LABORWELT. Biochip-Technologie. Special Custom Chips & Oligo-Service. Marktübersicht. Microarray- Reader. Ultrasensitive Protein- und DNA-Chips

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1 Bildmaterial: MWG Biotech; Fotomontage: Heiko Fritz LABORWELT III/2002 Das Themenheft von Special Custom Chips & Oligo-Service Marktübersicht Microarray- Reader Biochip-Technologie Ultrasensitive Protein- und DNA-Chips Komplexe Peptidarrays auf Computerchips Nanopumpen für schnellere Microarray- Inkubation Chipanalyse zellulärer Ionenkanäle Vorschau: die neue MatriXarray- Plattform von Roche BIOCOM AG

2 I N T R O Zum Thema Microarrays: höher, schneller, weiter Nach den DNA-Chips sind jetzt die Protein- und Antikörper-Arrays an der Reihe. Die US-Unternehmensberatung Frost & Sullivan prognostiziert in ihrer jüngsten Studie Proteinarrays vor dem Boom, daß binnen nur fünf Jahren der noch junge Markt für die Analyse-Chips von derzeit 41,2 Mio. US-$ auf mehr als 665 Mio. US-$ explodieren wird. Die Technologieanbieter nehmen mit neuen Produkten schon jetzt den jungen Markttrend spürbar auf. Und auch in der Wissenschaft regt sich einiges: Seit Juni etwa liegt in Brüssel ein Wunschzettel deutscher Proteomforscher, die den Aufbau der bislang umfassendsten Sammlung menschlicher Proteine und Antikörper gerne zur Hälfte aus dem 6. EU-Forschungsrahmenprogramm finanziert hätten die Sammlung dieser European Protein Initiative (EPI) könnte zum Beispiel die Diagnose und Erkennung krankheitsassoziierter Muster mit Antikörper-Chips voranbringen. Mit der vorliegenden Ausgabe versuchen wir, den neuen Trend mit aktuellen Beiträgen aus Wissenschaft und Unternehmen aufzugreifen und in Ausschnitten abzubilden (s. Seiten 20, 24, 30 und 44). Doch auch auf eren Feldern der Chiptechnologie geht es voran. Wissenschaftler vom Center for Nano Science der LMU München etwa stellten diesen Sommer eine Chiptechnologie vor, mit der zelluläre Ionenkanäle untersucht werden können (siehe S. 16). Eine Gruppe um die DKFZ-Forscherin Annemarie Poustka hat ein neues Verfahren entwickelt, um in Feststoffe eingebettete aktivierte Aminosäuren auf Arrays zu bringen und zwecks Vermarktung des flüssigkeitsfreien Verfahrens eine Firma gegründet (siehe S. 4). Und Diagnostik-Gigant Roche Diagnostics gewährt bereits in dieser Ausgabe erste Einblicke in seine neue Microarray-Plattform (siehe S. 8), bevor die Vermarktung im nächsten Jahr startet. Bitte nutzen Sie unseren Kennziffer-Service: online unter oder auf dem beiliegenden Fax-Formular Wenn Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer ankreuzen, Name und Adresse angeben und faxen/mailen Sie erhalten umgehend Informationen unserer Inserenten. Trotz aller Begeisterung für die Parallelisierung und den hohen Durchsatz, der mit Bio-Chips machbar ist, hat die noch junge Technologie natürlich auch ihre grundsätzlichen (in vitro-technik!) und spezielleren Probleme. Eines davon lautet Stardisierung (siehe S. 35) der mit den unterschiedlichen Auslesegeräten (Marktübersicht S. 32) gewonnenen Daten, ein eres ist die Frage, ob man selbst teuere Geräte kaufen soll oder ere die Chips herstellen läßt. Lesen Sie dazu ein kleines Special Oligonukleotid-Service und Custom-Arrays (siehe die Beiträge auf S. 38 ff. und 41ff.). Am Ende noch eine Vorab-Information in eigener Sache: Mit der nächsten Ausgabe wechselt die Chefredaktion der Zeitschrift LABORWELT. Künftig wird Frau Andrea Schneider, bestens bekannt durch ihre langjährige Arbeit für ein rennomiertes Life-Sciences-Magazin, von Martinsried aus die Entwicklung von LABOR- WELT steuern. Wir freuen uns über die Verstärkung unseres Teams. Viel Spaß beim Lesen wünscht Ihnen Ihr LABORWELT-Team Information ordern? Kennziffer 11 LW 03 / Inhalt BLITZLICHT 4 Hochkomplexe Peptidarrays auf Computerchips ANNEMARIE POUSTKA ET AL., DKFZ HEIDELBERG BLITZLICHT 12 Nanopumpen verbessern die Microarray-Inkubation