GEMEINSAME BESTIMMUNG VON GLUCOSE UND FRUCTOSE IN WEIN MITTELS DIFFERENTIELLER-pH-MESSUNG
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- Reinhold Meinhardt
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1 RESOLUTION OENO 10/2006 GEMEINSAME BESTIMMUNG VON GLUCOSE UND FRUCTOSE IN WEIN MITTELS DIFFERENTIELLER-pH-MESSUNG DIE GENERALVERSAMMLUNG, In Anbetracht von Artikel 2 Absatz 2 iv des Gründungsübereinkommens der internationalen Organisation für Rebe und Wein vom 3. April 2001, Auf Vorschlag der Unterkommission Methoden für die Analyse und die Bewertung der Weine, BESCHLIESST, den Anhang A des Sammelbands der internationalen Methoden zur Analyse von Wein und Most durch folgende als Typ-III klassifizierte Methode zu ergänzen: TITEL GEMEINSAME BESTIMMUNG VON GLUCOSE UND FRUCTOSE IN WEIN MITTELS DIFFERENTIELLER ph-messung TYP DER METHODE III 1. ANWENDUNGSBEREICH Diese Methode ist zur Bestimmung eines Glucose- und Fructosegehalts in Wein zwischen 0 und 60 g/l (tlerer Bereich) oder zwischen 50 und 270 g/l (hoher Bereich) anwendbar. 2. PRINZIP Die gemeinsame Bestimmung der Glucose und Fructose tels Differentiel-pH-Messung erfolgt durch Phosphorylierung der Glucose und der Fructose tels Hexokinase. Die entsprechend den Glucose- und Fructosemengen stöchiometrisch erzeugten H + Ionen werden dann quantifiziert. 3. REAKTIONSLEICHUNGEN Vorhandene Glucose und Fructose werden durch Adenosintriphosphat (ATP) im Laufe einer durch Hexokinase (HK) katalysierten Enzymreaktion phosphoryliert (EC ) HK Glucose + ATP Glucose-6-Phosphat + ADP + H + HK Fructose + ATP Fructose-6-Phosphat + ADP+ H + 1
2 4. REAGENZIEN 4.1 Entmineralisiertes (18 MΩ) oder doppelt destilliertes Wasser Amino-2-(hydroxymethyl)propan-1,3-diol (TRIS) Reinheit 99% 4.3 Dinatrium-Adenosintriphosphat (ATP, 2Na) Reinheit 99% 4.4 Trinatriumphosphat zwölf Wassermolekülen (Na 3 PO 4.12H 2 O) Reinheit 99% 4.5 Natriumhydroxid (NaOH) Reinheit 98% 4.6 Magnesiumchlorid 6 Wassermolekülen (MgCl 2.6H 2 O) Reinheit 99% 4.7 Triton X Kaliumchlorid (KCl) Reinheit 99% Brom-2-nitropropan-1,3-diol (Bronopol) (C 3 H 6 BrNO 4 ) 4.10 Hexokinase (EC ) 1 mg 145 E (z. B. Hofmann La Roche, Mannheim, Deutschland, Art. HEXO ) 4.11 Glycerin Reinheit 98% 4.12 Glucose Reinheit 99% 4.13 Reaktionspuffer ph 8,0 handelsüblich oder nach folgender Methode zubereitet: In einen 100 ml Messkolben (5.2) etwa 70 ml (5.3) Wasser (4.1) geben, ständig rühren (5.5). 0,242 g ± 0,001 g (5.4) TRIS (4.2), 0,787 g ± 0,001 g (5.4) ATP (4.3), 0,494 g ± 0,001 g (5.4) Natriumphosphat (4.4), 0,009 mg ± 0,001 g (5.4) Natriumhydroxid (4.5), 0,203 g ± 0,001 g (5.4) Magnesiumchlorid (4.6), 2,000 ± 0,001 g (5.4) Triton X 100 (4.7), 0,820 g ± 0,001 g (5.4) Kaliumchlorid (4.8) und 0,010 ± 0,001 g (5.4) Bronopol hinzufügen. Bis zur Marke Wasser auffüllen (4.1). Der ph-wert muss bei 8,0 ± 0,1 (5.6) liegen, sonst Natronlauge oder Salzsäure anpassen. Der so hergestellte Puffer ist bei 4 C zwei Monate haltbar Enzymlösung handelsüblich oder nach folgender Methode zubereitet: Mit einer Messpipette (5.7) 5 ml Glycerin (4.12) in einen 10 ml-messkolben geben, bis zur Marke Wasser (4.1) anfüllen und umrühren. 10 mg ± 1 mg (5.4) Hexokinase (4.10) in 3 ml Glycerinlösung auflösen. Die Aktivität der Enzymlösung muss E ± 100 E pro ml für Invertase und 480 E ± 50 E pro ml für Hexokinase betragen. Die Enzymlösung ist bei 4 C 6 Monate haltbar. 2
