Entwicklung einer maßgeschneiderten Matrix aus allenkollagen für die Knorpelregeneration

Größe: px
Ab Seite anzeigen:

Download "Entwicklung einer maßgeschneiderten Matrix aus allenkollagen für die Knorpelregeneration"

Transkript

1 Entwicklung einer maßgeschneiderten Matrix aus allenkollagen für die Knorpelregeneration Judith Sewing 2013

2

3 Aus dem Insjtut für Virologie und Zellbiologie der Universität zu Lübeck Direktor: Prof. Dr. Norbert Tautz Entwicklung einer maßgeschneiderten Matrix aus Quallenkollagen für die Knorpelregenerajon Inauguraldissertajon zur Erlangung der Doktorwürde der Universität zu Lübeck Aus der Sekjon NaturwissenschaSen vorgelegt von Judith Sewing aus Gömngen Lübeck 2013

4

5 1. Berichterstaker: Prof. Dr. Holger Notbohm, Universität zu Lübeck, Deutschland 2. Berichterstaker: Prof. Dr. Charli Kruse, Universität zu Lübeck, Deutschland Tag der mündlichen Prüfung: Zum Druck genehmigt. Lübeck, den

6

7 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis...1 Zusammenfassung Einleitung und Hintergrund Knorpel- Tissue Engineering Kollagen Molekularer AuKau Kollagenfamilien und ihre Funkjonen Synthese fibrillenbildender Kollagene in vivo AuKau Fibrille in vivo Knorpel morphologischer AuKau AuKau molekulare Ebene Zelle- EZM- Kontakt Bedeutung Rezeptoren der Zelle Bindungsstellen am Kollagen Verwendung von Kollagen, Kollagenquellen Verwendung Kollagenquellen: Wirbeljere Kollagenquellen Invertebraten Cnidaria, Quallen Konzepjon einer Matrix Was muss eine geeignete Matrix mitbringen? Welche Matrixformen gibt es bereits? Mojve für diese Arbeit Hinführung AuKau der Arbeit Untersuchungen zum Kollagen sowie Herstellung und Variajonsmöglichkeiten der ScaffoldeigenschaSen Analyse und EigenschaSen von Quallenkollagen Einleitung Material und Methoden: Ergebnisse und Diskussion: Diskussion Wie sind die EigenschaSen zu variieren? - Physik Einleitung Material und Methoden Ergebnisse und Diskussion:...57

8 3.2.4 Zusammenfassende Diskussion Untersuchungen in der Zellkultur Material und Methoden Zellkultur und Analyse allgemein Zellkultur Homogenisieren der besiedelten Scaffolds mrna Isolierung und RT- PCR DNA- Konzentrajon Proteinanalysen, Slotblot Histologie Verhalten von Chondrozyten auf Quallenkollagen im Vergleich zu Wirbeljerkollagen in 2D und 3D Material und Methoden Ergebnisse Spreading Assay Zellkultur in 3D Diskussion Was bewirken die physikalischen EigenschaSen? Material und Methoden Ergebnisse Diskussion Potenjal für Redifferenzierung Einleitung Material und Methoden Ergebnisse und Diskussion Zusammenfassende Diskussion Zusammenfassung und Ausblick Veröffentlichungen Literaturverzeichnis...120

9 Danksagung Für meine Doktorarbeit schulde ich sehr vielen Menschen einen herzlichen Dank. Besonders möchte ich mich bei meinem Doktorvater Prof. Holger Notbohm bedanken, der mich großarjg unterstützte, immer ein offenes Ohr für meine Fragen hake, mir alle Freiheiten ließ und der vor allem durch seine Entspanntheit bezüglich Kind/Elternzeit mir Mut machte, die Arbeit trotzdem beenden zu können. Nicht minder gilt mein Dank meinen Chefs bei CRM, Chrisjan Koch, Dr. Levent Piker und Dr. Peter Krost, die mir außerplanmäßig ermöglichten, eine Doktorarbeit anzuferjgen, mir dabei freie Hand ließen und mir stets ihr Vertrauen entgegen brachten. Im Labor halfen mir viele Hände: Heiko Steenbock machte geduldig die Kollagenanalysen und RT- PCRs und war immer für meine Fragen zu haben, Alex Tiedke und Barbara Bruhn waren stets hilfsbereit bei Fragen in der Zellkultur oder Histologie, Gabriele Rulik ging auf spontane Spezialwünsche ein und Birgit Hoyer (TU Dresden) machte diverse REM- Aufnahmen und war immer wieder für einen Erfahrungsaustausch offen. Ganz besonders Danke ich dabei Kirsjn Plötze- Marjn, die neben ihrer grandiosen, umfangreichen Hilfe im Labor mir mit ihrer guten Laune den Alltag versüßte. Mit Prof. Jürgen Brinckmann konnte ich mich immer wieder austauschen und er las aufmerksam das Manuskript zur Veröffentlichung und meine Bachelor- Studenten Robert und Marjna leisteten wertvolle Hilfe. Außerdem bin ich dem ganzen Insjtut sehr dankbar, dass sie mich so herzlich aufgenommen haben, so viel Verständnis für meine neue Situajon nach der Geburt meiner Tochter aukrachten und sich für mich und über sie freuten. Darüber hinaus danke ich Robert Wendlandt und dem gesamten Labor für Biomechanik für die Möglichkeit und die Hilfe, jederzeit (!) dort die Materialprüfmaschine benutzen zu können. Im Vorfeld der Doktorarbeit leisteten bereits die Kollegen Astrid, Jessi, Kathrin, Tillman und Dr. Silke Erdmann des KTE eine außerordentlich gute Leistung, indem sie mir mit ihrer guten Laune die Uni Lübeck und den Gedanken an eine Doktorarbeit schmackhas gemacht haben. Silke half mir dann auch unermüdlich, mich in das Handwerk der Zellkultur einzuweisen. Mein Dank gilt auch meinen Freunden, die für die angespannte Situajon und den daraus folgenden Zeitmangel Verständnis zeigten und mich mental immer wieder aukauten. Ganz besonders danke ich dabei Yvonne, mit der ich mich über Stajsjkprobleme austauschen konnte und mit der ich gemeinsam die letzte zähe Phase der Doktorarbeit das Schreiben zeitgleich durchmachte und wir uns somit immer wieder antreiben konnten. Ganz besonders danke ich aber meiner Familie. Beide Omas sprangen gerne mal zum Babysiken ein, um mir etwas Zeit zu verschaffen. Lars musste os Rücksicht auf meine Zeitplanung nehmen und mich des öseren als Nervenbündel ertragen. Auf meine Tochter Alma bin ich besonders stolz, da aus ihr in dieser Zeit ein wunderbares Menschlein geworden ist, obwohl sie so os auf mich verzichten musste oder ich beim Spielen mit den Gedanken doch nicht bei ihr war. Danke Euch allen!