JÜRGEN SCRIBA ET AL., ADVALYTIX, BRUNNTHAL BLITZLICHT 16 Biochip für die Untersuchung zellulärer Ionenkanäle NIELS FERTIG, JAN C. BEHRENS ET AL. NANION TECHNOLOGIES, CENS, MÜNCHEN BLITZLICHT The matrixarray platform 8 a novel flexible approach for gene analysis HORST DONNER ET AL., ROCHE DIAGNOSTICS, PENZBERG BLITZLICHT Neue Protein-Arrays und 20 Zytokin-Detektions-Chips JENS BEATOR, SCHLEICHER&SCHUELL, DASSEL REPORT 24 Proteinarrays Tools für Proteomics und Diagnostik THOMAS JOOS ET AL., NMI, REUTLINGEN BLITZLICHT 30 Protein Chip System ANDREAS WIESNER ET AL., CHIPERGEN, GÖTTINGEN MARKTÜBERSICHT 32 Microarray-Reader BLITZLICHT 35 Stardisierung von Microarray-Experimenten KARIN ADELHELM, EUGEN EHRMANNTRAUT, CLONDIAG CT, JENA SPECIAL Custom-Chips & 38, 41 Oligonukleotid-Service MICHAEL GISMANN ET AL., GENESCAN GRUPPE, FREIBURG; LUTZ WEHMEIER ET AL., MWG BIOTECH, EBERSBERG BLITZLICHT 43 Hochdurchsatz-PCR: vom Genom zum Expressionsprofil PATRICIA LANGER ET AL., GATC, KONSTANZ REPORT 44 Ultrasensitive DNA- und Proteinarrays MICHAEL PAWLAK ET AL., ZEPTOSENS, WITTERSWIL, CH 49 Produktwelt, Impressum transkript LABORWELT Nr. III/2002 3

3 Proteomics Hochkomplexe Peptidarrays auf Computerchips Dr. Frank Breitling 1, Dipl.-Ing. Frieder Breitling 2, Dr. Thomas Felgenhauer 3, Dr. Simon Fernez 1, Dipl.-Ing. Klaus Leibe 3, Dipl.-Chem. Mario Beyer 1, Dr. Volker Stadler 1, PD Dr. F. Ralf Bischoff 3, Prof. Dr. Annemarie Poustka 1 Deutsches Krebsforschungszentrum, 1 Abteilung Molekulare Genomanalyse, 2 PEPperPRINT GmbH, 3 Abteilung Molekulare Biologie der Mitose Kennziffer 12 LW 03 Info ordern? Kombinatorische Peptidsynthese mit einem Laserdrucker Diese Probleme können mit trockenen Aminosäure-Partikeln umgangen werden, die den Kern des hier vorgestellten, neuen Verfahrens bilden. In die Matrixsubstanz dieser Partikel (z.b. Diphenylformamid, Diphenylsulfoxid) Ziel unserer Forschungsarbeiten ist die Entwicklung hochkomplexer Peptidarrays für die biomedizinische Forschung. Die Grundlage dafür bildet ein Verfahren zur kombinatorischen Peptidsynthese auf einem Computerchip, der die Erzeugung unterschiedlicher Ladungsmuster auf der Oberfläche ermöglicht. Dazu werden die 20 verschiedenen biogenen Aminosäuren jeweils in unterschiedliche Partikel eingeschlossen und durch elektrostatische Kräfte nacheiner an die Syntheseorte auf dem Chip angelagert. Die Partikel bestehen aus einem bei Raumtemperatur festen Lösungsmittel (z.b. Diphenylformamid), in das die Fmoc-Aminosäuren eingebettet sind. Durch Erwärmung schmelzen die Partikel auf dem Chip und die eingeschlossenen Aminosäuren werden für die Kopplung freigesetzt. Durch wiederholtes Anlagern und Koppeln der Aminosäuren kann eine große Zahl unterschiedlicher Peptide simultan auf dem Chip synthetisiert werden Analyse des Immunstatus durch Peptidom-Arrays Viele Infektionskrankheiten (z.b. Borreliose, Tuberkulose) zeigen je nach Patient einen sehr unterschiedlichen Verlauf. Während in einigen Fällen nicht einmal bemerkt wird, daß eine Infektion stattgefunden hat, können in eren Fällen schwerste Komplikationen auftreten. Ein vieldiskutierter Einflußfaktor dabei ist der sogenannte Immunstatus des Patienten. Aus diesem Grunde Aerscheint es interessant, die Antikörperprofile von Patientengruppen mit unterschiedlicher Ausprägung der Krankheit zu vergleichen. Mit sogenannten Peptidomarrays könnte die Gesamtheit aller Proteine (z.b. von Borrelia burgdorferi) in Form überlappender Peptide auf einem einzigen Peptidarray repräsentiert werden. Der dafür benötigte Array mit etwa Peptiden des Erregers (die überlappenden Peptide sind dabei jeweils um fünf Aminosäuren gegeneiner versetzt) könnte einen möglichst umfassenden Nachweis von Borrelia burgdorferi-spezifischen Antikörpern Abb. 1: Kombinatorische Peptidsynthese mit Hilfe von Aminosäure-Partikeln im Blut infizierter Patienten ermöglichen. Derartige Antikörperprofile