2. Chemische Synthese von Peptiden

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1 2. Chemische Synthese von Peptiden eute ist die chemische Synthese von Peptiden und Proteinen mit Molekulargewichten von Da möglich. Zwei Entwicklungen machten dieses im Wesentlichen möglich: - Kupplungsausbeuten von > 99,5% - Razemisierungsfreiheit der Kupplung eute werden Peptide und Peptidomimetika auf zwei Wegen synthetisch hergestellt: 1) Flüssigphasenchemie 2) Festphasenchemie Beide Methoden beruhen auf einer ausgeklügelten Schutzgruppenchemie. So müssen die Seitenketten der Aminosäure permanent geschützt werden. Die α- Aminogruppe wird temporär geschützt und die Carbonsäurefunktion wird zur Kupplung aktiviert. 2.1 Die α -Schutzgruppe Für die Kupplung muss die Aminogruppe der Aminosäure geschützt werden, da sonst nach Aktivierung der Säure die Aminosäure mit sich selber reagieren würde. ach der Kupplung muss diese Schutzgruppe schnell und mild abspaltbar sein, damit eine weitere Kupplung erfolgen kann. Die Synthese von Peptiden wird somit vom C- zum -Terminus durchgeführt. Als temporäre α-aminoschutzgruppe sind heute zwei Urethan-Schutzgruppen gebräuchlich. 1) tert-butoxycarbonyl (Boc) abspaltbar mit + 2) Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) abspaltbar mit sek. Aminen 1

2 Die Fmoc-Schutzgruppe wird unter Bildung einer Carbanion-Zwischenstufe nach einem E 1cb -Mechanismus abgespalten. Die Boc-Schutzgruppe eliminiert nach E 1 über eine Carbokation-Zwischenstufe (Abb. 1). Abb. 1 Entschützung der Boc-Schutzgruppe (links) nach E 1 und der Fmoc-Schutzgruppe (rechts) nach E 1cb (aus R. Brückner, Reaktionsmechanismen). 2

3 2.2 Die Schutzgruppen der Seitenketten Die Schutzgruppen der Seitenketten müssen orthogonal sein. Diese Schutzgruppen müssen während der Entschützung der α -Schutzgruppen (Boc oder Fmoc) stabil, am Ende der Synthese aber abspaltbar sein Ser, Thr und Tyr Für die Boc- und Fmoc-Synthesestrategie schützt man die -Gruppen meist als Ether. Im Fall der Boc-Chemie wird das Peptid am Ende mit F entschützt und vom arz abgespalten. Im Fall eines Fmoc-Syntheseprotokolls wird zum Schluss mit Trifluoressigsäure TFA (90%) abgespalten. Im Boc-Syntheseprotokoll werden daher Schutzgruppen verwendet, die bedingt säurestabil sind. Sie überleben die temporäre Entschützung der Boc-Schutzgruppe mit TFA, werden aber mit F abgespalten. Es wird die Benzoyl-(Bz)-Schutzgruppe eingesetzt. Im Fmoc-Syntheseprotokoll wird der tert-butylether verwendet. Dieser ist während der temporären Entschützung mit Piperidin stabil, wird aber am Ende mit TFA gespalten. Für die Aminosäure Tyr wechselt man oft auf die 2,6-Dichlorbenzylschutzgruppe Asp und Glu ier werden im Fall der Boc-Chemie die Benzylester (Bn) verwendet. Für die Fmoc- Chemie kommt der tert-butylester zum Einsatz. 2 C 2 C Lys Die ε-aminogruppe von Lysin muss unbedingt geschützt werden. Im Boc-Syntheseprotokoll wird hierzu die Fmoc-Gruppe verwendet. Alternativ kann die 2-Chlorbenzyloxycarbonylschutzgruppe (2ClZ) eingesetzt werden. Diese ist labiler als die klassische Z- Schutzgruppe (Z = Benzyloxycarbonylschutzgruppe). 3

