Peptidsynthese, chemische Biologie und lichtgesteuerte Reaktionen. Dr. Ralph Wieneke Institut für f r Biochemie Goethe Universität t Frankfurt

Transkript

1 Peptidsynthese, chemische Biologie und lichtgesteuerte eaktionen Dr. alph Wieneke Institut für f r Biochemie Goethe Universität t Frankfurt

2 Peptidsynthese in Lösung Zeitaufwendig: Isolierung und einigung nach jedem Schritt geringe Ausbeute Verwendung eines Überschusses eagens zur Verbesserung der Ausbeute aktiviert PG X + 2 PG Kuppeln PG PG Entschützen 2 PG = protecting group eue Amidbindung

3 Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) TheobelPrizeinChemistry1984 for his development of methodology for chemical synthesis on a solid matrix obert Bruce Merrifield ockefeller University

4 Generelle Amidbindungsbildung in Lösung aktiviert PG X + 2 PG Kuppeln PG PG Entschützen 2 PG = protecting group eue Amidbindung an fester Phase PG X + 2 Kuppeln PG Entschützen 2 PG X + Kuppeln ligopeptid n PG

5 Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) 1. Synthese geschieht an der berfläche und innerhalb der arzkügelchen 2. arzkügelchen quellen, wenn das Lösungsmittel absorbiert wird: Synthese geschieht an mehrfachen berflächen innerhalb der Kügelchen Gebräuchliche arze für SPPS Polystyren (PS): quillt in nicht-polaren Lösungsmitteln; weit verbreitet; günstig Tentagel (PS-PEG): quillt in vielen Lösungsmitteln ( 2, Me, AC, DMF, DCM); teuer; geeignet für Bioassays am arz Aufbau PS Ph Ph Ph Ph Ph Ph

6 -terminale Schutzgruppe PG X tboc: (t-butoxycarbonyl-) X Fmoc: (fluorenylmethoxycarbonyl) X Bestimmt die Synthesestrategie an fester Phase!

7 tboc-strategie Boc Asp Gly Lys Linker TFA F F Cl F: sehr korrosiv und sehr giftig!

8 Fmoc-Strategie Fmoc Asp Gly Lys Linker Piperidin TFA TFA Fmoc-Abspaltprodukt ist UV-aktiv! eaktionskontrolle Beim Abspalten vom arz mit TFA: Verwendung von Scavangern (EDT, TIPS, Phenol, etc.) zum Abfangen reaktiver Zwischenprodukte und Vermeidung von ebenprodukten

9 Mmt Trt Seitenkettenschutzgruppen Alle Schutzgruppen abspaltbar mit TFA! Keine Schutzgruppen nötig Boc Pbf Trt tbu-ether tbu-ester

10 Aminossäureaktivierung Verwendung von Carbodiimiden, Phosphonium- und Uroniumsalzen C Chemische Strukturen Carbodiimide Uroniumsalze Phosphoniumsalze Bt Bt P PF 6 BF 4 oder PF 6 BTU PF 6 PG PG Aktivester gute Abgangsgruppe Bt

11 Automatisierte Festphasensynthese Aminosäurevorrat eaktionsgefäß mit Absaugvorrichtung Mikrowellenreaktor

12 Beispiel: Synthese von 9LQK S Fmoc 1. Entschützen 2. Kuppeln n 2 S S Entschützen: 20% Piperidin in DMF Kuppeln: 5-10 eq. AS/ BTU/ Base Abspalten TFA/ EDT/ Thioanisol/ 2 / Phenol 2 YCKSTEL C18-P-PLC 2 S Single Cys: labeln mit Fluorophor 2

13 Kupplungseffizienz und Ausbeuten Ausbeute Effizienz (%) 10-mer 20-mer 30-mer 40-mer 50-mer 60-mer

14 Synthese großer Peptide Fragment-Kupplungsstrategie ative chemical ligation (CL) beinhaltet die Kupplung von zwei ungeschützten Peptidfragmenten in wässriger Lösung und der Abwesenheit von Schutzgruppen (Kent, Science, 1994) S 2 Peptid A S 2 Peptid B Überschuss S Thiotransesterifikation 2 Peptid A 2 S Peptid B Chemoselektive eaktion Benötigt 1 Peptidthioester S/-Acylshift (Synthese via SPPS) Benötigt 1 Peptid mit -terminalen S Cysteinrest (rekombinant) 2 Peptid A Peptid B