eröffnen die Differentialdiagnose von Krankheitsbildern. Ähnliches gilt für Peptidomarrays erer Spezies, wie Mycobacter tuberculosum (ca Peptide benötigt) oder Plasmodium falciparum (ca Peptide benötigt). Verfügbare Peptidarrays Die Pionierarbeit auf dem Gebiet der Peptidarrays kann Prof. Dr. Ronald Frank (GBF Braunschweig) zugeschrieben werden 1,2. Trotz großer Anstrengungen in den letzten Jahren weisen die derzeit verfügbaren Peptidarrays aber noch wesentlich weniger Oligomere pro Flächeneinheit auf als die Stardprodukte im Bereich der hochkomplexen Oligonukleotid-Arrays. Mit den zur Zeit verfügbaren Techniken können zwischen und unterschiedliche Peptide auf einem Träger von ca. 20 cm x 20 cm hergestellt werden 3,4. Eine Hauptschwierigkeit aller Spot-Techniken nur diese liefern derzeit brauchbare Resultate ist die Hhabung winzigster Flüssigkeitsmengen. Die auf den Träger aufgebrachten Tröpfchen variieren in ihrer Größe und das Lösungsmittel verdunstet oder verbreitet sich auf dem Träger. Darüber hinaus sind uneinheitliche Kopplungsbedingungen ein Problem, da die zuerst aufgebrachten Monomere bereits an den Träger koppeln, während an erer Stelle noch gedruckt wird. Um wesentlich komplexere Peptidarrays herstellen zu können, ist es daher erforderlich, ein neues Verfahren zu entwickeln. Abb. 2: Blaue Bereiche weisen durch Bromphenolblau gefärbte freie Aminogruppen von gekoppeltem Alanin nach. Individuell nachweisbar sind 18 (1), 46 (2) und 184 (3) Spots/cm 2. Zunächst wurden die Fmoc-Alanin-Partikel mit Hilfe eines Laserdruckers positioniert, anschließend das darin eingeschlossene Fmoc-Alanin an den Träger gekoppelt und freie Aminogruppen durch Essigsäureanhydrid blockiert. Nach der Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe wurden die neuentstenen, freien Aminogruppen mit Bromphenolblau nachgewiesen. sind die Monomere (z.b. Fmoc-geschützte Aminosäurecarboxyanhydride) eingeschlossen (Abb. 1.1). Die Matrixsubstanz der Partikel ist bei Raumtemperatur fest, so daß sie sich wie normale Tonerpartikel mit einem Farblaserdrucker an exakt definierbare Orte auf einem zweidimensionalen Träger drucken lassen. Jeweils nach dem Aufbringen einer vollständigen Druckschicht von unterschiedlichen Aminosäuren-Tonerpartikel werden die in diesen Partikeln immobilisierten Monomere durch einen wärmeinduzierten Phasenwechsel von fest nach flüssig aus den Tonerpartikeln freigesetzt (Abb. 1.2). Unter diesen Bedingungen erfolgt die Kopplung der Monomere an den Träger oder an die bereits synthetisierten Oligomerketten. Danach werden ungebundene Monomere weggewaschen (Abb. 1.3) und anschließend die Fmoc-Schutzgruppe abgespalten. Erste Ergebnisse sind in Abbildung 2 (siehe Seite 6) gezeigt. Zu sehen ist ein Ausschnitt von 18 cm 2 (oben), 46 cm 2 (links) bzw. 184 cm 2 (Mitte) blau angefärbter, optisch auflösbarer Aminosäure-Spots. Die Aminosäuren 4 Nr. III/2002 transkript LABORWELT

4 wurden mit Hilfe eines Laserdruckers auf dem Träger positioniert und gekoppelt. Abbildung 3 zeigt die dafür verwendeten Aminosäuren-Partikel im Vergleich zu helsüblichem Farbtoner. Ein Laserdrucker, der in der Lage ist, mehrere Schichten exakt übereiner zu drucken und damit den Aufbau von Peptiden aus einzelnen Aminosäuren erlaubt, wird zur Zeit am Fraunhofer-Institut für Produktionstechnik und Automatisierung in Stuttgart konstruiert und steht voraussichtlich Anfang 2003 zur Verfügung. Das entscheidend neue an diesem Verfahren sind die Aminosäure-Partikel, deren Matrixmaterial zum Lösungsmittel für eine chemische Synthese umgewelt werden kann. Bei allen bisher bekannten Methoden zur Herstellung von Arrays werden die Monomere in Flüssigkeiten auf den Träger aufgebracht. Bei dem hier beschriebenen Verfahren geschieht dies in Form der beschriebenen trockenen Aminosäuren-Tonerpartikel 5. Abbildung 4 zeigt den Vergleich zwischen der von Frank et al. entwickelten