4 2 Cl 2 C C Wird Fmoc-Chemie betrieben, so verwendet man meistens die Boc-Schutzgruppe Arg Die Guanidiniumgruppe muß mit ihrem pk a -Wert von 12.5 nicht unbedingt geschützt werden. Allerdings ist dann die Löslichkeit schlecht. Praktisch werden meistens Benzolsulfonylschutzgruppen verwendet. Innerhalb der Boc-Chemie ist die 4-Toluolsulfonyl (Tos) und die Mesitylen-2-sulfonyl-Gruppe (Mts) beliebt. 2 C S 2 C Tos Mts S Betreibt man Fmoc-Chemie, so wird die Mtr-Schutzgruppe oder die Pmc- Schutzgruppe verwendet. 2 C S 2 C S Mtr C 3 Pmc Die Säureempfindlichkeit dieser Schutzgruppen nimmt in der Reihe wie folgt ab: Pmc > Mtr >> Mts > Tos is Im Fall des istidins wird entweder τ oder π geschützt. So kann das τ einfach Tosyl geschützt werden. Im Boc-Syntheseprotokoll wird hingegen meistens die 2,4- Dinitrophenylschutzgruppe (DP) eingesetzt. Im Fall der Fmoc-Strategie wird τ 4

5 häufig Boc oder einfach Trityl (Tr) geschützt. Für τ wird häufig die BM- (= Benzyloxymethyl) oder die Bum-Schutzgruppe (= tert-butoxymethyl) verwendet. Die Verwendung von π Schutzgruppen reduziert das Razemisierungsrisiko. 2 C 2 C 2 C τ π 2 C 2 C Tr 2 SC 2 C 2 S 2 BM is 2 DP 2 is Bum Asn und Gln Diese Seitengruppen werden meist ungeschützt gelassen. Allerdings kann es zu Dehydratisierung kommen was dann itrile ergibt Trp und Met Diese Seitenketten werden in der Regel nicht geschützt Cys Es handelt sich um eine sehr problematische Aminosäure, deren Schützung unbedingt erforderlich ist. Für Boc-Chemie bietet sich die Acetamidomethyl- Schutzgruppe (Acm) an. Sie ist ebenfalls kompatibel mit der Fmoc-Chemie. Die Acm- Schutzgruppe wird mit g 2+ - oder Ag + -Salzen gespalten. Auch die mit Säure abspaltbare Tr-Gruppe wird für Cys gerne verwendet. 5

6 2 C S 2 C S Tr Acm 2.3 Acylierungen Um eine Peptidbindung bilden zu können, muss die Carboxylatfunktion aktiviert werden. Die unterschiedlichen Carboxylatderivate weisen eine unterschiedliche Resonanzstabilisierung auf, welche die Reaktivität herabsetzt. Das Carboxylat mit ca. 30 kcal/mol, das Amid 22 kcal/mol und der Ester 14 kcal/mol sind relativ unreaktiv. Anhydrid und Säurechlorid haben kaum Resonanzstabilisierung und sind aus diesem Grund sehr reaktiv. Ziel der Carbonsäureaktivierung muss es also sein, Derivate zu erzeugen, in denen die Resonanzstabilisierung nur minimal ist < 2 < R < < Cl Reaktivität nimmt zu Der Angriff des ukleophils ergibt eine Tetraederzwischenstufe, in der die Resonanzstabilisierung nicht mehr existiert. Je größer der Verlust an Resonanzenergie, umso höher liegt der Übergangszustand der Reaktion und umso unreaktiver ist das Derivat (später Übergangszustand). Die Grundlagen der nukleophilen Substitution am Carboxylat Kohlenstoff sollten im Lehrbuch (z. B. im R. Brückner Reaktionsmechanismen) nachgelesen werden. 6

7 Abb. 2 Energieprofil (mit Mesomeriestabilisierung) zur Bildung der Tetraederzwischenstufe aus einem Carbonsäurederivat. Ein weiterer Punkt, der die Reaktivität beeinflusst, ist die Stabilisierung der tetraedrischen Zwischenstufe. Je stärker die Stabilisierung, umso energetisch tiefer liegt der Übergangszustand und umso schneller ist die Reaktion. Da die tetraedrischen Zwischenprodukte oft negativ geladen sind, was sich im Übergangszustand partiell bereits bemerkbar macht, wirken sich sehr elektronenziehende Substituenten (z. B das Cl im Säurechlorid) stabilisierend und damit ratenbestimmend aus. Auch der anomere Effekt stabilisiert die Tetraederzwischenstufe sehr stark. Der anomere Effekt ist in Strukturelementen et-c-et (et = eteroatom) bedeutsam. Es handelt sich um eine n-σ* Wechselwirkung (Abb. 3). Abb. 3 Anomerer Effekt. 7

