bei jedem Testansatz mitgeführt werden. Die OD der Cut-Off-Kontrolle und die ENA-Konzentration der Positivkontrolle müssen in dem angegebenen Wertebereich (siehe QC-Zertifikat) liegen. 2. Berechnung der Ergebnisse von Proben und Positivkontrolle Mit der folgenden Formel die ENA-Ergebnisse für die Proben berechnen: OD von Positivkontrolle oder Probe x 10 = Ergebnis der Kontrolle oder Prob (U/mL) OD von Cut-Off- Kontrolle Proben, deren Messergebnisse in dem Graubereich liegen, sollten in den relevanten spezifischen ENA- ELISAs überprüft werden. 3. Kalibration des Tests Der Test ist in U/mL gegen eine willkürliche Referenzpräparation kalibriert. Die ENA-Ergebnisse sind semiquantitativ und über die oben angegebene Formel definiert. 4. Interpretation der Sm- und RNP-Ergebnisse Ist eine Probe negativ für Sm-Antikörper und positiv im RNP-ELISA, dann ist die Reaktion auf die Gegenwart der RNP-Antikörper alleine zurückzuführen. In dem Fall, dass der Sm-ELISA und der RNP- ELISA positiv sind und ähnliche Werte erhalten werden, dann ist dies überwiegend auf die Gegenwart von Sm-Antikörper zurückzuführen. Bei einer Probe, die im Sm-ELISA positiv ist und deren Messwert niedriger als 80% des RNP-Wertes ist, enthält beide Autoantikörper. Bei Proben, deren OD oberhalb des Messbereichs des ELISA-Readers liegen, ist es schwierig die genaue RNP-Antikörper-Konzentration zu bestimmen. Durch Messen der Probe in einer höheren Probenverdünnung (1:200 oder 1:400) kann festgestellt werden, ob die RNP-Antikörper-Konzentration größer als die Sm-Antikörper-Konzentration ist. 4

5 Grenzen des Verfahrens Dieser Testkit dient nur zur Unterstützung der Diagnose. Ein positives Ergebnis ist ein Hinweis auf bestimmte Erkrankungen, diese müssen aber durch den klinischen Befund und andere serologische Untersuchungen bestätigt werden. Die Testergebnisse können nicht als diagnostischer Beweis für das Vorliegen bzw. Nichtvorliegen einer Krankheit verwendet werden. Erwartungswerte Der Normalbereich wurde mit Seren von 120 normalen, erwachsenen Blutspendern bestimmt. Die Cut-Off-Kontrolle liegt am oberen Level des Normalbereichs. 3 verschiedene Proben waren hier positiv für SSB, RNP und Scl-70. Die Ergebnisse aller 120 Proben wurden mit den entsprechenden einzelnen BINDAZYME ENA-Typisierungs-Kits bestätigt.die unten angegebenen Werte dienen nur zur Orientierung. ELISAs sind sehr sensitiv und in der Lage kleine Unterschiede in der Probenpopulation festzustellen. Daher wird empfohlen, dass jedes Labor auf der Basis der lokalen Population und der verwendeten Geräte und Techniken seinen eigenen Normalbereich ermittelt. ENA-Ergebnis Interpretation <8,0 Negativ 8-12 Graubereich >12,0 Positiv Leistungs-Daten Präzision Zur Ermittlung der Intra-Assay-Präzision wurde für jede Spezifität eine Probe, deren Autoantikörper-Konzentration im mittleren Bereich lag, zwölfmal. gemessen. INTRA-ASSAY-PRÄZISION Spezifität Mittlere Optische Dichte % VK SSA 3,10 1,8 SSB 1,31 5,9 Sm 2,41 3,8 Sm/RNP 2,16 3,0 Scl-70 2,19 2,9 Jo-1 1,44 2,6 Zur Ermittlung der Inter-Assay-Präzision wurde eine negative, eine schwach-positive und eine hoch-positive Probe in Einzelbestimmung mit Kits von 3 verschiedenen Chargen getestet. INTER-ASSAY-PRÄZISION Test Probe 1 Probe 2 Probe 3 U/mL % VK U/mL % VK U/mL % VK SSA/Ro 3,3 6,1 15,5 7,1 29,3 6,1 SSB/La 1,9 15,8 23,6 12,7 27,9 19,0 Sm 3,7 8,1 19,4 8,3 37,5 10,7 Sm/RNP 7,7 5,2 19,3 5,2 46,3 11,9 Scl-70 2,6 15,4 18,2 5,0 31,8 4,4 Jo-1 3,1 16,1 19,5 6,7 45,3 9,1 RELATIVE SPEZIFITÄT, SENSITIVITÄT UND ÜBEREINSTIMMUNG DES TESTS Die relative Spezifität, Sensitivität und Übereinstimmung wurden im Vergleich mit den BINDAZYME ENA- Typisierungs-Kits bestimmt. Hierzu wurden 139 ENA-positive Proben getestet (141-Scl-70): BINDAZYME Profil ELISA SSA/Ro SSB Sm Sm/RNP Scl-70 Typisierungs-Kit Relative Korrelation (%) + - Sensitivität Spezifität Übereinstimmung ,9 97, , , ,6 96,9 97,3 97, ,1 96, Jo ,3 98, der 17 diskrepanten Ergebnisse wurden im Graubereich gefunden, wobei alle Messergebnisse der spezifischen ENA ELISAs sehr nahe am Cut-Off-Wert der jeweiligen Tests lagen (höchster Wert war 12,6 U/mL und die Mehrzahl dieser Proben war <11,0 U/mL). 5