10 2013 Abkürzungsverzeichnis C Grad Celsius 2D zweidimensional 3D dreidimensional ACT autologe Chondrozytentransplantajon AFM atomic force microscopy = RasterkraSmikroskopie AMIC autologe matrixinduzierte Chondrogenese AS Aminosäuren Aurelia Aurelia aurita BSA bovines Serumalbumin BSE bovine spongiforme Enzephalopathie CD Circulardichroismus cm Zenjmeter CO2 Kohlendioxid col Kollagen DAPI 4,6- Diamidin- 2- phenylindol DDR Disciodin- Domain Rezeptor DNA Desoxyribonukleinsäure E- Modul Elasjzitätsmodul EDC 1- Ethyl- 3- (3- dimethylaminopropyl)carbodiimid EZM extrazelluläre Matrix FA fokale Adhäsion FACIT fibril associated collagens with interrupted triple helices = fibrillenassoiziierte Kollagene FibLa fibrillär, langsam eingefroren FITC Fluoreszeinisothiocyanat g Erdbeschleunigung oder Gramm GAG Glykosaminoglykan h Stunde HAc Essigsäure HCl Salzsäure HPC humanes Plazentakollagen Hyl Hydroxylysin Hyp Hydroxprolin KCl Kaliumchlorid kd Kilodalton KH2PO4 Kalium- Dihydrogenphosphat kpa Kilopascal M Mol ma Milliampere MACI matrix- assoziierte Chondrozytentransplantajon mdeg millidegree 1

11 2013 mg Milligramm min Minute ml Milliliter mm Millimol mm Millimeter MMP Matrix- Metalloprotease MolLa molekular, langsam eingefroren MolSch molekular, schnell eingefroren MPa Megapascal mrna messenger RNA = Boten- RNA MSCs mesenchymale Stammzellen n Anzahl der Sjchproben n.b. nicht besjmmt NaCl Natriumchlorid NaH2PO4 Natrium- Dihydrogenphosphat NCBI Najonal Center for Biotechnology Informajon ng Nanogramm nm Nanometer p Signifikanzniveau PAGE Polyacrylamid- Gelelektrophorese PBS phosphate buffered saline = phosphatgepufferte Salzlösung pchs porcine Chondrozyten PEG Polyethylenglykol REM Rasterelektronenmikroskop RGD Arg- Gly- Asp RhEsc Rhopilema esculentum RhHisp Rhopilema hispidum RhNom Rhopilema nomadica rpm rotajons per minute = Rotajonen pro Minute RT Raumtemperatur RT- PCR reverse transcriptase polymerase chain reacjon = Reverse Transkriptase- Polymerase- Kekenreakjon SDS Natrium- Dodecylsulfat T Tag der Probennahme TEM Transmissionselektronenmikroskopie TES N- [Tris(hydroxymethyl)- methyl]- 2- aminoethansulfonsäure TGF- β transforming growth factor TRIS Tris(hydroxymethyl)- aminomethan TSE transmissible spongiforme Enzephalopathie U Unit w/v Masse / Volumen WT Wirbeljer µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer 2

12 2013 Zusammenfassung Knorpel ist aufgrund der geringen Durchblutung ein Gewebe mit nur limijertem Selbstheilungspotenjal. Nicht oder ungenügend behandelte Defekte, die durch Entzündungen oder mechanische Einflüsse entstehen können, machen über kurz oder lang eine Knieprothese notwendig. Daher steht die Weiterentwicklung des Tissue Engineerings von Knorpel in speziellem Fokus der Forschung. Eine erfolgversprechende Methode ist die sogenannte Matrix- assoziierte autologe Chondrozytentransplantajon (MACI), bei der Knorpelzellen aus einem unbelasteten Bereich des Gelenkes entnommen werden und, nach einer Proliferajonsphase in vitro, auf einer Trägersubstanz, der sogenannten Matrix, in den Knorpeldefekt implanjert werden. Als Materialien für die Matrices werden sowohl synthejsche als auch biologische Materialien wie Alginat, Agarose, Chitosan oder Hyaluronsäure verwendet. Speziell Kollagen wird dabei als besonders geeignet angesehen, da es der Hauptbestandteil des Knorpels ist und daher die Knorpelzellen auf diesem Substrat die natürlichen extrazellulären Signale vermikelt bekommen. Dadurch sollten sie eher ihren chondrozytären Phänotyp erhalten, der notwendig ist, um einen hochwerjgen, hyalinen Knorpel mit einem hohen Anteil an Kollagen Typ II zu resynthejsieren. Kollagen ist ein bei allen mehrzelligen Tieren sehr häufig vorkommendes Strukturprotein der extrazellulären Matrix (EZM). Es besteht aus einer Tripelhelix, deren Monomere aus ca Aminosäuren bestehen. Für Kollagen typisch ist dabei das AuSreten der Aminosäure L- 4- Hydroxyprolin, das durch die poskranslajonale Hydroxylierung von Prolin enzymajsch gebildet wird. Weiterhin typisch ist die sich stets wiederholende Abfolge der Aminosäuren Gly- Xaa- Yaa, wobei an der X- Posijon sehr häufig ein Prolin und an der Y- Posijon ein Hydroxyprolin zu finden sind. Glycin und Prolin ermöglichen durch ihre geringe Größe eine enge Wicklung der Spirale und Hydroxyprolin bildet WasserstoLrücken zwischen den Polypepjden, die für die Stabilität des Kollagens sorgen (Engel 2005, Brinckmann 2005, Birk 2005). Die sogenannten Monomere lagern sich in vivo nach der Synthese zu größeren, organisierten Aggregaten zusammen, den sogenannten Fibrillen. Bisherige Quellen für Kollagen sind meist bovinen oder porcinen Ursprungs. Ein wesentlicher Nachteil ist neben religiösen oder ästhejschen Gesichtspunkten der, dass sie Krankheiten wie BSE (bovine spongiforme Enzephalopathie) übertragen können. Hinzu kommt, dass aus diesen Quellen kein Kollagen Typ II verwendet werden darf, was der Hauptbestandteil der Kollagene im Knorpel darstellt, da dieses Kollagen Arthrose auslösen kann. Daher kommen hier hauptsächlich Kollagene vom Typ I und / oder Typ III zum Einsatz. Einige bereits auf dem Markt befindliche Produkte weisen mehr oder 3