8 Carbonsäuren werden für die Amidbindungsbildung daher zunächst in reaktive Substanzen überführt. Sehr bekannt sind die Anhydride, die Pentafluorphenylester (A), Thioester (B, aktiviert wegen der geringen eigung des Schwefels Doppelbindungen zu bilden), Imidazolide (C) und natürlich die Aktivierung mit ilfe des Steglich-Reagenzes Dimethylaminopyridin (D, DMAP). Beim Steglich-Reagenz würde eine Resonanz zu einer doppelt positiv geladenen Teilstruktur führen was energetisch sehr ungünstig ist F F F A F F S B C D Eine bekannte Methode zur Aktivierung von Carbonsäuren bietet das Mukaiyama- Verfahren (Schema 1). ier entsteht über Meisenheimer-analoge Zwischenstufen (nukleophile aromatische Substitution) ein Aktivester, der leicht mit ukleophilen reagiert. Die Aktivierung findet hier in situ statt. Schema 1 Carbonsäureaktivierung mit dem Mukaiyama-Reagenz. Der Mechanismus der Carbonsäureaktivierung soll am Beispiel der Imidazolide dargestellt werden (Schema 2). ier wird ausgehend von der Carbonsäure mit Carbonyldiimidazol das Imidazolid erzeugt. 8

9 Schema 2 Carbonsäureaktivierung über ein Imidazolid. Man informiere sich über den Mechanismus der Bildung von Säurechloriden mit Thionylchlorid und xalyldichlorid, sowie mit der Frage warum DMF die Bildung eines Säurechlorids aus einer Carbonsäure und Thionylchlorid katalysiert. 2.4 Kupplungsmethoden Aktivierung mit DCC In der Peptidchemie wird nur selten ein stabiles aktiviertes Carbonsäurederivat eingesetzt. Meist wird die α - und Seitenketten-geschützte Aminosäure direkt in situ vor der Kupplung aktiviert. ierzu wird häufig ganz klassisch ein Gemisch aus DCC + Bt eingesetzt. DCC aktiviert die Carbonsäure unter Bildung eines sehr reaktiven Acylisoharnstoffs. Dieser regiert mit dem Bt zu einem Reaktivester, in dem ein sehr großer Teil der anfänglichen Reaktivität konserviert ist (Schema 3). Dieser Reaktivester reagiert dann mit der ukleophil, z. B mit der freien Aminogruppe einer zweiten Aminosäure. Eine direkte Umsetzung des Acylisoharnstoffs ist wenig ratsam, 9

10 da die Reaktivität so hoch ist, das Razemisierung eintritt. Außerdem erfolgt ein, wenn auch langsamer [1,3]-Acylshift, der zu einem unreaktiven Acylharnstoff führt (Schema 3E). Schema 3 Carbonsäureaktivierung mit DCC. Alternativ zum DCC wird häufig Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI) verwendet, da der sich hier bildende arnstoff löslicher ist und leichter abgetrennt werden kann. Bt beschleunigt die Reaktion, unterdrückt die Razemisierung und hilft das die Asn und Gln Seitengruppen nicht dehydratisieren. Mit ilfe von DCC lassen sich also die Aminosäuren in situ in relativ stabile Aktivester überführen wie: Pentafluorphenyl- (Schema 3C) oder eben Bt-Ester (Schema 3D). Diese Aktivester sind so stabil, dass sie isoliert und chromatographiert werden können Aktivierung mit BP Sehr modern und beliebt ist neben der DCC-Methode, die Kupplung mit einem Gemisch aus BTU/Bt oder BP (BP = Benzotriazolyloxytris[dimethylamino]- 10