SPOT-Synthese 2 und der Verwendung trockener Aminosäuren-Partikel. Beide Verfahren beruhen im Prinzip auf dem seit fast 40 Jahren bewährten Peptidsyntheseverfahren nach Merrifield 6 mit dem Unterschied, daß bei den Abb. 3: Vergleich von normalem Hewlett Packard Farbtoner (blau; ca. 5 µm) mit Aminosäure-Partikeln, die mit einer Luftstrahlmühle hergestellt wurden. Aminosäure-Tonerpartikeln statt Dimethylformamid das chemisch sehr ähnliche Diphenylformamid verwendet wird. PEPperChip Beim PEPperChip soll anstelle eines Laserdruckers ein weitestgehend helsüblicher Computerchip mit derzeit mehr als 100 Millionen individuell ansteuerbaren Orten (pro cm 2 ) zum Positionieren der Partikel verwendet werden. Auf diesem Chip kann direkt ein Muster elektrostatischer Ladungen erzeugt werden, wodurch gleichartig geladene Partikel an die ungeladenen Orte durch Induktion einer Bildladung binden können (Abb. 5). Diese Anlagerung verbunden mit einem kurzen Anschmelzen kann für jede Art von Partikel nacheiner ausgeführt werden, ohne daß eine chemische Reaktion eingeleitet werden muß. Erst nachdem alle Partikelsorten positioniert sind, erfolgt die gleichzeitige Kopplung aller Aminosäuren (z.b. durch vollständiges Schmelzen und Aktivierung einer in den Partikeln zusätzlich eingeschlossenen Photobase). Daher erwarten wir, daß mit Hilfe dieser Technik in absehbarer Zeit hochkomplexe und vergleichsweise kostengünstige Peptidarrays zur Verfügung stehen werden. PEPperPRINT Dieser einfache Ansatz wird aller Voraussicht nach zu einem Patent führen, das ein neuartiges Verfahren zur Array-Herstellung breit abdeckt 5. Auf der Grundlage dieser Patentanmeldung wurde im März vorigen Jahres die PEPperPRINT GmbH aus dem DKFZ ausgegründet. Das junge Unternehmen sucht derzeit nach Investoren. Die PEPperPRINT- Technologie zählte im vergangen Jahr zu den Gewinnern des Businessplanwettbewerbs Genius Biotech Award und des Innovationswettbewerbs zur Förderung der Medizintechnik. Letzterer wird vom Bundesministerium für Bildung und Forschung für besonders innovative und originelle Forschungsideen im Bereich der Medizintechnik vergeben. Abb. 5: Beladung des Chips mit Aminosäure- Partikeln durch selektive elektrische Aufladung Literatur 1. Frank R (1992) An easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron 48, Frank R, Overwin H (1996) SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol 66, Chan WC, White PD (Editoren) (2000) Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis; Kapitel Seiten. Oxford University Press, ISBN Breitling, F., Poustka, A., Groß, K.H., Dübel, S. und Saffrich, R. (1999). Verfahren und Vorrichtungen zum Aufbringen von Substanzen auf einen Träger, insbesondere von Monomeren für die kombinatorische Synthese von Molekülbibliotheken. Deutsche Patentanmeldung DE , europäische Patentanmeldung EP A2, amerikanische Patentanmeldung US Merrifield RB, Stewart JM (1965) Automated peptide synthesis. Nature 207, Abb. 4: Der Unterschied zwischen dem PEPperPRINT-Verfahren und der Spot-Synthese ist das verwendete feste Lösungsmittel und der wärmeinduzierte Phasenwechsel der Aminosäure-Partikel von fest nach flüssig. Korrespondenzadresse Dr. Frank Breitling Deutsches Krebsforschungszentrum Im Neuenheimer Feld 280 Abteilung Molekulare Genomanalyse Tel.: Fax: Kennziffer 13 LW 03 Info ordern? 6 Nr. III/2002 transkript LABORWELT