13 2013 weniger gute Resultate bei der Knorpelregenerajon auf. Aufgrund der vorher genannten Gesichtspunkten ist es jedoch angebracht, ein alternajves Kollagen aus Invertebraten auf seine Eignung zur Knorpelregenerajon hin zu untersuchen. Quallen als Kollagenquelle eignen sich hier besonders gut, da das Kollagen angesichts ihrer einfachen Bauweise ohne größeren Aufwand isoliert werden kann. Außerdem ist davon auszugehen, dass dieses Kollagen wegen eines fehlenden Zentralnervensystems der Quallen kein BSE übertragen kann (Imran 2011 a und b, Prusiner 1998). Quallenkollagene sind bereits in den Fokus der Medizintechnik gerückt, besonders hervorzuheben sei hier die Herstellung einer mit Zellen besiedelbaren Matrix (Song 2006). Jedoch wurde bisher noch kein Augenmerk auf die Verwendung von Quallenkollagen zur Knorpelregenerajon gelegt. Daher war das Ziel der vorliegenden Arbeit, Kollagene aus vier verschiedenen Quallenarten näher zu untersuchen, daraus physikalisch variierbare Matrices herzustellen und diese Varianten in der Zellkultur in ihrer Fähigkeit zu untersuchen, den chondrozytären Phänotyp zu erhalten. Die physikalischen Varianten beinhalteten die verschiedenen molekularen Strukturen des Kollagens (d.h. molekular und fibrillär), Variajonen der Steifigkeit sowie in einem gewissen Umfang einer Variajon der Porengröße, da alle diese Faktoren auf das Zellschicksal Einfluss haben. Dem Einfluss der Steifigkeit wurde hier besonderes Augenmerk zuteil, da vorherige Arbeiten der Arbeitsgruppe in 2D gezeigt haken, dass eine geringe Steifigkeit von etwa 4 kpa den chondrozytären Phänotyp am besten bewahrt. Dies äußerte sich in einer geringen Ausbildung des Akjnskeleks, einer hohen Kollagen Typ- II- Expression bei einer gleichzeijg geringen Typ- I- Expression und einer geringeren Proliferajonsrate der Zellen (Schuh 2010). Da sich Ergebnisse aus 2D- Versuchen nicht ohne Weiteres auf 3D übertragen lassen, musste für die Entwicklung einer maßgeschneiderten Matrix eine geeignete Steifigkeit gesucht werden. Die Steifigkeit einer Matrix kann über eine Veränderung der Substratkonzentrajon, der Porengröße bzw. - dichte sowie über die Anzahl der Quervernetzungen verändert werden. Die ersten beiden Varianten bringen jedoch Änderungen z.b. in den Adhäsionsstellen der Zellen und der Diffusion mit sich und nur über eine Variajon der Quervernetzung kann ohne weitere Nebeneffekte die Steifigkeit variiert werden. Bisherige Modelle waren für die hiesige Fragestellung nicht hilfreich, da sie wegen der schlecht regulierbaren EigenschaSen selten Kollagen verwendeten und / oder die Steifigkeit wurde auf Kosten von sekundären Effekten variiert, die eine ausschließliche Untersuchung des Einflusses der Steifigkeit auf die Zellen unmöglich machte. Selbst wenn die Variajon über die Quervernetzung erfolgte, so lag die erreichte Steifigkeit nicht höher als 1,8 kpa (Keogh 2010, Lee 2001 a), was für eine sinnvolle Untersuchung des Einflusses der Steifigkeit auf die Zellen nicht ausreichte. Gewebe weisen unterschiedliche Steifigkeiten auf, wobei das gesamte Gewebe deutlich steifer ist als die sogenannte Mikroumwelt um eine Zelle herum. So hat Knorpel eine Steifigkeit im 4

14 2013 Bereich von MPa, Chondrozyten jedoch in ihrer Mikroumwelt eine Steifigkeit von etwa 20 bis 25 kpa. Weichere Gewebe liegen im Bereich von 1 kpa (Gehirn), ca. 3 kpa (Fek) bis ca kpa (Muskel) und steifere etwa kpa (Osteoid im Knochengewebe, Buxboim 2010). Um aussagekräsige Daten über den Einfluss der Steifigkeit auf Chondrozyten zu erhalten, war es daher sinnvoll, die Matrix in einem Bereich von etwa 5 bis 40 kpa variieren zu können. Die Analysen der Quallenkollagene erbrachte, dass alle vier Sorten deutlich geringere Hydroxyprolin (Hyp)- Gehalte aufwiesen, jedoch relajv hoch glykosiliert waren. Dies war bereits aus der Literatur für diverse andere und z.t. auch der hier verwendeten Kollagene bekannt (Song 2006, Kimura 1985), musste jedoch der Vollständigkeit halber zur Beschreibung des Ausgangsmaterials vorgenommen werden. Durch den geringen Hyp- Gehalt liess sich auch die geringe Schmelztemperatur von ca. 30 bis 35 C erklären. Wie spätere Untersuchungen zur Quervernetzung verdeutlichten, konnte jedoch die Schmelztemperatur der Kollagene über 50 C erhöht werden, wodurch auch die Quallenkollagene für das Tissue Engineering nutzbar werden. In der Struktur unterschieden sich die Kollagene z.t. deutlich, so ist das Kollagen von Aurelia aurita ein Heterotrimer, wohingegen alle Kollagene der Rhopilema- Gakungen Homotrimere sind. Durch die hohe Glykosilierung entsprachen daher diese eher dem Wirbeljerkollagen Typ II und das aus Aurelia aurita war vergleichbar mit Wirbeljerkollagen Typ V. Fibrillenbildung in vitro war mit allen Kollagenen möglich; dabei bildeten sich verhältnismäßig dünne Fibrillen mit einem mikleren Durchmesser von ca. 35 bis 53 nm. Humanes Plazentakollagen I/III als Vergleich hingegen bildete quergestreise Fibrillen von etwa 88 nm. Diese Querstreifung mit einem Abstand von 67 nm ist ein typisches Merkmal der fibrillenbildenden Kollagene; sie konnte bei den Quallenkollagenen jedoch nur bei dem aus Rh. esculentum mit einem Abstand von ebenfalls ca. 67 nm nachgewiesen werden. Nach bisherigem Wissen war dies die erste Arbeit, die quergestreise Fibrillen aus Quallenkollagen in vitro darstellen konnte. Ausführliche Untersuchungen zur Quervernetzung wurden angestellt, um eine geeignete Kollagenkonzentrajon, Einfrierrate (diese hat Auswirkungen auf die Porenstruktur) und Quervernetzung der Matrices zu erreichen, bei denen die Steifigkeit opjmal variiert werden konnte. Es zeigte sich, dass Matrices aus molekularem Kollagen der Konzentrajon 20 mg / ml bei einer Einfrierrate von etwa 0,1 bis 0,2 C / min die breiteste Variajon zuließ. Zudem kristallisierte sich die chemische Quervernetzung mikels 1- Ethyl- 3- (3- dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) als die geeignetere gegenüber der physikalischen Methode mit UV- Licht bei 254 nm heraus. Mit letzterer konnte in keinem Fall eine höhere Steifigkeit von ca. 4 kpa erreicht werden und Analysen der Matrices zeigten, dass die Fixierung unvollständig war und das Kollagen vermutlich dabei auch denaturiert wurde. Hingegen konnten mit unterschiedlichen EDC- Konzentrajonen Steifigkeiten von ca. 3 bis 40 5