11 phosphoniumhexafluorophosphat), auch bekannt als Castros-Reagenz. Wichtig ist, dass das Gegenion sehr wenig nukleophil ist, deshalb das PF 6 -. P PF 6 BP C PF 6 BTU Das BP-Reagenz ist stabil, nicht hygroskopisch und sehr gut löslich in organischen Lösungsmitteln. Generell ist das BP-Reagenz wesentliche effizienter als die Kombination DCC/Bt. Ein achteil ist, dass während der Reaktion examethylphosphorsäuretriamid entsteht, das wegen seiner Carcinogenität gefürchtet wird. Das neue Reagenz PyBop schafft hier Abhilfe. Dieses Reagenz besitzt statt Methylgruppen, Pyrrolidineinheiten. PF 6 P Br P PF 6 Br P PF 6 PyBP PyBroP BroP Andere neue Reagenzien enthalten überhaupt keine xybenzotriazole mehr. ierzu gehören BroP oder auch PyBroP. Diese Reagenzien kuppeln vor allem sekundäre Amine wie -Methylaminosäuren sehr effizient. Weitere Reagenzien, die sehr beliebt sind, sind BTU (BTU = 2-(1-benzotriazol- 1-yL)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat) oder auch einfach die Carbonsäurechloride oder -fluoride. Besonders aktiv ist das neue Reagenz ATU. 11

12 C PF 6 ATU F F F F Die Synthese der Kupplungsreagenzien ist beispielhaft für BP in Schema 4 gezeigt. Schema 4 Synthese des BP-Reagenz. Manchmal ist es nötig, während der Peptidsynthese gezielt eine Aminogruppe einer Lys-Seitenkette freizusetzen, um z. B eine Zyklisierung einzuleiten. ierzu benötigt man eine weitere orthogonale Schutzgruppe. In der Regel wird hierfür die Allyloxycarbonylgruppe (Alloc) verwendet. P 1 P 2 Bu 3 Sn PdCl 2 (PPh 3 ) 2 2 P 1 P Festphasensynthese Bei der Festphasensynthese wird das Peptid an einem Polymer, einem festen Träger, hergestellt. Durch die Immobilisierung können die verwendeten Reagenzien sehr schnell ausgewaschen werden. Ferner können Sie in großem Überschuss zugesetzt werden, wodurch die Kupplungsausbeuten deutlich gesteigert werden können. Die Immobilisierung erlaubt es die Peptidsynthese zu automatisieren. So 12

13 gibt es heute kommerzielle Peptidsynthesegeräte mit denen Peptide bis zu einer Länge von 100 Aminosäuren (praktisch 50 Aminosäuren) hergestellt werden können. Bei der Peptidsynthese wird an der festen Phase eine repetitive Sequenz aus Kupplung, Entschützung der temporären Schutzgruppe und erneuter Kuppelung durchgeführt (Abb. 4). Abb. 4 Typische Reaktionssequenz zum Aufbau eines Peptids an der festen Phase. 13

14 Besondere Beachtung muss dem arz-polymer und dem Linker geschenkt werden. Der Linker ist das Bindeglied zwischen dem polymeren Träger und dem Peptid. Dieser Linker muss am Ende, ebenso wie die permanenten Schutzgruppen, spaltbar sein, um das Peptid freizusetzen. Im Fall der Boc-Chemie muss die Spaltung demnach mit F und im Fall der Fmoc-Chemie mit ca. 80%-iger TFA realisierbar sein. Der Linker legt fest, ob nach der Abspaltung eine C-terminale Carbonsäure oder eine andere Gruppe wie z.b. ein Amid erhalten wird. Im Fall des arzes, also des Polymers, sind die Quell-Eigenschaften bedeutsam sowie die Beladung und die Inertheit gegenüber den Reagenzien. Das arz muss gut quellen, damit die Reagenzien leicht an die Synthesestelle gelangen können. Man muss sich das Polymer als ein eng geknüpftes Maschennetzwerk vorstellen, in dem das Peptid hergestellt wird Die feste Phase In der Regel handelt es sich um Polystyrol, das mit 1% m-divinylbenzol versetzt (crosslinking) wurde. Die Funktionalisierung geschieht meist über eine Chlormethylierung. Zwischen die Chlormethylgruppe und die erste Aminosäure wird meist ein Linker gesetzt, der die Abspaltung des fertigen Peptides vom arz am Ende der Synthese erlaubt. Die wichtigsten arze sind: A) Wang-arze nennt man arze, die einen Wang-Linker zwischen dem Polystyrol und dem Peptid besitzen. Diese arze werden im Rahmen der Fmoc- Peptidsynthese eingesetzt und erlauben die Synthese von C-terminalen Carbonsäuren. Wang-arze enthalten einen p-alkoxybenzylesterlinker. Man erhält die Wang-arze durch Umsetzung der Chlormethylpolystyrole mit 4- ydroxybenzylalkohol. Die Abspaltung des fertigen Peptids erfolgt mit TFA. B) Rink-arze (4-(2,4 -Dimethoxyphenylhydroxymethyl-phenoxy-arze) sind entweder als Amid- oder Säure-arze erhältlich. Das Amid-arz liefert C-terminale Amide und wird für die Fmoc-Synthese eingesetzt. Das Rink-Säure-arz ermöglicht Peptidsynthese nach der Boc-Strategie. Es liefert C-terminale Carbonsäuren. 14