15 Chemische Biologie Definition Chemische Biologie beinhaltet Chemie-basierte Werkzeuge, vor allem solche, die auf kleinen Molekülen beruhen, um biologische Systeme kontrollieren, verstehen und manipulieren zu können Zentrale Frage Wie kann man mit rganischer Chemie erausforderungen in Medizin und Biologie lösen? auptziele Identifizierung zellpermeabler organischer Substanzen, welche die Funktion von Proteinen beeinflussen, um molekulare Werkzeuge zur Untersuchung biologischer Fragestellungen bereitzustellen Beantwortung von Fragestellungen, die mit traditionellen Methoden der Biochemie nicht geklärt werden können

16 traceless protein modification by small high-affinity tags

17 cellular logistics understanding cellular processes in a quantitative and spatiotemporal way

18 the multivalent chelator head trista key advantages: nanomolar affinity (K D ~ 10 nm) high specificity & reversibility site-specific, stable & stoichiometric labeling low molecular weight (< 2 kda) minimal disturbance

19 the best of two worlds Chemistry trista high specificity for clustered histidine residues Molecular Biology is-tag easily introduced into proteins by genetic engineering

20 trista a versatile tool site-specific super resolution microscopy stochiometric stochastic sensing in nanopores high affinity single molecule tracking Grunwald et al. (2011) JACS Wei et al. (2012) ature anotech Giannone et al. (2010) Biophys J

21 photochemical tools controlling cellular functions by light

22 trista ADLE a new paradigm for caging the self-inactivating concept oemi Labòria

23 PA-trisTA a small lock-and-key element for receptor labeling in situ receptor clustering in three dimensions real-time receptor clustering live cell imaging and labeling 10 -SEP-Glu1 PA-trisTA ATT565 before photoactivation merged after photoactivation MBP- 6 ATT565 MBP- 10 ATT488 MBP- 6 ATT565 MBP- 10 ATT488 Laboria et al Angew. Chem Int. Ed. In press

24 LIGT CTLLED PTEI ITEACTI I A EW DIMESI Volker Gatterdam

25 Caged gluthatione arnessing the glutathione network by light one-photon activation two-photon activation 2 S eal time binding followed by FET In situ photoactivation fluorescence emission/cps/ nm wavelenght/nm Δ normalized donor fluorecence (PA)-GS ATT565 /µm fluorescence emission/cps/ uncaging wavelenght/nm Δ normalized acceptor fluorecence h ν time/sec FET Gatterdam et al Angew. Chem Int. Ed.

26 3 D patterning

27 crossing the cell membrane in situ receptor labeling in living cells

28 in situ receptor labeling in fixed cells coretap1-mvenus-is 6 and 100 nm tristaalexafluor 647 DAPI coretap1-mvenus-is 6 trista AlexaFlour 647 merge

29 Protein splicing guided by small high-affinity interaction pairs Ssp DnaB K D 10 µm 11 aa K D < 1 nm igh-affinity interaction Fast association rates Specificity in living cells Traceless protein labeling Markus Braner

30 Lab on chip Multiplexed parallel single molecule analysis using nanopore chips Motivation: Analysis of membrane protein transport properties for channels (nano valves) and active transporters with non electrogenic transport substrates. Workflow: protein containing vesicles spread on chip surface. Lipid bilayer is formed on top of nanopores. Cavities are sealed off from surrounding buffer reservoir. Proteins incorporated into pore region can be studied. Experimental setup: proteins incorporated into the pore region translocate fluorescent substrate into cavities. Influx kinetic can be recorded and analyzed. Control substrate can only enter the cavity if membrane is damaged. Michael Urban

31 PA-trisTA? PA-GS? So many options!!!

32 Pull the trigger!

33 utlook receptor clustering in cis

34 Questions?

35 Supercharged GFPs with photo-cleavable is-tag photo-cleavable is-tag S S SS IC 50 (nm) amino-3-(2-nitrophenyl)-propionic acid (Anp) 3-amino-3-(2-nitrodibenzofurane)-propionic acid (DBF) 2-photon uncaging

36 Traceless protein modification and trans-splicing in living cells triggered protein trans-splicing in the sub-nanomolar range in-vitro analysis and in-vivo labeling in living cells fast and efficient cell delivery by super-charged GFP in-situ labeling with high spatiotemporal resolution