15 2013 kpa erreicht werden. EDC wurde bereits als nicht- toxisch beschrieben, da es nicht in die Proteinverbindung eingebaut wird und es nach der Reakjon als ungisiger Harnstoff wieder ausgespült wird (Gelinsky 2008). Somit gelang es erstmalig, eine dreidimensionale Kollagenmatrix nur durch unterschiedlich starke Quervernetzungen in einem aussagekräsigen Steifigkeitsbereich zu variieren, um in späteren Zellkulturversuchen den Einfluss der Steifigkeit auf das Zellschicksal untersuchen zu können. Mit einem Spreading Assay mit porcinen Chondrozyten wurde dann die Auswirkung von Quallenkollagenen bei der Adhäsion im Vergleich zu diversen Wirbeljerkollagenen untersucht. Es zeigte sich nach 24 h, dass auf allen vier Quallenkollagenen wenigstens 80 % der Zellen nicht abgeflacht waren, vergleichbar mit dem Wirbeljerkollagen Typ II (93,2 ± 1,6 %) und im deutlichen Unterschied zu humanem Plazentakollagen (Typ I/III/V- Mischung) und Wirbeljerkollagen Typ I, auf denen nur 38,7 ± 12,1 % bzw. 53,8 ± 17,5 % der Zellen nicht abgeflacht waren. Die runde Zellform der Chondrozyten ist eines der Merkmale für die Konservierung des chondrozytären Phänotyps, daher erschloss sich hieraus, dass das Quallenkollagen zumindest in 2D geeignet ist, den chondrozytären Phänotyp zu erhalten. Ansatzweise wurde dies bereits von Osteoblasten gezeigt, ohne dass jedoch genauere quanjtajve Aussagen gemacht wurden. Von dieser Arbeitsgruppe wurde auch die Möglichkeit aufgezeigt, dass Wirbeljerzellen weniger über die typischen Kollagenrezeptoren Integrine als über Syndecane an Quallenkollagene binden (Addad 2012). Da bei Invertebraten bisher keine direkte Bindung von Integrinen an Kollagen nachgewiesen werden konnte (Heino 2009), gibt es womöglich keine ausreichenden oder aber abweichende Bindungsstellen für Integrine an Quallenkollagen. Dies konnte in der vorliegenden Arbeit ansatzweise auch durch Analysen bisher bekannter Kollagensequenzen von Cnidaria (Hydra spec. und Podocoryna; letztere nur bruchstückhas) gezeigt werden, jedoch wären für eine zweifelsfreie Aussage vollständige Sequenzen von Quallenkollagenen notwendig. Beide Rezeptortypen haben einen direkten Einfluss auf das Akjnskelek, jedoch bewirken Bindungen über Integrine eine andere Zellreakjon als über die Syndecane (Xian 2010, Okina 2012, Morgan 2007). Daher ist davon auszugehen, dass die Zellen auf Quallenkollagen anders beeinflusst werden als auf Wirbeljerkollagen. Gleichzeijg kommt jedoch auch der Quanjtät der Bindung eine wesentliche Rolle zu, wie anhand eines Substrat- Sämgungs- Modells diskujert wurde (Gaudet 2003). Möglicherweise bleiben die Zellen auf Quallenkollagen wegen zu wenig Bindungsstellen, verbunden mit einer sterischen Hinderung durch die Hydrathülle des hoch glykosilierten Kollagens, abgerundet. Auf Wirbeljerkollagen mit seinen Integrinbindungsstellen hingegen kommt es bei einer geringen Glykoslierung wie bei WT I zu einer 6

16 2013 Abflachung, auf WT II jedoch zu einer Abrundung, vermutlich ebenfalls wegen der hohen Glykosilierung. In Versuchen mit dreidimensionalen Matrices wurde dann ihre Anwendung für die Knorpelregenerajon untersucht. Als Maßstab für eine Beurteilung galt der Erhalt des chondrozytären Phänotyps, der sich in einer geringen Proliferajonsrate, einer hohen Expression von Kollagen II und einer geringen Expression von Kollagen I auf mrna- und Proteinebene manifesjerte. (Immun- )Histologische Analysen unterstrichen die quanjtajven Analysen. Zunächst konnte gezeigt werden, dass sich das Quallenkollagen aus Rh. esculentum (0,1 C/min auf - 20 C) mindestens so gut eignete wie eine ebenfalls selber hergestellte Matrix aus humanem Plazentakollagen und deutlich besser als eine bereits auf dem Markt befindliche Matrix für die Zellkultur aus einem porcinen Kollagen I/III- Gemisch (Opjmaix, Firma Matricel, Deutschland). Als Ursache hierfür wurde einerseits die geeignete Struktur der selber hergestellten Quallen- und Plazentakollagen- Matrices diskujert, andererseits die aus dem Spreading Assay erlangten Kenntnisse über die unterschiedliche Bindung von Wirbeljerzellen an Quallenkollagen. Des weiteren wurden unterschiedliche Matrixtypen aus Quallenkollagen auf ihre Eignung hin getestet. Dabei wurden solche aus molekularem Kollagen mit zwei verschiedenen Porenstrukturen sowie eine Variante aus fibrillärem Kollagen untersucht. Abgesehen davon, dass sich letztere Variante auch schlecht eignete, um gezielt die Steifigkeit zu variieren, war sie auch gänzlich als Matrix ungeeignet, da die Zellen hier weniger Kollagen II- Anteile synthejsierten als in den molekularen Varianten. Hinzu kam, dass sie so großporig war, dass die Zellen sich nur an den Kollagenstegen ansiedelten und somit sehr inhomogen verteilt waren, was sich auch in der nur lokal verteilten, neu synthejsierten Matrix in der Histologie widerspiegelte. Bei den molekularen Varianten erwies sich die bei 0,1 C/min auf - 20 C eingefrorene besser (Porengröße ca. 400 x 100 µm) als die bei 34 C/min auf - 80 C eingefrorene Porengröße ca. 850 x 70 µm). Erstere zeichnete sich neben höheren Kollagen- II Anteilen vor allem durch eine höhere Zellaufnahme bei der Besiedlung aus. Daher wurden in allen folgenden Versuchen diese Matrixvariajon verwendet. Zur Ermiklung einer geeigneten Steifigkeit in 3D wurden dann Quallenkollagen- Matrices mit den Steifigkeiten 3 kpa, 12 kpa und 42 kpa in der Zellkultur untersucht. Erstere erwiesen sich in der Zellkultur als nicht stabil genug und von den anderen beiden ging die Variante mit einer Steifigkeit von 12 kpa als besonders geeignet hervor. Dies stand in Übereinsjmmung mit Ergebnissen aus 2D (Schuh 2010) und war schlüssig zu erklären mit der erforderlichen Steifigkeit, die sich aus Messungen der Mikroumgebungen verschiedener Gewebe ergaben (Buxboim 2010). Obwohl dies die erste Arbeit 7

17 2013 war, in der unabhängig von anderen Faktoren (Substratkonzentrajon etc., s.o.) ein Einfluss der Steifigkeit aus Zellen in 3D gezeigt werden konnte, ist dieser Umstand nicht zu verallgemeinern, da auch hier die Bindung der Zellen vermutlich hauptsächlich über Syndecane und nicht über Integrine erfolgte, über die eigentlich die Beprobung der extrazellulären Matrix erfolgt. Schließlich wurde noch das Potenjal des Quallenkollagens zur Redifferenzierung von dedifferenzierten Chondrozyten untersucht. Es konnten Hinweise darauf gefunden werden, dass das Quallenkollagen hierzu besser geeignet ist als eine Matrix aus humanem Plazentakollagen, da die Zellen von ursprünglich etwa 20 % Typ II Anteil nach sieben Tagen 65,7 ± 14,0 % Kollagen Typ II mrna exprimierten. Somit könnten Matrices aus Quallenkollagen tatsächlich für die Anwendung in vivo bei der MACI eingesetzt werden, wofür eine Matrix mit Redifferenzierungspotenjal notwendig ist. Durch die im Rahmen dieser Forschungsarbeit gewonnenen Erkenntnisse konnte gezeigt werden, dass Quallenkollagen für die Knorpelregenerajon ein geeignetes Substrat darstellt, da es den chondrozytären Phänotyp durch seine EigenschaSen besonders bewahrt. Außerdem konnte die Matrix in ihren morphologischen und physikalischen EigenschaSen variiert werden, um die opjmale Variante zur Knorpelregenerajon zu ermikeln. Es zeigte sich, dass molekulare Matrices mit einer Porengröße von ca x 100 µm und einer Steifigkeit von etwa 12 kpa sich hierzu am besten eigneten. Die Erkenntnis, dass Wirbeljerzellen an Quallenkollagen mit einem anderen Mechanismus hasen als an Wirbeljerkollagen, könnte für weitere Fragestellungen der Medizintechnologie interessant sein. 8