5 Roche Applied Science The matrixarray platform: a novel flexible approach for gene analysis Horst Donner, Uschi Brehm, Jochen Hurlebaus, Jochen Renzing, Angelika Roesler Bruno Frey, Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science, Penzberg, Germany The parallel investigation of hundreds to thouss of different genes by DNA microarray analysis has shifted the focus of many researchers from a genetic to a genomic level. Based on the four-letter code, genomic information is available as DNA (genome) or RNA (transcriptome) in living cells. Whilst RNA as the mediator between genomic information gene function is used to monitor the expression of genes, DNA as the mediator between the genomic information of different generations is used to screen for mutations among different individuals populations. Microarrays in general are composed of a two or three-dimensional solid surface where DNA used as capture molecule (probe) is attached. Many spots are distributed over the surface in an arranged fashion containing a specific probe sequence. Each of the sequences corresponds to a specific target sequence enabling the researcher to measure hybridization of thouss of different sequences in parallel. The formation of the probe sequences varies among different microarray platforms. Whereas cdna microarrays are composed of amplified double-stred DNA fragments (several 100 bp of length); oligonucleotide arrays are utilizing single-stred DNA molecules (varying from 20 up to 80 bp in length). These oligonucleotides can be synthesized ex-situ are then automatically printed onto the surface, or can be synthesized on the array. The production method of microarrays is essential for reproducibility reliability of the experiments. Whereas the stardized reproducible cultivation amplification of bacterial DNA clones is difficult to achieve, the synthesis of oligonucleotides could be more easily embedded into an industrial workflow including several quality control steps. Oligonucleotide microarray platforms also offer more flexibility, especially when probe synthesis can be addressed individually for each spot on each array. This flexibility can only be achieved by utilizing an on chip synthesis principle. matrixarray: new technology for chip design production A maximal flexibility provided by the matrixarray platform from Roche Applied Science is based on the in-situ synthesis of DNA on semiconductor integrated circuits as well as the virtual flask technology. Figure 1 shows a 6-inch silicon wafer, that forms the basal surface of the array. A porous reaction layer is applied on one side of the semiconductor surface in order to enhance surface area. The three-dimensional array surface is covered by a disposable housing including an inlet outlet. Oligonucleotide synthesis is performed utilizing phosphoramidite chemistry electrochemical deprotection. This electrochemical deprotection is controlled individually for each spot on each array leading to a maximum flexibility within between arrays. Virtual flask technology prevents the diffusion of the reaction compounds in order to Fig. 1: Array fabrication for on-chip synthesis. Top left: a wafer containing many microarrays; middle: single matrixarray in a rectangular format; lower right: small section of the matrixarray showing individually addressable electrodes their associated circuits. Fig. 2: Virtual flask technology. Three electrodes are turned on while the other electrodes remain off. Electrochemically generated acids from active electrodes enable the specific coupling of the next nucleotide by de-protection via H + ions. Hereby coupling efficiency is greater 98% allowing oligonucleotide synthesis of more than 25 bp in length. avoid contamination of surrounding electrodes. So far, up to 1000 features could be synthesized individually per array (figure 2). The first essential step in planning an microarray-experiment is careful selection of capture probe sequences. For optimal performance these oligonucleotides should have similar melting temperatures, avoid secondary structures should be checked for crosshybridization within the pool of target sequences. In RNA-profiling this pool of target sequences is not 100% characterized even for human applications. Additionally, the huge number of unknown splice variants necessitates the ability to rapidly iterate microarray designs. With the matrixarray system of Roche Applied Science, a