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1 Frank Falinski (Autor) Überproduktion von Subkomplexen der F420H2- Dehydrogenase aus Archaeoglobus fulgidus und abschließende Untersuchungen zur Verbereitung von Methanophenazin in methanogenen Archaea Copyright: Cuvillier Verlag, Inhaberin Annette Jentzsch-Cuvillier, Nonnenstieg 8, Göttingen, Germany Telefon: +49 (0) , Website:

2 INHALTSVERZEICHNIS I Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis VI 1. Einleitung 1 2. Material und Methoden Organismen und Plasmide Nährmedien, Puffer und Stammlösungen Medien für E. coli LB (Luria-Bertani)-Medium SOB-Medium SOC-Medium MI ( maximal induction )-Medium Medium für Ml. tindarius Vitaminlösung Spurenelementlösung Medium für A. fulgidus Mineralienelexier Titan-(III)-Citrat-Lösung Pufferlösungen Waschpuffer für anaerobes Arbeiten Tris-Puffer Amylose-Resin Medienzusätze Zellanzucht Massenanzucht von Ml. tindarius Anzucht von Escherichia coli Anzucht für Plasmidpräparationen Anzucht im 10 l-maßstab Messung der optischen Dichte Ermittlung von Wachstumsparametern Bestimmung des ph-wertes Stammhaltung Reinheitskontrollen Standardtechniken für das Arbeiten mit Nukleinsäuren Vorbehandlung von Geräten und Lösungen Isolierung chromosomaler DNA mit CTAB Isolierung von Plasmid-DNA Schnellpräparation von DNA Präparative Plasmidisolierung Plasmid-Schnellpräparation Schnelle Plasmid-Isolierung aus E. coli ( Cracking ) Reinigung und Konzentrierung von Nukleinsäuren Phenol/Chloroform-Extraktion Fällung von Nukleinsäuren Mikrodialyse von Nukleinsäuren 30

3 II INHALTSVERZEICHNIS Reinigung von DNA durch Absorption an Glasmilch Reinigung von PCR-Produkten Konzentrationsbestimmung und Reinheitskontrolle von DNA Auftrennung von DNA-Fragmenten Agarosegelelektrophorese Größenbestimmung von Nukleinsäuren Polymerasekettenreaktion Enzymatische Modifikation von DNA Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen Dephosphorylierung von Vektor-DNA Herstellung von glatten Enden und Phosphorylierung von 5 - Hydroyl-Enden bei DNA-Fragmenten Ligation von DNA-Fragmenten Übertragung von DNA in E. coli durch Transformation oder Elektroporation und Selektion rekombinanter Klone Herstellung kompetenter Zellen zur Transformation Herstellung kompetenter Zellen für die Elektroporation Transformation durch Hitzeschock Transformation durch Elektroporation Blau-Weiß-Test zur Selektion rekombinanter Klone, die ein Insert im Vektor aufweisen (weiß) Sequenzierung von DNA Analyse der Sequenzdaten Heterologe Genexpression in E. coli Heterologe Expression mit dem pet-system Heterologe Expression mit dem pask-system Arbeiten mit Proteinen Einengen und Entsalzen von Proteinlösungen mittels Centrisartröhrchen Bestimmung der Proteinkonzentration Bestimmung der Molekularmassen von Proteinen Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) von Proteinen Native Gradienten-PAGE Silberfärbung Rekonstitution heterolog produzierter Proteine aus inclusion bodies Rekonstitution von Proteineinschlußkörpern (YANO et al., 1995, 54 modifiziert) Verdünnung Rekonstitution durch das Vectrase-CD-System Hitzefällung Reinigung von Proteinen Chromatographie an Strep-Tactin 55

4 INHALTSVERZEICHNIS III Anionen-Austausch-Chromatographie an DEAE-Sephacel Affinitätschromatographie an Hydroxylapathit Reinigung und Synthese von Cofaktoren Reinigung von F Synthese des Heterodisulfids Optisch-enzymatische Aktivitätsbestimmungen Aktivitätsbestimmung der membrangebundenen Hydrogenase Reduktion von F Bestimmung der F 420 H 2 -Dehydrogenase-Aktivität Bestimmung der Heterodisulfid-Reduktase-Aktivität Bestimmung der F 420 H 2 :Heterodisulfid-Oxidoreduktase-Aktivität Reinigung redox-aktiver Substanzen aus Cytoplasmamembranen verschiedener methanogener Organismen Zellaufschluß und Methoden der Membranpräparation Gefriertrocknung von Cytoplasmamembranen Abtrennung der redox-aktiven Substanz Analytische Trennung über HPLC Präparative Reinigung des Methanophenazins aus Ml. tindarius Spektroskopische Methoden Massenspektroskopie H-NMR-Spektroskopie C-NMR-Spektroskopie Spektralphotometrische Untersuchungen Dioden-Array-Photometer UV-Vis-Spektren der Isooktanrohextrakte Aufnahme von UV-Vis-Spektren des Methanophenazins in oxidierter und reduzierter Form Kopplung der Teilreaktionen des F 420 H 2 :Heterodisulfid- Oxidoreduktase-Systems durch Methanophenazin Chemikalien, Biochemikalien und Gase Experimente und Ergebnisse Klonierung des Gens fqob/c der F 420 H 2 :Chinon-Oxidoreduktase aus A. fulgidus in E. coli Amplifizierung des Gens fqob/c der F 420 H 2 :Chinon-Oxidoreduktase aus A. fulgidus mittels PCR Molekularbiologische Untersuchung des Gens fqob/c Klonierung und Sequenzierung des Gens fqob/c in pzero Umklonierung des Gens fqob/c in pet-21c Klonierung des Gens fqod der F 420 H 2 :Chinon-Oxidoreduktase aus A. 84 fulgidus in E. coli Amplifizierung des Gens fqod der F 420 H 2 -Chinon-Oxidoreduktase aus A. fulgidus mittels PCR 85