18 1 Einleitung und Hintergrund 1 Einleitung und Hintergrund 1.1 Knorpel-Tissue Engineering Knorpel ist aufgrund seiner geringen Durchblutung ein schlecht regenerierendes Gewebe. Man unterscheidet entsprechend seiner Morphologie den hyalinen Gelenkknorpel, den faserigen Knorpel in Bandscheibe und Meniskus sowie den elasjschen Ohrknorpel. Gelenkknorpel ist ein mesenchymales Gewebe, das die Gelenkköpfe der Knochen bedeckt. Sein Zweck ist der Schutz des darunterliegenden Knochens vor Abrieb, er macht das Gelenk geschmeidig (Schmieren) und trägt zur Absorpjon von Erschükerungen bei. Defekte können durch Verletzungen, durch Verschleiß und häufig durch Gelenkentzündungen (Arthrijs) entstehen. In einer immer älter werdenden GesellschaS spielt daher die Heilung von Knieknorpeldefekten eine große Rolle. Denn durch die Reparajon kleinerer Defekte bis zu 12 mm² kann zumindest vorübergehend die Schmerzfreiheit und somit die Beweglichkeit des Pajenten wieder hergestellt werden und ein Ersetzen des Gelenks kann durch eine Prothese um Jahre verzögert werden (Perem 2010). Therapieansätze sind vielschichjg und gehen je nach Defektgröße von der Anbohrung des Knochens (Pridie- Bohrung, Mikrofrakturierung) über Transplantajon von Knorpel- Knochen- Zylindern bis zur Chondrozytentransplantajon (siehe Tabelle 1). Ziel aller Therapien ist dabei, einen möglichst hyalinen Knorpel mit einem hohen Anteil an Kollagen Typ II zu regenerieren. Sjmulajon körpereigener Mosaikplasjk, Osteochondral- Autologe Chondrozyten- Reparaturmechanismen Transplantajon (OCT) transplantajon (ACT) (Mikrofrakturierung, Pridie- Bohrung) Defekte bis 2 cm Defekte 2-4 cm Defekte 3-12 cm2 Tabelle 1: Empfohlene Techniken zur Knorpelrekonstruk[on entsprechend der Knorpeldefektgröße. Ein Plus steht dabei für möglich, drei Plus für empfohlen. Nach Gaissmaier 2003 Bei den knochenmarksjmulierenden Methoden der Mikrofrakturierung bzw. Pridie- Bohrung wird die Selbstheilung angeregt, indem mehrheitlich unspezifische Zellen einbluten und neue Matrix bilden. Hierbei entsteht jedoch hauptsächlich faseriger, überwiegend Kollagen Typ I- haljger Knorpel, der schlecht belastbar ist und daher relajv schnell wieder degeneriert. Für größere Defekte werden ganze Knorpel- Knochen- Zylinder entweder aus einer unbelasteten Stelle des Gelenks des Pajenten 9

19 1.1 Knorpel- Tissue Engineering (autogen) oder eines Spenders (allogen) in den entsprechend vorbereiteten Defekt transplanjert; diese Methode wird als Osteochondraltransplantajon (OCT) bezeichnet. Die Regenerajon verläus meist besser als bei der Mikrofrakturierung und hat den Vorteil, dass die zonale Strukturierung des Knorpels (siehe Abb. 3) erhalten bleibt. Entscheidende Nachteile sind jedoch, dass je nach Quelle des Transplantats entweder eigene Gelenke äußerst beschädigt werden oder durch allogenes Material Infekjonen drohen. Häufig kommt es durch die massive Schädigung der Knochenlamelle zur Bildung von Faserknorpel zwischen den Zylindern und / oder eine unebene Gelenkoberfläche der Knorpelmosaike führt durch Belastung zu einer erneuten Schädigung der therapierten Stelle. Bei der autologen Chondrozytentransplantajon (ACT) werden ebenfalls Knorpelstücke aus einem unbelasteten Teil des Pajentengelenkes entnommenen, jedoch ohne die massiven Schädigungen des Knochens wie bei der OCT. Nach der enzymajschen Herauslösung der Chondrozyten werden diese über mehrere Wochen in der Zellkultur vermehrt und später unter einen über den Defekt angenähten Periostlappen injiziert. Die Ergebnisse sind vielversprechend; eine Studie zeigte nach 2-9 Jahren mit 37 Pajenten in 80 % hyalinar[ger Knorpel, d.h. die biochemische Zusammensetzung entspricht dem gesunden Knorpel, jedoch wird die zonale Strukturierung nicht nachempfunden. In puncto Fesjgkeit und biochemischen EigenschaSen kommt der so neugebildete Knorpel nah an die EigenschaSen des hyalinen Gelenkknorpels heran und ist nicht zu vergleichen mit den EigenschaSen des Faserknorpels (Gaissmeier 2003). Die vielversprechende Methode der ACT hat inzwischen diverse Weiterentwicklungen erfahren, von denen die Matrix- assoziierte ACT (MACI bzw. MACT) die bedeutendste Weiterentwicklung darstellt. Bei der MACI werden die zu transplanjerenden Zellen unmikelbar vor oder während der Operajon auf eine dreidimensionale Zellträgermatrix gegeben und diese wird eingesetzt (siehe Abb. 1). Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode ist die leichtere Applikajon und somit verkürzte Operajonszeiten. Darüber hinaus benöjgt man keinen Periostlappen zur Abdeckung, was eine weitere Schädigung verhindert und Hypertrophie des Periostlappens vermeidet (Ferrem 2009). Die derzeit verwendeten Matrices in Europa sind MACI aus Schweinekollagen I/III (Genzyme, Naarden, Niederlande), Chondro- Gide (Geistlich Biomaterials, Schweiz), ein Kollagen I/III Fleece, ChondroCelect (TiGenix, Leuven, Belgien), CaReS Kollagen I Gel (Arthro Kinejcs Biotechnology GmbH; Österreich) und Novocart 3D (TeTeC Deutschland), ein Kollagen I Schwamm mit Chondroijnsulfat (Ferrem 2009, Nürnberger 2010). HyalograS C autograss ist ein Konstrukt, basierend auf der dreidimensionalen Matrix HYAFF aus Hyaluronsäure und den Zellen des Pajenten (Anika Therapeujcs, vormals Fidia Advanced Biopolymers, Italien). Daher ist bei Studien zur in vitro- Untersuchung der Wirksamkeit verschiedener Matrices sicherlich die Matrix HYAFF zum Einsatz 10