complete workflow for convenient on-line design, ordering delivery of customized microarrays will be made available. Optimized kits for target preparation Target preparation is related to the starting amount platform used in the experiment. Kits reagents have been developed by Roche Applied Science for direct labeling of targets during cdna synthesis as well as target amplification. For the application of the matrixarray platform incorporation of labeled nucleotides during T7 amplification (Eberwine protocol) is recommended. According to the amount of starting material, a method for PCR amplification prior to the T7 amplification has been developed. Consequently labeled targets can be generated from as little as 50 ng of total RNA. Kennziffer 14 LW 03 Info ordern? 8 Nr. III/2002 transkript LABORWELT

6 Fig. 3: Image overlay of a co-hybridization experiment utilizing rat liver brain tissues. 24 spots out of a 1 k array co-hybridization experiment show the expression of tissue-specific tissue-independent genes. Spots coloured red indicate liver specific, those coloured green indicate brain specific cdna. Yellow spots show simultaneous expression in both tissue types. Gene names corresponding to the probes within the numbered spots are listed below: 1. fatty acid binding protein 1, fabp1: specific for liver; 2. creatine kinase: specific for brain 3. alpha-tubulin: housekeeping-gene expressed in liver brain 4. acidic calcium-independent phospholipase A2: housekeeping-gene expressed in liver brain Fully automated hybridization image acquisition For hybridization subsequent reading of the chips only arrays, targets buffer components have to be inserted into to the matrixarray hybridizing imaging instrument. A pipetting robot performs liquid hling image acquisition is done by CCD camera. A complete experimental workflow for 6 different arrays can be completed in less than 6 hours. Image analysis is performed at the same workstation utilizing proprietary software tools. The hybridization workflow is fully automated in order to enhance reproducibility of the results. Applications Today expression-profiling as well as mutation analyses are the two main applications for microarray analysis. Two examples for both applications are the evaluation of expression profiles from rat tissues as well as the analysis of mutations within the cystic fibrosis transmembrane conductor (CFTR) gene. Comparison of expression profiles derived from various rat tissues By using inbred rat strains for tissue comparison (e.g. liver, kidney, heart etc.), a variation based on the genetic background is minimized. Set up experiments are focused on genes displaying an ON/OFF mode based on the specific physiological function of each organ. Distinct expression of those genes together with so-called house keeping genes are shown in figure 3. Differences of gene expression within a tissue or between several tissues can be further calculated by a data analysis software. This software enables the researcher to evaluate ratios as well as to perform hierarchical clustering. Mutation analysis within the CFTR gene Cystic fibrosis is the most common, early lethal genetic disease within Caucasians. Whilst more than one thous mutations are described so far, only a few of them are responsible for nearly 99% of aberrant transcripts. Since these mutations include single or dinucleotide insertions deletions as well as single base pair substitutions the CFTR gene serves as a suitable target for microarray analysis. Typical results are shown in figure 4. For gene expression as well as mutation analysis several alternative methods are availab- Fig. 4: Mutation detection within the cystic fibrosis (CFTR) gene. A labeled fifteen-plex PCR reaction covering more than 30 polymorphic sites within the CFTR gene was hybridized onto a matrixarray chip. As an example, three probes for the wild