6 KORRELATION MIT CDC-REFERENZSEREN Um die Spezifität des ENA-Profil-ELISA-Kits zu bestätigen, wurden CDC-Referenzseren getestet Diese Seren wurden vollständig beschrieben und dokumentiert durch E. M. Tan 14. Antigen CDC-1 CDC-2 CDC-3 CDC-4 CDC-5 Homogen/rim gesprenkelt/ssb gesprenkelt RNP Sm SSA neg. pos. (32,9) pos. (31,3) neg. neg. SSB neg. pos. (>61) pos. (42,7) neg. neg. Sm pos. (20,6) neg. pos. (19,9) neg. pos. (>61) Sm/RNP pos. (28,9) neg. pos. (>61) pos. (>61) pos. (>61) Scl-70 neg. neg. neg. neg. neg. Jo-1 neg. neg. neg. neg. neg. Antigen CDC-6 nucleolär CDC-7 SSA CDC-8 zentromer CDC-9 Scl-70 CDC-10 Jo-1 SSA neg. pos. (46,4) neg. neg. pos. (24,0) SSB neg. neg. neg. neg. neg. Sm neg. neg. neg. neg. neg. Sm/RNP neg. neg. neg. neg. neg. Scl-70 neg. neg. neg. pos. (>61) neg. Jo-1 neg. neg. neg. neg. pos. (>61) Alle Seren wurden gemäß Tabelle 2 der oben zitierten Literatur korrekt identifiziert. Hinweis: Die Proben CDC-6 und -8 enthalten Antikörper gegen Fibrillarin- und Zentromer-Antigen und können deshalb mit diesem Kit nicht erfasst werden. Berichte weisen daraufhin, dass die meisten der Jo-1-positiven Seren ebenfalls Antikörper gegen das 52kD SSA enthalten. Dies scheint auch für das Serum CDC-10 zu zutreffen: es war positiv für SSA mit dem Profil-Kit und negativ für SSA in dem Typisierungskit, in dem nur das 60kD SSA als Antigen verwendet wird. INTERFERIERENDE SUBSTANZEN ENA negative und positive Seren wurden mit verschiedenen interferierenden Substanzen versetzt und anschließend mit diesem ELISA getestet. Die Überprüfungsmethode für diese Substanzen basiert auf dem Kit Interference Check A plus -Kokusai Shiyaku, Japan. Substanz Bilirubin F (Frei) Bilirubin C (Konjugiert) Hämolysiertes Hämoglobin Chylus (Milchsaft) Konzentration 18,3mg/dL 19,0mg/dL 490mg/dL 1930 Units Es wurden keinerlei Störungen durch diese Substanzen festgestellt. Plattenscheman A B C D E F G H Kurzarbeitsanleitung µL von jedem Kalibrator, jeder Kontrolle und jeder 1:101 verdünnten Probe in das entsprechende Well pipettieren. 30 Minuten inkubieren. Waschen µL Konjugat in jedes Well pipettieren. 30 Minuten inkubieren.waschen µL Substrat in jedes Well pipettieren. 30 Minuten inkubieren µL Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren. Absorption bei 450nm messen. 6

7 Referenzen 1. Mongey AB, Hess EV. Antinuclear Antibodies and Disease Specificity. Adv Intern Med, : Moore TL et al. Extractable Nuclear Antigens. Seminars in Arthritis and Rheumatism, No.2: Nakamura et al. Advances in Laboratory Tests for Autoantibodies to Nuclear Antigens in Systemic Rheumatic Diseases. Laboratory Medicine No.3: White RH, Robbins DL. Clinical Significance and Interpretation of Antinuclear Antibodies. West J Med, : Nakamura RM, Tan M. Recent Progress in the Study of Autoantibodies to Nuclear Antigens. Human Pathology No.1: Hardin JA et al. The Molecular Biology of Autoantibodies. Arthritis Foundation Atlanta GA Chapter 7: Maddison PJ et al. Antibodies to nrnp, Sm, Ro(SSA), and La(SSB) detected by ELISA: their specificity and inter-relations in connective tissue disease sera. Clin Exp Immunol, : Harley JB, Yamagata H, Reuchlin M. Anti-La/SSA Antibody is Present in Some Normal Sera and is Coincident with Anti-Ro/SSA Precipitins in Systemic Lupus Erythematosus. J Rheumatol, : Reichlin M. Clinical and Immunological Significance of Antibodies to Ro and La in Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism, , No.7: Mitsuhiko Yasuma et al. Clinical Significance of IgG Anti-Sm Antibodies in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. J Rheumatol, :4: Aeschlimann A et al. Anti-Scl-70 antibodies detected by immunoblotting in progressive systemic sclerosis: specificity and clinical correlations. Annals of Rheumatic Diseases, : Cornin ME, Miller FW, Plotz PH. Polymyositis and Dermatomyositis. Arthritis Foundation Atlanta GA Chapter 21: Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield Tan EM et al. A critical evaluation of enzyme immunoassays for the detection of antinuclear antibodies of defined specificities. Arthritis and Rheum. 1999; 42 (3): Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Hersteller: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Autorisierter Repräsentant: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: DEU July 2012 Revision 1 QUANTA Lite et INOVA QUANTA Lite et INOVA Diagnostics sont des marques déposées Copyright 2011 Tous droits réservés 7