20 1.1 Knorpel- Tissue Engineering gekommen, auch wenn die Autoren angeben, HyalograS C autogras verwendet zu haben (z.b. Nürnberger 2010). Abbildung 1: Schema[scher Ablauf der MACI (Matrix- assoziierte autologe Chondrozytentransplanta[on). Dem Pa[enten wird in einer ersten Opera[on an einer unbelasteten Stelle gesunder Knorpel entnommen und die Chondrozyten daraus werden einige Wochen in vitro zur Vermehrung kul[viert. Die auf diese Weise proliferierten und dedifferenzierten Zellen werden auf eine Trägermatrix gegeben und das Konstrukt in einer zweiten Opera[on in den Knorpeldefekt eingesetzt. Basierend auf den guten Erfahrungen mit einer Matrix wurde schließlich das Verfahren der autologen matrixinduzierten Chondrogenese (AMIC) entwickelt (Behrens 2005). Hierbei wird eine Matrix mit Fibrinkleber auf einen mit Mikrofrakturierung behandelten Defekt gegeben. Die Matrix wird dadurch mit Zellen aus dem Knochenmark, hauptsächlich Vorläuferzellen und mesenchymalen Stammzellen (MSCs), durchdrungen, die mikels der körpereigenen Wachstumsfaktoren wie z.b. TGF- β zu Chondrozyten differenzieren und schließlich den Knorpeldefekt auffüllen. Die Kosten sind gegenüber der MACI deutlich reduziert, denn der Vorgang benöjgt nur eine Operajon und es müssen zwischenzeitlich keine Zellen kuljviert werden. Schließlich eniällt die Beschädigung gesunden Gewebes für die Zellgewinnung. Bisher gibt es etwa ein gutes Dutzend Studien zum Einsatz von AMIC im Pajenten. Dabei kam jeweils nur die Kollagenmembran Chondro- Gide von Geistlich zum Einsatz. Die Studien zeigen, dass die Methode vielversprechend ist, aber es werden weitere Langzeitstudien 11

21 1.1 Knorpel- Tissue Engineering benöjgt, um zu klären, ob das neu gebildete Konstrukt auch über zwei Jahre hinweg noch funkjonell und strukturell intakt ist (Gille 2013). Die beschriebenen matrixunterstützten Methoden sind in einer Vielzahl von Studien untersucht worden und sie wurden meist als sehr geeignet beurteilt. In allen Fällen jedoch werden Kollagene bzw. Hyaluronsäure aus dem Schwein für die Matrix verwendet. Dies hat den entscheidenden Nachteil, dass eine Übertragung von BSE oder Viren auf den Pajenten nicht ausgeschlossen werden kann, weswegen weiter Alternajven gesucht werden. 1.2 Kollagen Molekularer AuDau Kollagen ist ein Hauptbestandteil des Knorpels und darüber hinaus ein bei allen mehrzelligen Tieren sehr häufig vorkommendes Strukturprotein der extrazellulären Matrix (EZM). Es besteht aus einer Tripelhelix, deren Monomere aus ca Aminosäuren bestehen. Für Kollagen typisch ist dabei das AuSreten der Aminosäure L- 4- Hydroxyprolin, das durch die Hydroxylierung von einem bereits in das Molekül eingebauten Prolin durch die Prolylhydroxylase mit dem Coenzym Ascorbat gebildet wird. Weiterhin typisch ist die sich stets wiederholende Abfolge der Aminosäuren Gly- Xaa- Yaa, wobei an der X- Posijon sehr häufig ein Prolin und an der Y- Posijon ein Hydroxyprolin zu finden sind. Glycin und Prolin ermöglichen durch ihre geringe Größe eine enge Wicklung der Spirale und Hydroxyprolin bildet WasserstoLrücken zwischen den Polypepjden, die für die Stabilität des Kollagens sorgen (Engel 2005, Brinckmann 2005, Birk 2005) Kollagenfamilien und ihre Funk[onen Bisher sind beim Menschen 27 Kollagentypen bekannt, die in verschiedene Klassen unterteilt sind (siehe Tabelle 2). Aufgrund ihrer ungleichen EigenschaSen sind sie in der Lage, Geweben jeweils unterschiedliche Funkjonalitäten zu verleihen bzw. in Geweben unterschiedliche Funkjonen zu übernehmen. So kommen die fibrillenbildenden Kollagene in Geweben wie Zähnen und Knochen (Typ I), Glaskörper des Auges und Knorpel (Typ II) und Haut (Typ I, III und V) vor und bilden damit unter anderem die härtesten Gewebe, wie das Denjn der Zähne. Sie sind stabförmig und etwa 300 nm lang, bestehend aus drei gleicharjgen (Homotrimer) oder zwei- oder dreiförmigen (Heterotrimere) Alphakeken. Eingefasst werden die kollagenen Abschnike an ihren C- und N- Termini durch kurze, 12

22 1.2 Kollagen nicht- kollagene Pepjde, die Telopepjde. Das Molekül in dieser Erscheinungsform wird als Tropokollagen bezeichnet (Birk 2005). Da das Augenmerk in dieser Arbeit unter anderem aufgrund der Bedeutung des Kollagens Typ II im Knorpel nur auf die fibrillenbildenden Kollagene gerichtet wird, wird im Folgenden auch nur auf diese Familie näher eingegangen. Suprastruktur / Familie Kollagentyp Funkjonen Fibrillenbildende Kollagene I, II, III, V, XI, XXIV, XXVII bilden Fibrillen Fibrillen- assoziierte (FACIT) IX, XII, XIV, XVI, XIX, XX, XXI, XXII mit Fibrillen assoziiert, wichjg bei Fibrillierung netzbildende Kollagene IV, VI, VIII, X bilden flächige Netze in der Basalmembran verankernde Fibrillen VII Verankerungen in der Basalmembran transmembrane Kollagene XIII, XVII, XXIII, XXV Adhäsion von Zellen an EZM Muljplexin XV, XVIII Homotrimere, enthalten muljple tripelhelikale Domänen, tragen Glykosaminoglykane? XXVI? Tabelle 2: Überblick über die Kollagenfamilien, Kollagentypen und ihre Funk[onen. EZM= extrazelluläre Matrix. Nach Birk 2005, Brinckmann 2005 und Ricard- Blum Synthese fibrillenbildender Kollagene in vivo Im endoplasmajschen Rejkulum assoziieren zunächst die einzelnen Kollagenkeken zu einer Tripelhelix, dem sogenannten Prokollagen. Dieses besteht aus einer 300 nm langen helikalen Domäne in der Mike, die von einem tripelhelikalen Propejd am N- terminalen Ende und einem globulären Propepjd am C- terminalen Ende eingefasst wird. Während oder nach dem Transport in die extrazelluläre Matrix werden die Propepjde durch C- bzw. N- Proteinasen eniernt. Die so entstandenen Tropokollagene lagern sich nun spontan zu Fibrillen an (Kadler 1996). Hierbei scheint dem C- Propepjd eine wichjge Rolle zuzukommen, indem es vorzeijge Fibrillierung verhindert. Das N- Propepjd dagegen hat Einfluss auf die Fibrillenform und - durchmesser (Hulmes 2002). Der Vorgang der Fibrillenbildung ist entropisch gesteuert. Hydrophobe Wechselwirkungen mit der Umgebung bewirken die im Durchmesser kreisförmige Anordnung, wodurch sich das kleinstmögliche Verhältnis von Oberfläche zu Volumen ergibt (Kadler 1996). Das Kollagen wird jedoch zunächst noch mehreren poskranslajonalen Modifikajonen unterworfen, die enzymajsch gesteuert sind. Direkt nach der Proteinsynthese und vor der Bildung der Tripelhelix werden einige Prolinreste je nach Posijon über die Prolyl- 4- Hydroxylase oder die Prolyl- 3-13