15 Der Rink-Säure-Linker ist, ebenso wie der Chlortrityl-Linker, so säurelabil, dass die Peptide z. B. mit verdünnter TFA vollgeschützt vom arz abgespalten werden können. Diese Fragmente können dann in der Fragmentkondensation eingesetzt werden. Wang-Linker Rink-Amid-Linker Fmoc Rink-Säure-Linker Cl Chlortrityl-arz Cl Cl 2 MBA-Amid-Linker Merrifield-arz 2 PAM-Linker xim-linker C) MBA- und PAM-arze: Die MBA = p-methylbenzhydrylamin- oder PAM = Phenalacetamidomethyl-arze werden ebenso wie das klassische Merrifield-arz im Rahmen der Boc-Peptidsynthese verwendet. Die Abspaltung der fertigen Peptide erfolgt am Ende mit F. Mit den MBA-arzen werden Peptidamide erhalten. Die PAM-arze liefern die Carbonsäuren. Will man mit ilfe der Boc-Strategie voll geschützte Peptide herstellen, so kann dieses mit xim-arzen erreicht werden. ier findet die Spaltung mit 3 oder 2-2 statt. 15

16 eben diesen Linkern, die mit unterschiedlich starken Säuren die Abspaltung des Peptides ermöglichen, gibt es eine große Auswahl anderer Linker, die eine völlig orthogonale Abspaltung mit z. B. Licht (itrobenzyl-arze) oder Pd(0) (Allyl-arze) ermöglichen. itrobenzyl-linker Br Allyl-Linker 2 Br Abb. 5 Abspaltung eines Peptids im vollgeschützten Zustand. Die Synthese erfolgte nach dem Fmoc-Protokoll an einem Sasrin-arz, welches dem Wang-arz sehr ähnlich ist Die Entschützung Man kann das Peptid mitsamt den Seitenketten-Schutzgruppen abspalten, wenn z. B. eine spätere Fragmentkondensation geplant ist. 16

17 Möglich ist auch, zunächst wenige orthogonale Schutzgruppen am Peptid abzuspalten, um z. B. zunächst eine Cyclisierung am arz durchzuführen. In den meisten Fällen wird man wohl das Peptid komplett am arz entschützen und dann auch gleich vom arz abspalten. Die komplette Entschützung und gleichzeitige Abspaltung vom arz erreicht man im Fall der Boc-Strategie mit flüssigem F, Trifluormethansulfonsäure (TFMSA) in TFA oder Br in Ac. Im Fall der Fmoc-Strategie wird TFA (ca. 80%ig) in C 2 Cl 2 verwendet. Für die F-Abspaltung wird eine spezielle Ausrüstung benötigt. In der Regel werden Abfangreagenzien (scavanger) zugesetzt, um reaktive Intermediate abzufangen, die das Peptid schädigen könnten. ier kommen Anisol, Ethandithiol, Dimethylsulfid, u. a. zum Einsatz. Schema 5 Beispiel für die Synthese eines zyklischen Peptids direkt am arz. 17