type sequence (corresponding to three polymorphic sites) as well as three corresponding nucleotide substitutions are displayed. As the sample was extracted from a healthy individual, only probes corresponding to the wild type (WT, indicated in blue) produce positive signals. le (e.g. RT-PCR, Northern Blots, RFLP, etc.). The key advantage of microarray experiments is the parallelization of hybridization experiments. Although these parameters differ between expression profiling mutation detection, parallelization requires optimal hybridization conditions as well as probe sequences for hundreds or thouss of genes or polymorphic sites within the same experiment. Since assay optimization could not be achieved in a single-step approach, flexibility is one of the key features of the matrixarray System of Roche Applied Science. Summary Array technology is delivering new information about complex interactions at a molecular level. This knowledge will be reshaping the ways how research will be conducted in the future. Especially in respect to complex human diseases microarray analysis is expected to deliver fundamental insight in pathogenic processes. It might help therefore to increase the prognostic therapeutic capabilities of medical treatments in the future. By utilizing the matrixarray platform developed by Roche Applied Science, researchers are now able to address the rapidly increasing amount of new data more flexible, within their array experiment. This includes change of probe sequences, gene lists as well as the switch between organisms applications. Furthermore, together with optimized kits reagents the matrixarray platform offers superior solutions for the complete workflow of an array experiment. This might be of great importance especially when protocols /or data should be exchanged between different labs. Together with MagNA Pure LC the Light- Cycler System the matrixarray platform exps the portfolio of automated systems for nucleic acid analysis of Roche Applied Science. Especially the interaction between these different platforms might help to speed up research development in the future. A first impression of the matrixarray platform could be received at the MEDICA in November 2002 although launch of the system will be during the year Correspondence Horst Donner, PhD Roche Applied Science Roche Diagnostics GmbH/House 241, Room 379 Nonnenwald 2 D Penzberg Tel: Fax: Kennziffer 15 LW 03 Info ordern? 10 Nr. III/2002 transkript LABORWELT

7 Microarrays Nanopumpen verbessern die Microarray-Inkubation Dr. Jürgen Scriba, Andreas Tögl, Dr. Rol Kirchner, Advalytix AG, Brunnthal Mit einer neuartigen Technologie gelingt es, die Probenflüssigkeit während der Inkubation von Microarrays im Kapillarspalt ohne zusätzliche Totvolumina effektiv zu durchmischen. Die Durchmischung erhöht die Signalintensität, verkürzt die Inkubationszeiten und ermöglicht die in-situ-messung der Reaktionskinetik. Betrachtet man die Situation eines Microarrays im Maßstab 1 zu 1000, wird das Problem intuitiv klar: Auf einem Slide von der Größe eines Fußballplatzes stünde die Probenlösung etwa knöcheltief. Die Spots sind in diesem Bild etwa htellergroß. Daß während endlicher Inkubationszeiten DNA-Moleküle aus der rechten Spielfeldhälfte den passenden Spot auf dem linken Elfmeterpunkt finden, ist praktisch ausgeschlossen, da sie durch Diffusion während eines Tages in diesem Maßstab nur einige Meter überwinden können. Moleküle außerhalb dieses Radius tragen nicht zum Signal eines Spots bei. Abhän- DNA- und Protein-Microarrays spielen in vielen Bereichen der biologischen Forschung eine immer wichtigere Rolle. Ihr geringer Probenverbrauch und die hohe Parallelität der Assays machen sie zu einer Schlüsseltechnologie im Hochdurchsatz-Screening. Hochdichte Chips ermöglichen die Expressionsanalyse eines vollständigen Genoms in einem Experiment. Für viele Anwendungen von