23 1.2 Kollagen Hydroxylase hydroxyliert. Zusätzlich werden ein gewisser Anteil an Lysinresten durch die Lysylhydroxylase hydroxyliert; beide Vorgänge erfordern Ascorbat ( Vitamin C ) als Coenzym. Während der Hydroxylysierungsgrad von Prolin innerhalb der (humanen) Kollagentypen und auch von Gewebetypen nicht sonderlich variiert (etwa 50 %), ist der Grad der Hydroxylierungrung von Lyzeen innerhalb der Kollagentypen mit % sehr variabel (Miller 1984) und der Hydroxylierungsgrad von Kollagen Typ I kann sich zwischen den Geweben im physiologischen und pathologischen Zustand erheblich unterscheiden (Uzawa 2003). Ebenfalls vor der Bildung der Tripelhelix werden nun Hydroxylysinreste stufenweise zu Galactosylhydroxylysin (Monosaccharid) beziehungsweise Glucosylgalactosylhydroxylysin (Disaccharid) über die Enzyme Galactosyltransferase (EC ) beziehungsweise Glucosyltransferase (EC ) modifiziert (Yamauchi 2012). Nach der Ausschleusung des Kollagens, dem Abtrennen der Propejde und der Fibrillenbildung erfolgen noch kovalente Quervernetzungen zwischen den Helices, die die Fibrillen zusätzlich stabilisieren. Kurz zusammengefasst werden Lysin- und Hydroxylysinreste der Tripelhelix und der Telopepjde durch die Lysyloxidase zu einem Aldehyd umgewandelt. Diese gehen zunächst Zweifachbindungen und schließlich Dreifachbindungen, d.h. vollwerjge Quervernetzungen untereinander ein. Die Variajonen der Quervernetzungen scheinen dabei weniger abhängig vom Kollagentyp als vom jeweiligen Gewebe zu sein (Eyre 2005). An die Fibrillen lagern sich noch häufig FACITs (fibril associated collagens with interrupted triple helices) an, die eine wichjge Rolle bei der Ordnung von Fibrillen bzw. Begrenzung des Fibrillendurchmessers spielen (Birk 2005, Wokon 1988, Hagg 1998). Ebenso wie diese haben die poskranslajonalen Modifikajonen einen Einfluss auf die Fibrillenbildung. Die Hydroxylierung von Lysinresten und damit die Glykosilierung bedingen den Umfang der Kollagenhelix; eine hohe Glykosilierung des Moleküls führt zu dünneren Fibrillen (Notbohm 1999). Dabei ist der Grad der Glykosilierung entsprechend dem Grad der Hydroxylierung von Lysin nicht ausschließlich abhängig vom Kollagentyp, sondern auch davon, in welchem Gewebe das Kollagen gebildet wird. So ist Kollagen I hoch glykosiliert, wenn es von kornealen Fibroblasten, jedoch nicht von Fibroblasten der Sehnen gebildet wird (Birk 2005) AuDau Fibrille in vivo In unipolaren Fibrillen lagern sich die Helices in der gleichen Ausrichtung ihrer C- und N- Enden an, wobei die nächste danebenliegende Helix um 234 Aminosäuren versetzt liegt (siehe Abb. 2). So ergeben sich Bereiche, die nach Anfärbung in der Elektronenmikroskopie durch die Lücken (gap) als 14

24 1.2 Kollagen weniger dicht erscheinen und solche, in denen alle sich überlappenden Teile der Moleküle (overlap) als kompakte Zone sichtbar werden. Dadurch ergeben sich die für die Fibrillen typischen Querstreifungen. Die Abfolge der gap- und overlap- Bereiche, die D- Periode, beträgt dabei in der Regel 67 nm. Fibrillen erreichen eine Stärke von ca. 5 nm bis zu 500 nm (Hulmes 2002, Eyre 2002, Wokon 1988). Mehrere Fibrillen können sich zu größeren Aggregaten zusammenlagern. Dabei unterscheidet man je nach Größe des Aggregats mehrere Fibrillentypen, wobei die Übergänge fließend sind: Mehrere Tropokollagene lagern sich demnach zu Mikrofibrillen zusammen, diese wiederum ergeben zusammen die Fibrille und mehrere Fibrillen schließlich eine Kollagenfaser. Abbildung 2: AuDau einer quergestreiien Fibrille. A: Die tripelhelikalen Monomere lagern sich in gleicher Ausrichtung ihrer C- und N- Enden an, wobei sie jeweils um 67 nm versetzt liegen (D- Periode). Dadurch ergeben sich Bereiche mit Lücken, die sich nach Anfärbung elektronenmikroskopisch nachweisen lassen. B: Skizze einer Kollagenfibrille im Elektronenmikroskop mit der typischen Bänderung. Nach Kadler Knorpel morphologischer AuDau Mit 65 % bis 80 % ist das Wasser der Hauptanteil des hyalinen Knorpels. Vom Trockenanteil wiederum stellen Kollagen Typ II und die Proteoglykane mit jeweils 45 % und 35 % die Hauptanteile dar; der Rest ergibt sich aus Glykoproteinen und Zellen. Im ausgereisen Knorpel sind nur 10 % des 15

25 1.3 Knorpel Gesamtvolumens Zellen (Chondrozyten). Diese erhalten die Nährstoffe nur über Diffusion aus dem umgebenden Gewebe, da der Knorpel selber ein avaskuläres, nervenfreies und alymphajsches Gewebe ist. Dieser Umstand bewirkt auch die reduzierte Regenerajonsmöglichkeiten defekter Knorpelstellen. Morphologisch setzt sich der Gelenkknorpel aus vier Zonen zusammen: der Knorpeloberfläche, der intermediären Zone, der jefen Zone und dem kalzifizierten Knorpel (siehe Abb. 3). Letzterer ist eine relajv dünne Gewebeschicht direkt über dem subchondralen Knochen. Zwischen der jefen Zone und dem kalzifizierten Knorpel ergibt sich durch die strukturellen Unterschiede der Gewebe eine dünne Grenzlinie, die sogenannte Tidemark. Abbildung 3: Schema[scher AuDau des Gelenkknorpels. Die Prozentangaben geben den ungefähren Anteil der jeweiligen Zone am gesamten Knorpel an. Nach Pere] 2010 Die Verteilung der extrazellulären Matrix und der Chondrozyten sind sehr unterschiedlich in diesen Regionen; damit einhergehend übernehmen sie auch unterschiedliche Funkjonen. In der Knorpeloberfläche sind die Kollagenfibrillen parallel zur Oberfläche angeordnet, die Chondrozyten sind länglich und synthejsieren hohe Konzentrajonen an Kollagen und einen geringen Anteil an Proteoglykanen; zusätzlich ist hier der Wassergehalt am höchsten. Durch die parallel angeordneten Fibrillen wird der Knorpel nach außen abgeschlossen und vor Abrieb geschützt. In der intermediären Zone sind die Fibrillen zufällig angeordnet und die Konzentrajon von Proteoglykanen ist höher. In der jefen Zone ist der Wassergehalt am geringsten, während hier die höchste Konzentrajon an 16

