Dissertation. Zur Erlangung des akademischen Grades Doctor Rerum Naturalium ( Dr. rer. nat.) vorgelegt der

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1 Molekulare und funktionale Charakterisierung der neuronalen bhlh Transkritptionsfaktoren NSCL-1 und NSCL-2 Dissertation Zur Erlangung des akademischen Grades Doctor Rerum Naturalium ( Dr. rer. nat.) vorgelegt der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Marcus Krüger geboren am Gutachter 1. Prof.Dr.Dr. Thomas Braun 2. Prof. Dr. Reuter 3. Prof. Dr. Gundelfinger, Magdeburg urn:nbn:de:gbv: [

2 Diese Dissertation ist von der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg genehmigt worden. Hiermit versichere ich, dass die vorliegende Dissertation selbstständig verfasst und keine anderen als angegebenen Hilfsmittel verwendet wurden. Die Passagen der Arbeit, die anderen Schriften entnommen wurdensin, wurden unter Angabe der Quelle kenntlich gemacht. Marcus Krüger

3 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Die Entwicklung des Nervensystems Determinierung Migration Differenzierung, wichtige Schritte zur Generierung des Nervensystems Das Gehirn reguliert den Energiehaushalt Mehr Gewicht weniger Reproduktivität? Die bhlh Superfamilie von Arabidopsis thaliana bis zum Zebrafisch Die NSCL Subfamilie Ziel der Arbeit Material und Methoden Material Chemikalien und Verbrauchsmaterial Enzyme Lösungen und Medien Verwendete Kits Bakterienstämme Mausstämme Verwendete Vektoren Proben für in situ und whole mount Hybridisierungen Verwendete Antikörper Southern- Blot Hybridisierungsproben Oligonukleotide Methoden Sterilisation von Lösungen und Geräten Extraktion von Nukleinsäuren Extraktion genomischer DNA aus Geweben Präparation von RNA aus Geweben mittels LiCl-Harnstoff-Extraktion. 24

4 Präparation von gewebespezifischer mrna Reinigung von Nukleinsäurelösungen Chloropanextraktion Ethanolfällung Konzentrationsbestimmung von wässrigen Nukleinsäurelösungen Elektrophoresen von Nukleinsäuren Agarosegelelektrophorese von DNA Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Elektroelution Klonierung von DNA Ligation von DNA-Fragmenten Herstellung von PEG-transformationskompetenten E.coli Zellen Transformation von E. coli-zellen mit Plasmiden Kultivierung von E. coli-stämmen und Klonen Präparation von Plasmid-DNA Midi-Präparation von Plasmid-DNA Sequenzierung doppelsträngiger DNA Polymerase-Kettenreaktion (PCR) RT-PCR Transfer von Nukleinsäuren auf Nylonmembranen Transfer von DNA (Southern-Blotting) Markierung von Nukleinsäuren Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten In vitro Transkription zur Synthese von RNA-Proben Hybridisierungstechniken Hybridisierung membrangebundener Nukleinsäuren Whole mount in situ Hybridisierung von Embryonen Whole mount in situ Hybridisierung auf Gewebeschnitten Autoradiographie Autoradiographie von hybridisierten Membranen Präparation von Embryonen und Geweben Präparation von Embryonen Kardiale Perfusion mit PFA Histologische Methoden... 40

5 Vibratomschnitte Gelatine/Albumin Einbettung Agarose Einbettung freischwimmende Schnitte Paraffin-Gewebeschnitte Kryotomschnitte Hämatoxylin/Eosin-Färbung Immunhistochemische Anfärbung Vorbereitung für Paraffin und Kryotomschnitten Antikörperanfärbung Protokoll b-galaktosidase Histochemie Darstellung mitotisch aktiver Zellen mittels BrdU Inkorporation Array-Hybridisierung Genotypisierung von Embryonen Photodokumentation Ergebnisse Analyse der Funktion von Genen in der Mausentwicklung NSCL-2 homozygote Mäuse sind infertil und zeigen eine adulte Obesität Strategie zur Inaktivierung des NSCL-2 Gens Genotypisierung von NSCL-2 Mausmutanten Das inserierte b-galaktosidase Gen spiegelt das endogene Expressionsmuster von NSCL-2 wieder NSCL-2 wird in verschieden Bereichen des zentralen und peripheren Nervensystems exprimiert Homozygote NSCL-2 Mutanten zeigen keine Veränderung des Expressionsmusters des markierten Gens NSCL-2 ist stark in verschieden Bereichen des Hypothalamus während der Embryonalstadien E14,5 E18,5 exprimiert NSCL-2 defiziente Mäuse weisen eine reduzierte Anzahl Gonadotropin-Releasing Hormon positiver Neurone auf... 58