3 4.15 Zubereitung der Kalibrierlösung (tlerer Konzentrationsbereich), wenn der angenommene Glucose- + Fructosegehalt unter 50 g/l liegt) 3,60 g ± 0,01 g (5.4) Glucose (4.12) (zuvor 12 Stunden bei 40 C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet), 0,745 g ± 0,001 g (5.4) Kaliumchlorid (4.8) et 0,010 g ± 0,001 g (5.4) Bronopol in einen 100 ml Messkolben geben (5.2). Wasser hinzufügen (4.1). Gut vermischen (5.5). Bis zur Marke Wasser (4.1) auffüllen, vorher den Magnetstab herausnehmen. Die Endkonzentration beträgt 36 g Glucose pro Liter. Die Lösung ist bei 4 C 6 Monate haltbar Zubereitung der Kalibrierlösung (hohes Niveau), wenn der angenommene Glucose- + Fructosegehalt über 50 g/l liegt) 18,0 g ± 0,01 g (5.4) Glucose (4.12) (zuvor 12 Stunden bei 40 C bis Erreichen eines konstanten Gewichts getrocknet), 0,745 g ± 0,001 g (5.4) Kaliumchlorid (4.8) et 0,010 g ± 0,001 g (5.4) Bronopol in einen 100 ml Messkolben geben (5.2). Wasser hinzufügen (4.1). Gut vermischen (5.5). Bis zur Marke Wasser (4.1) auffüllen, vorher den Magnetstab herausnehmen. Die Endkonzentration beträgt 36 g Glucose pro Liter. Die Lösung ist bei 4 C 6 Monate haltbar. 5. GERÄTE 5.1 Gerät zur Differentilllen-pH-Messung (EUROCHEM CL 10 plus, Microlab EFA oder gleichwertig), siehe Anhang A ml Messkolben, Klasse A ml Messzylinder 5.4 Präzisionswaage zum Abwiegen von mg 5.5 Magnetrührwerk und teflonbeschichtete Magnetstäbe 5.6 ph-meter 5.7 Messpipetten 3ml, 5 ml, Klasse A ml Messkolben, Klasse A 5.9 Kolbenhubpipetten zu 25 und 50 µl 6. VORBEREITUNG DER PROBEN Die Proben sollten nicht zu viel Stoffe in Suspension enthalten. Ist dies der Fall, müssen die Proben zentrifugiert oder filtriert werden. Schaumweine müssen entgast werden. 3
4 7. DURCHFÜHRUNG Die Bedienungsanweisungen für die Geräte (5.1) sind einzuhalten. Vor dem Einsatz muss die Temperatur das Geräts stabilisiert werden. Nach einer eventuellen Reinigung sind die Leitungen der Pufferlösung (4.13) zu spülen. 7.1 Bestimmung des Blindwertes (Bestimmung des Enzymsignals) Die Elektroden (EL 1 und EL 2 ) des Gerätes zur differentiellen ph-messung (5.1) der Pufferlösung füllen (4.13). Die Differenz zwischen den beiden Elektroden (D 1 ) muss bei ± 150 mph liegen. 24 µl Enzymlösung (4.14) in die Reaktionskammer hinzufügen ( der Mikropipette 5.9 oder vom Laboranten) und die Elektrode EL 2 anfüllen; die Spannungsdifferenz (D 2 ) zwischen den beiden Elektroden messen; die ph-differenz als ph o des Blindwertes nach folgender Formel berechnen: ph o = D 2 D 1 ph o = ph-differenz zwischen zwei Messungen der Bestimmung des Blindwertes, D1 = Wert der ph-differenz zwischen den beiden Pufferlösung gefüllten Elektroden, D2 = Wert der ph-differenz zwischen den beiden Elektroden, von denen die eine Pufferlösung und die andere Pufferlösung und Enzymlösung gefüllt ist. Anhand des Wertes von ph o kann man den Zustand der Elektroden während der Bestimmung sowie ein eventuelles Abdriften über die Zeit überwachen. Die Differenz sollte bei zwei aufeinanderfolgenden Messungen zwischen 30 und 0 mph und 1,5 mph liegen. Ist dies nicht der Fall, die Qualität der Pufferlösung und die Sauberkeit der Leitungen und Elektroden überprüfen, nötigenfalls reinigen und die Messung wiederholen. 