der routinemäßigen Nahrungsmittelanalyse bis zur Genexpressionsanalyse stehen kommerzielle Chips zur Verfügung. Die zahlreichen am Markt erhältlichen Spotter- und Readersysteme, spezielle Slides mit optimierten Oberflächen und hochwertige Verbrauchsmaterialien machen Microarray-basierte Assays zu einem Stard in vielen Abb.1: Advacard TM mit drei Mischerchips, Funktionsprinzip der auf dem Chip integrierten Nanopumpen, die mit Hilfe von Oberflächenwellen Strömungen in Flüssigkeiten anregen. Abb. 2: Verteilung von Farbstoff im Kapillarspalt über einem Objektträger in 15 Minuten. Oben: Bei Durchmischung mit SAW-Nanopumpen, unten: ohne Durchmischung Labors. Gleichwohl läßt ein zentraler Bereich der Microarray-Technologie nach wie vor breiten Raum für eine Optimierung: Die spezifische Bindung zwischen Target-Molekülen in der Probenflüssigkeit und den an der Slideoberfläche immobilisierten Fängermolekülen findet in einer äußerst ungünstigen Geometrie statt. Da im Kapillarspalt zwischen Slide und Deckglas ohne zusätzliche Maßnahmen die Durchmischung auf Diffusion beschränkt ist, kommt es in der unmittelbaren Nachbarschaft der Fängermoleküle zu Verarmungszonen, die nur durch Diffusion ausgeglichen werden können. Die Folge sind lange Inkubationszeiten, Inhomogenitäten auf dem Array und ein nicht optimales Signal-Rausch-Verhältnis. So trivial sich das Problem der Durchmischung auf makroskopischer Ebene darstellt, so hartnäckig entzieht es sich der mikrofluidischen Lösung. Einerseits fehlte bislang das mikromechanische Pendant zum Magnetrührer, der im Kapillarspalt mit einer Höhe von nur 0,1mm eingesetzt werden könnte. Andererseits verhindert die geringe Dicke des Flüssigkeitsfilms die Bildung von Turbulenzen. Deshalb können Inkubationssysteme, die mit Hilfe externer Pumpen versuchen, die Probenlösung im Kapillarspalt zu durchmischen, bestenfalls laminare Strömungen im Spalt erzeugen. Da laminare Strömungsfäden jedoch per se stationär sind, ist eine flächige Durchmischung ausgeschlossen. Die zur Befüllung externer fluidischer Systeme nötigen Zusatzvolumina und die damit verbundene Verdünnung der Probe zum Teil um Faktoren kann zudem einen möglichen positiven Effekt auf die Reaktionskinetik und das Reaktionsgleichgewicht zunichte machen. gig von der relativen Konzentration der verschiedenen Bindungspartner können manche Spots daher nicht die maximale Intensität erreichen, es kommt zur lokalen Verarmung. Fehlende Durchmischung ist zudem vermutlich auch für Beeinträchtigungen der Signalqualität, wie Intensitätsgradienten, Doughnut -Artefakte etc. verantwortlich. Totvolumina-freie Nanopumpen ohne bewegliche Teile Die Advalytix AG hat jetzt Nanopumpen entwickelt, die eine effektive Agitation kleinster Probenmengen ohne zusätzliche Totvolumina ermöglicht. Die Pumpen sind auf der Oberfläche von Chips integriert, die anstelle eines Deckglases in der üblichen Inkubationsgeometrie angewendet werden können. Die Pumpen enthalten keinerlei mechanisch bewegliche Teile, zur Agitation der Flüssigkeit dienen sogenannte akustische Oberflächenwellen (Surface Acoustic Wave SAW). Die SAW-Technik wird seit langem in der Elektronik eingesetzt, so finden sich zum Beispiel in Mobiltelefonen gleich mehrere Oberflächenwellenfilter. Zur Anregung der Wellen dienen dabei metallische Elektroden auf dem piezoelektrischen Chip. Diese sogenannten Transducer weln ein hochfrequentes elektrisches Signal in eine mechanische Vibration um. Mit einer Amplitude im Nanometerbereich und Wellenlängen von einigen Mikrometern breiten sich die Wellen wie Erdbeben im Nanoformat über den Chip aus 1. Dabei übertragen sie einen Teil ihrer Energie auf die Flüssigkeit an der Chipoberfläche. Abbildung 1 zeigt das Funktionsprinzip eines solchen Mischer-Chips und die Advacard TM eine Kunststoffkarte mit drei 12 Nr. III/2002 transkript LABORWELT

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