18 In Schema 5 ist beispielhaft die Synthese eines zyklischen Peptids an der festen Phase gezeigt. Das Peptid wird mit ilfe der Boc-Strategie an einem xim-arz synthetisiert. Eine Asparaginsäure und ein Lysin-Rest werden Fmoc geschützt. Diese Schutzgruppen werden nach der kompletten Peptidsynthese selektiv entschützt. Dann erfolgt die Cyclisierung mit dem Reagenz BP direkt am arz. Ganz zum Schluss wird vollständig entschützt und vom arz abgespalten. 2.6 Synthese von langen Peptiden und Proteinen Zur Synthese sehr langer Peptide oder von Proteinen mit unnatürlichen Aminosäuren existieren derzeit 4 Methoden: 1. Fragmentkondensation 2. Ligationen (native chemical ligation) 3. Int-/Ent-Systeme 4. Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine Fragmentkondensation Durch die normale Peptidsynthese sind Peptide mit einer Länge von Aminosäuren herstellbar. Längere Peptide neigen am arz zur Aggregation, was die Syntheseausbeute sehr deutlich reduziert. Man erhält dann uneinheitliche Produkte. Die Kupplungsausbeute lässt sich mit ilfe von Detektoren (Abspaltung der Fmoc- Gruppe) oder mit ilfe von inhydrin-tests überwachen. Bei der Segmentkondensation werden die Peptide vollständig geschützt isoliert. Dann werden die zwei Fragmente gekuppelt. Die Limitierungen liegen in zu schlechten Ausbeuten auch bedingt durch eine geringe Löslichkeit. Razemisierung der aktiven Aminosäure ist ebenfalls ein Problem Ligation von ungeschützten Peptidsegmenten Eine typische funktionelle Proteindomäne enthält 130 ± 40 Aminosäuren. ur 70 lassen sich heute am arz routinemäßig kuppeln und schon das erfordert viel Erfahrung. Chemische Ligation ermöglicht es zwei ungeschützte Peptidsegmente zu kuppeln. Man benötigt allerdings einen -terminalen Cysteinrest an der Kupplungsstelle. 18

19 Man synthesitsiert zunächst ein Peptid mit einem C-terminalen Thioester. Das zweite Fragment enthält -terminal ein Cystein. Werden beide Fragmente zusammengegeben, so setzt ein Thiolaustausch ein, in dessen Folge im Gleichgewicht auch das Thioester verknüpfte Produkt entsteht. Eine schnelle Umlagerung führt zum Trapping des Intermediats unter Ausbildung einer Peptidbindung. Es gibt mittlerweile auch Methoden, die es ermöglichen Peptide zu legieren ohne dass ein Cys-Rest anwesend sein muss. Ein Problem ist immer die Synthese des Thioesters vom Fragment 1. ier wird zumeist das Peptid durch Boc-Chemie assembliert, welches per Thioester mit dem arz verbunden ist. Dann wird das Peptid schrittweise aufgebaut und am Ende abgespalten. Der Thioester überlebt diese Schritte gut. Problematischer ist die Synthese der Thioester basierend auf der Fmoc-Chemie, da der Thioester den regelmäßigen Fmoc-Abspaltungen nicht standhält. Meist wird zunächst das Peptid hergestellt, welches dann mit Benzylbromid den in die Ligation einsetzbaren Thioester ergibt. Fmoc-Chemie muss unbedingt angewendet werden, wenn zum Beispiel glykosylierte Peptide legiert werden sollen. ier helfen die Säure und Base stabilen Safety- Catch -Linker von J. Ellman. Das Peptid wird am Safety-Catch -Linker mittels Fmoc- Chemie assembliert. Die letzte Aminosäure ist Boc geschützt. Das ist wichtig, da diese erst nach der Thioesterbildung entschützt werden kann. Das arz wird dann mit IC 2 C behandelt und so der Linker aktiviert. Die Abspaltung vom arz unter Ausbildung des Thioesters erfolgt mit Thiobenzylalkohol. Dann werden alle Schutzgruppen mit TFA abgespalten und das Peptid gereinigt. Die Ligation wird per PLC verfolgt. Die endgültige Charakterisierung erfolgt durch MS (ESI-MS) Int-/Ent-Systeme Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine Dieser Abschnitt wird zu einem späteren Zeitpunkt fertig gestellt. 19