7.2 Kalibrieren Mittlerer Konzentrationsbereich Die Elektroden (EL 1 und EL 2 ) Pufferlösung anfüllen (4.13). 25 µl Glucose-Kalibrierlösung (4.15) in die Reaktionskammer geben ( der Mikropipette 5.9 ); Die Elektroden EL 1 und EL 2 der Mischung von Pufferlösung und Kalibrierlösung füllen. Die Spannungsdifferenz (D 3 ) zwischen den beiden Elektroden messen. 24 µl Enzymlösung (4.14) hinzufügen und die Elektrode EL 2 der Mischung Pufferlösung + Kalibrierlösung + Enzym füllen. Nach der für die Enzymreaktion notwendigen Zeit die Spannungsdifferenz (D 4 ) zwischen den beiden Elektroden messen. Die ph-differenz ph c für die Kalibrierlösung nach folgender Formel berechnen: ph c = (D 4 D 3 ) - ph o ph c = Differenz des ph zwischen den beiden Messungen D 3 und D 4 für die Kalibrierlösung minus der in der Blindwert Messung erhaltenen Differenz; D 3 = Wert der ph-differenz zwischen den beiden der Mischung Pufferlösung/Vergleichslösung gefüllten Elektroden; 4
5 D 4 = Wert der ph-differenz zwischen den beiden Elektroden, von denen eine Pufferlösung/Vergleichslösung und die andere Pufferlösung/Vergleichslösung/Enzym gefüllt ist. Berechnung der Steigung der Kalibriergeraden: s = C u / ph c C u = Konzentration der Glucose in der Kalibrierlösung ausgedrückt in g/l. Die Kalibrierung durch Analyse von 25 µl der Glucosekalibrierlösung (4.15) entsprechend Verfahren (7.3) überprüfen. Das Ergebnis muss zwischen ± 2% des Vergleichswertes liegen. Ist dies nicht der Fall, das Kalibrieren wiederholen Hoher Konzentrationsbereich Die Elektroden (EL 1 und EL 2 ) Pufferlösung anfüllen (4.13). 10 µl Glucose-Kalibrierlösung (4.16) in die Reaktionskammer hinzufügen ( der Mikropipette 5.9 oder vom Laboranten). Die Elektroden EL 1 und EL 2 der Mischung von Pufferlösung und Kalibrierlösung füllen. Die Spannungsdifferenz (D 3 ) zwischen den beiden Elektroden messen. 24 µl Enzymlösung (4.14) hinzufügen und die Elektrode EL 2 der Mischung Pufferlösung + Kalibrierlösung + Enzym füllen. Nach der für die Enzymreaktion notwendigen Zeit die Spannungsdifferenz (D 4 ) zwischen den beiden Elektroden messen. Die ph-differenz ph c für die Kalibrierlösung nach folgender Formel berechnen: ph c = (D 4 D 3 ) - ph o ph c = Differenz des ph zwischen den beiden Messungen D 3 und D 4 für die Kalibrierlösung minus der in der Nullmessung erhaltenen Differenz, D 3 = Wert der ph-differenz zwischen den beiden der Mischung Pufferlösung/Vergleichslösung gefüllten Elektroden, D 4 = Wert der ph-differenz zwischen den beiden Elektroden, von denen eine Pufferlösung/Vergleichslösung und die andere Pufferlösung/Vergleichslösung/Enzym gefüllt ist. Berechnung der Steigung der Kalibriergeraden: s = C u / ph c C u = Konzentration der Glucose in der Kalibrierlösung ausgedrückt in g/l. Die Kalibrierung durch Analyse von 10 µl der Glucosekalibrierlösung (4.16) entsprechend Verfahren (7.3) überprüfen. Das Ergebnis muss zwischen ± 2% des Vergleichswertes liegen. Ist dies nicht der Fall, das Kalibrieren wiederholen. 7.3 Quantifizieren Die Elektroden (EL 1 und EL 2 ) der Pufferlösung (4.13) füllen. 10 µl (hohes Niveau HL) oder 25 µl (tleres Niveau HL) Probe in die Reaktionskammer hinzufügen ( der Mikropipette 5.9 oder durch den Laboranten). 5