6 Embryonale Entwicklungsstadien Postnale Verteilung GnRH positiver Zellen NSCL-2 defiziente Mäuse zeigen nach der Pubertät einen erhöhten Nahrungsbedarf Das Neuropeptid Y NPYY1 Rezeptor System NSCL-2-/- Mutanten zeigen nur im zerebralen Kortex eine reduzierte Anzahl NPY positiver Neurone Reduktion des NPY Y1 Rezeptors in NSCL-2 defizienten Mutanten NSCL-2 mutante Mäuse zeigen eine fehlende Anpassung der Expression von NPY Y1 Rezeptoren bei Nahrungsmangel Reduktion POMC (ACTH) positiver Zellen im Nucleus arcuatus bei NSCL-2 homozygoten Mutanten Analyse des Leptinrezeptors Analyse des NSCL-2 Promotors Ungerichtete Insertion des NSCL-2 Zielvektors Hohe Konservierung des NSCL-2 Promotors zwischen Maus und Mensch NSCL-1 homozygote Mutanten zeigen keinen offensichtlichen Phänotyp Generierung homozygoter NSCL-1 Mutanten Initiale NSCL-1 Expression ab dem Somitenstadium (E8,75) Doppelmarkierung von mitotisch aktiven und NSCL-1/LacZ positiven Zellen Die Differenzierung NSCL-1 exprimierender Neurone in NSCL-1 mutanten Embryonen zeigt keine Auffälligkeiten NSCL-1 und NSCL-2 zeigen unterschiedliche Expressionsmuster während embryonaler Entwicklungsstadien NSCL-1 und NSCL-2 werden während der Entwicklung des Kortex in unterschiedlichen Domänen exprimiert Analyse der Expression von NSCL-1 und NSCL-2 im Kleinhirn Expression von NSCL-1 und NSCL-2 in der Retina Expression von NSCL-1 und NSCL-2 im olfaktorischen Epithel Expression von NSCL-1 und NSCL-2 im adulten ZNS... 93

7 3.4.6 NSCL-1 Nullmutanten zeigen keine offensichtlichen Malformationen im ZNS NSCL-1 und NSCL-2 doppelt homozygote Mutanten sind nicht lebensfähig NSCL-1xNSCL-2 Doppelmutanten zeigen keine Störungen früher Differenzierungsvorgänge des ZNS Doppelt homozygote NSCL-1xNSCL-2 Mutanten sterben kurz nach der Geburt Analyse von NSCL-1 x NSCL-2 Doppelmutanten durch in situ Hybridisierung und Immunhistochemie Kleinhirn Neokortex Die Anzahl mitotisch aktiver Zellen in NSCL-1xNSCL-2 Doppelmutanten ist reduziert Retina Olfaktorisches Epithel Die Analyse des Phänotyps NSCL-1xNSCL-2 doppelt mutanter Mäuse mittels DNA-Array-Hybridisierung Diskussion NSCL-2/LacZ positive Zellen spiegeln das endogene NSCL-2 Expressionsmuster wieder NSCL-1 und NSCL-2 sind nicht notwendig für die Differenzierung kranialer Ganglien Expressionsanalyse von NSCL-1 und NSCL NSCL-1 und NSCL-2 defiziente Mausmutanten zeigen keine Auffälligkeiten bei der Bildung und der Gewebsarchitektur des Kortex Die Rolle von NSCL-1 und NSCL-2 im Kleinhirn Welche Funktion kommt NSCL-1 und NSCL-2 in der Retina und im 126 Riechepithel zu NSCL-2 defiziente Mutanten sind infertil und zeigen Störungen bei der Gewichtsregulation

8 4.4.1 Die Entstehung eines hypogonadalen Hypogonadismus in NSCL-2 mutanten Mäusen Störungen der Gewichtsregulation in NSCL-2 mutanten Mäusen Die Analyse des Maus NSCL-2 Promotors ergab Homologien zum humanen NSCL-2 Promotor Analyse der NSCL-1xNSCL-2 Doppelmutanten Störungen der Differenzierung des olfaktorischen Neuroepithels bei NSCL-1xNSCL-2 Doppelmutanten Geringe Störungen der Großhirnrinden- und Kleinhirn- Entwicklung bei NSCL-1xNSCL-2 doppelt mutanten Tieren NSCL s und Zellzyklusregulation Ausblick... Literatur Anhang NSCL-2 Promotorsequenz... Tafeln verschiedener Antikörperanfärbungen Abkürzungen Curriculum vitae Tagungsbeiträge und Publikationen Zusammenfassung