5 IV INHALTSVERZEICHNIS Molekularbiologische Untersuchung des Gens fqod Klonierung und Sequenzierung des Gens fqod in pzero Umklonierung des Gens fqod in pet-21c Klonierung und Sequenzierung des Gens fqod in pask-iba Gemeinsame Klonierung der Gene fqob/c und fqod der F 420 H 2 :Chinon-Oxidoreduktase aus A. fulgidus in E. coli Amplifizierung der Genbereiche fqob/c und fqod Molekularbiologische Untersuchung des Genklusters fqob/cd Klonierung und Sequenzierung der Gene fqob/cd in pzero Umklonierung der Gene fqob/cd aus pzero-2 in pet-21c Klonierung und Sequenzierung der Gen fqob/c und fqod in pask- IBA3 und pask-iba Heterologe Expression der rekombinanten Plasmide in verschiedenen E. coli-stämmen Heterologe Expression verschiedener rekombinanter Plasmide in dem E. coli-stamm Bl21(DE3) Heterologe Expression verschiedener rekombinanter Plasmide in dem E. coli-stamm Rosetta(DE3) Versuche zur Vermeidung der Bildung von Proteineinschlußkörpern Anzucht bei niedrigen Temperaturen Zellaufschluß im Hochsalzpuffer (Amylose Resin) Rekonstitution durch Dialyse (YANO et al., 1995, modifiziert) Methoden zur Anreicherung der heterolog produzierten Untereinheiten der F 420 H 2 -Dehydrogenase Anreicherung durch Hitzefällung Anreicherung durch Säulenchromatographie Chromatographie an DEAE-Sephacel Chromatographie an Hydroxylapathit Chromatographie an Strep-Tactin Proteineinschlußkörper als Anreicherungsschritt Rekonstitution aus Proteineinschlußkörpern Verbreitung von Methanophenazin in methanogenen Archaea Stand der Vorarbeiten Zellanzucht von Ml. tindarius in Massenkultur Extraktion des Phenazin-Derivats aus Membranen von Ml. tindarius Präparative Reinigung des Phenazin-Derivats aus Ml. tindarius Strukturaufklärung des Phenazin-Derivats aus Ml. tindarius Massenspektroskopie C-NMR-Spektroskopie H-NMR-Spektroskopie 132

6 INHALTSVERZEICHNIS V 3.14 Reaktionen von verschiedenen Elektronenakzeptoren und-donatoren mit gewaschenen Membranen von Ml. tindarius Kopplung der Teilreaktionen des F 420 H 2 :Heterodisulfid- Oxidoreduktase-Systems durch Methanophenazin Untersuchung gewaschener Membranen weiterer methanogener Organismen auf das Vorhandensein von Phenazin-Derivaten HPLC der Isooktanrohextrakte H-NMR-Spektroskopie der Isooktanextrakte Diskussion Betrachtungen zum Stoffwechsel der untersuchten Archaea Sulfatreduktion durch A. fulgidus beim Wachstum mit 143 Laktat + Sulfat Methanbildung durch methanogene Archaea Methanogenese beim Wachstum mit Methanol ohne H Methanogenese beim Wachstum mit H 2 /CO Methanbildung beim Wachstum mit Acetat Energiekonservierende Systeme der methanogenen Archaea Ionentranslozierende Reaktionen im H 2 /CO 2 Stoffwechsel Ionentranslozierende Reaktionen bei der Methanolumsetzung Funktion von Methanophenazin im Acetatstoffwechsel Betrachtungen zur Evolution des Komplex I aus Bacteria und Archaea Der Reaktionsmechanismus der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase 171 und der F 420 H 2 -Dehydrogenase Reaktionsmechanismus der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase Möglicher Reaktionsmechanismus der F 420 H 2 -Dehydrogenase Expressionen in dem E. coli-stamm Rosetta(DE3) Betrachtungen zum Thema inclusion bodies Rekonstitution aus Proteineinschlußkörpern mit Hilfe des Vectrase- CD-Systems Phenazine aus Bacteria und Archaea und ihre Funktion Chemische und biologische Synthese von Phenazin-Derivaten Zusammenfassung Literaturverzeichnis 188