6 Die Elektroden EL 1 und EL 2 der Mischung Pufferlösung + Probe füllen. Die Spannungsdifferenz (D 5 ) zwischen den beiden Elektroden messen. 24 µl der Enzymlösung (4.14) hinzufügen und die Elektrode EL 2 der Mischung Pufferlösung + Probe + Enzym füllen. Die Spannungsdifferenz (D 6 ) zwischen den beiden Elektroden messen. Die Menge des gelösten Stoffes in der Probe wie folgt berechnen: w = s [(D 6 D 5 ) - ph o ] w = Menge des gelösten Stoffes in der Probe (in g/l); S = Steigung der Kalibriergeraden; ph o = Differenz des ph zwischen den beiden Messungen der Nullmessung D 5 = Wert der ph-differenz zwischen den beiden Probe/Vergleichslösung gefüllten Elektroden; D 6 = Wert der ph-differenz zwischen den beiden Elektroden, von denen eine Pufferlösung/Probe und die andere Pufferlösung/Probe/Enzym gefüllt ist. 8 ANGABE DER MESSERGEBNISSE Die Ergebnisse werden als Wert einer signifikanten Nachkommastelle in g/l Glucose + Fructose ausgedrückt. 9 PRÄZISION Einzelheiten bezüglich des Ringversuchs zur Bewertung der Präzision der Methode werden in Anhang B zusammengefasst. 9.1 Wiederholbarkeit Die absolute Differenz zwischen zwei unabhängigen Messergebnissen, die ein Laborant den selben Geräten in einem möglichst kurzen zeitlichen Abstand an identischen der Prüfung unterzogenen Stoffen erzielt, darf den Grenzwert der Wiederholbarkeit r in 95 % der Versuche nicht überschreiten. Der Grenzwert beträgt: r = 0,021x + 0,289, x = Glucose- + Fructosegehalt in g/l 9.2 Reproduzierbarkeit Die absolute Differenz zwischen zwei unabhängigen Messergebnissen, die in zwei verschiedenen Labors an identischen der Prüfung unterzogenen Stoffen erzielt werden, darf den Grenzwert der Reproduzierbarkeit R in 95 % der Versuche nicht überschreiten. Der Grenzwert beträgt: R = 0,033x + 0,507, x = Glucose- + Fructosegehalt in g/l 6
7 10 WEITERE MERKMALE DER ANALYSE 10.1 Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen Nachweisgrenzen Die Nachweisgrenze wird anhand von 10 Versuchsreihen an Nullproben je drei Wiederholungen und der Durchführung einer linearen Regression an für die Präzisionsmessung verwendeten Weinen bestimmt. Sie entspricht der dreifachen Standardabweichung. In diesem Fall ergab die Methode eine Nachweisgrenze von 0,03 g/l. Versuche Verdünnungsreihen bestätigten diesen Wert Quantifizierungsgrenze Die Nachweisgrenze wird anhand von 10 Versuchsreihen an Nullproben je drei Wiederholungen und der Durchführung einer linearen Regression an für die Präzisionsmessung verwendeten Weinen bestimmt. Sie entspricht der zehnfachen Standardabweichung. In diesem Fall ergab die Methode eine Quantifizierungsgrenze von 0,10 g/l. Versuche Verdünnungsreihen bestätigten diesen Wert. Quantifizierungen an Weiß- und Rotweinen, die von Labors durchgeführt wurden, die auch an dem Ringversuch teilnahmen, bestätigten diese Werte ebenfalls Richtigkeit Die Richtigkeit wird ausgehend von der errechneten tleren Wiederfindungsrate der tels Doppeltblindtest im Ringversuch analysierten gespikten Weine abgeschätzt (Weine A, B, C, D, F und J). Sie beträgt 98,9% einem Vertrauensintervall 0,22%. 11 QUALITÄTSKONTROLLE Qualitätskontrollen können zertifiziertem Referenzmaterial sowie Weinen, deren Eigenschaften übereinstimmend anderen Laboratorien ertelt wurden oder Weinen enstprechenden Zusätzen, die regelmäβig in Analysereihen eingeschleust werden unter Führung entsprechender Kontrollregelkarten durchgeführt werden. 7
8 Anhang A Schema der Messanordnung zur Differentiellen ph-messung S A EL P D K C EL 1 P1 P3 EL 2 P2 G B M W A: Differentialverstärker; B: Pufferlösung; C: Mischkammer; D: Anzeige; EL1 und EL2: Kapillarelektroden; EL: Elektronik; G: Erdung; K: Tastatur; M: Magnetrührwerk; P: Drucker; P1 bis P3: peristaltische Pumpen S: Einspritznadel für Probe und Enzym; W: Abfall. 8
9 Anhang B Statistische Daten aus den Ergebnissen der Ringversuche Gemäß ISO :1994 wurden nachfolgende Parameter im Verlauf eines Ringversuchs definiert. Dieser Versuch wurde vom Labor des branchenübergreifenden Fachverbands für Weine der Champagne in Epernay (Frankreich) durchgeführt. Jahr des Ringsversuchs: 2005 Anzahl teilnehmender Labors: 13 im Doppeltblindtest Anzahl getesteter Proben: 10 Wein A Wein B Wein C Wein D Wein E Wein F Wein G Wein H Wein I Wein J Mittelwert in g/l Anzahl Labors Anzahl Labors nach Ausschluss der größten Streuungen Standardabweichung der Wiederholbarkeit Grenzwert der Wiederholbarkeit RSDr, 100% HORRAT r Standardabweichung der Reproduzierbarkeit Grenzwert der Reproduzierbarkeit RSDR, 100% HORRAT R Arten der Proben: Wein A: Weißwein natürlichem Zuckergehalt, 2,50 g/l Glucose- und 2,50 g/l Fructosezusatz, Wein B: Weißwein natürlichem Zuckergehalt (Wein A), 5,00 g/l Glucose- und 50 g/l Fructosezusatz, Wein C: Weißwein natürlichem Zuckergehalt (Wein A), 7,50 g/l Glucose- und 7,50 g/l Fructosezusatz, Wein D: Weißwein natürlichem Zuckergehalt (Wein A), 10,0 g/l Glucose- und 10,0 g/l Fructosezusatz, Wein E: aromatisierter Wein, 9
10 Wein F: Weißwein einem natürlichen Zuckergehalt unter 0,4 g/l, 22,50 g/l Glucose- und 22,50 g/l Fructosezusatz, Wein G: Rotwein natürlicher Restsüße, Wein H: Weißwein, lieblich Wein I: Mistelle, Wein J: Weißwein einem natürlichen Zuckergehalt unter 0,4 g/l, 115,00 /l Glucose- und 115,00 g/l Fructosezusatz. LITERATUR LUZZANA M., PERELLA M. und ROSSI-BERNARDI L (1971): Anal. Biochem, 43, LUZZANA M., AGNELLINI D., CREMONESI P. und CARAMENTI G. (2001): Enzymatic reactions for the determination of sugars in food samples using the differential ph technique. Analyst, 126, LUZZANA M., LARCHER R., MARCHITTI C. V. und BERTOLDI D. (2003): Quantificazione mediante ph-metria differenziale dell'urea negli spumanti metodo classico.in "Spumante tradizionale e classico nel terzo millennio" giugno 2003, Istituti Agrario di San Mechele. MOSCA A., DOSSI G., LUZZANA M., ROSSI-BERNARDI L., FRIAUF W. S., BERGER R.L., HOPKINS H. P. und CAREY V (1981): Improved apparatus for the differential measurment of ph : application to the measurment of glucose. Anal. Biochem., 112, MOIO L., GAMBUTI A., Di MARZIO L. und PIOMBINO P. (2001): Differential phmeter determination of residual sugars in wine. Am. J. Enol. Vitic, 52(3), TUSSEAU D., FENEUIL A., ROUCHAUSSE J.-M. und VAN LAER S. (2004): Messung diverser önologischer Parameter durch Differential-pH-Messung, OIV, Nr. 1199, grüne Seiten (F.V), 5 Seiten. 10
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