26 1.3 Knorpel Proteoglykanen zu finden ist. Dazu sind die Fibrillen senkrecht zur Oberfläche angeordnet und abgerundete Chondrozyten sind in Türmchen in der gleichen Ausrichtung angeordnet. Dicke Kollagenbündel reichen durch die Tidemark bis in den kalzifizierten Knorpel hinein, wodurch eine stabile Verbindung zwischen diesen beiden Gewebeschichten erreicht wird. Seine biomechanischen EigenschaSen, die Fesjgkeit und Viskoelasjzität, erhält der Knorpel vor allem durch das Netzwerk aus Kollagen und die hohe Konzentrajon an Proteoglykanen. Letztere binden durch die starke negajve Ladung ihrer Seitenkeken Wasser, das bei Stoßeinwirkungen abgegeben wird, wodurch die einwirkende KraS aufgenommen wird. Bei Entspannung wird das Wasser schließlich später wieder aus dem umgebenden Gewebe resorbiert (Perem 2010) AuDau molekulare Ebene Moleküle Den größten Teil des Knorpels neben dem Wasser und Kollagen II bildet Aggrecan, einem der wichjgsten extrazellulären Proteoglykane. Es bildet riesige Komplexe, deren zentraler Bestandteil ein langes Hyaluronsäuremolekül ist (siehe Abb. 4). Im Abstand von 40 nm sind an diesem Molekül Aggrecanmoleküle (Core- Proteine) nicht- kovalent gebunden, an denen wiederum Glykosaminoglykane (GAG) angeheset sind. Diese setzen sich zusammen aus Keratansulfat- und Chondroijnsulfatkeken. Die stark negajv geladenen GAGs binden sehr gut Wasser, was zu der gelarjgen und elasjschen Konsistenz des Knorpels führt. Für die Zelladhäsion spielt daneben noch das Glykoprotein Fibronekjn eine große Rolle. Es ist ein aus zwei heterodimeren Polypepjdkeken zusammengesetztes Protein, das Bindungsstellen unter anderem für Kollagen und Heparin besitzt und an welches über das RGD- Mojf auch Zellen binden. Dieses RGD- Mojf ist eine Abfolge der Aminosäuren Arginin (R), Glycin (G) und Asparaginsäure (D), die von den Zellen über membrangebundene Rezeptoren, den Integrinen, erkannt wird. Durch seine Vielzahl an Bindungsstellen stellt das Fibronekjn somit ein universelles Bindeglied zwischen den vielen Bausteinen der extrazellulären Matrix und den Zellen dar (Lodish 2001). Darüber hinaus gibt es noch eine Vielzahl anderer Moleküle wie das COMP (carjlage oligomeric matrix protein) und kleinere Proteoglykane wie Biglycan, Decorin und Fibromodulin, deren Funkjon beispielsweise das Binden von Wachstumsfaktoren oder die Unterstützung der Fibrillenbildung ist (Chen 2006). 17

27 1.3 Knorpel Abbildung 4: Schema[scher Überblick über die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix um einen Chondrozyten. Dargestellt sind nur die häufigsten Proteine, für die genauere Zusammensetzung siehe Beschreibung im Text. Nach Chen et al Die Hauptkomponente auf molekularer Ebene des Knorpels ist das Kollagen Typ II. Daneben treten aber auch Typ III, VI, IX, X, XI, XII und XIV im adulten Knorpel auf. Die hauptsächlichen Kollagene II, IX und XI variieren nicht wesentlich innerhalb der bereits beschriebenen Knorpelzonen, jedoch ist eine deutliche Veränderung während der Reifung des Knorpels festzustellen. Treten im jungen Knorpel noch feine Fibrillen mit einer Zusammensetzung von 10 % Kollagen IX, 10 % Kollagen XI und 80 % Kollagen II auf, so erhöht sich doch der Anteil Typ II im adulten Knorpel auf 90 %, was zu dickeren Fibrillen führt (Eyre 2002) Kollagenzusammensetzung in den Zonen/Chondron Im reifem Gelenkknorpel ist die Matrix der intermediären und jefen Knorpelzone um einzelne oder mehrere Chondrozyten in drei konzentrisch angeordnete Regionen unterteilt (siehe Abb. 5): eine perizelluläre, eine territoriale und eine interterritoriale Matrix (Aigner 2003, Poole 1984). Die 18

28 1.3 Knorpel Abbildung 5: Lokale Unterscheidung der Matrix um die Chondrozyten. A: Die Matrix in der näheren Umgebung der Chondrozyten wird unterschieden in die territoriale Matrix sowie die interterritoriale Matrix, die die Zellverbünde in ihren territorialen Matrices verbindet. B: Die Chondrozyten selber sind noch von einer perizellulären Matrix und einer angrenzenden perizellulären Kapsel umgeben. Chondrozyt, perizelluläre Matrix und perizelluläre Kapsel ergeben eine funk[onelle Einheit, das sogenannte Chondron. transparente perizelluläre Matrix und die territoriale Matrix werden noch durch eine fibrilläre perizelluläre Kapsel (Poole 1984) getrennt. Chondrozyt(en), perizelluläre Matrix und Kapsel ergeben zusammen eine funkjonelle Einheit, das sogenannte Chondron. Die molekulare Zusammensetzung im Chondron ist äußerst komplex und auch hier zonal unterschiedlich; die molekulare Zusammensetzung entspricht eher einer Basalmembran (Kvist 2008). Neben Proteoglykanen finden sich Kollagen II, IX, XI und das ausschließlich in der perizellulären Matrix vorkommende Kollagen VI, wo es direkt mit der Zelloberfläche interagiert (Poole 1988, 1992). Ihm wird eine duale Funkjon zugeschrieben einerseits die Beeinflussung der perizellulären Matrixarchitektur über das Zusammenspiel der Matrixkomponenten (Wilusz 2012), andererseits die Verankerung der Zellen in der Matrix über Rezeptoren sowie die Beteiligung an Signalwegen (Poole 1997). Während sich Kollagen IX hauptsächlich im äußeren Rand der Chondronkapsel befindet (Poole, Wokon 1988), ist das zellassoziierte Kollagen XI in der perizellulären Matrix anzutreffen (Poole 1991). Die Fibrillen der perizellulären Matrix sind ausgesprochen dünn, diese umfassen Fibrillen (etwa 5 nm) und Fasern ( nm) (Eyre 2002, Wokon 1988). Die territoriale Matrix enthält neben dem dominierenden Kollagen Typ II noch die Kollagene XI und IX. Die interterritoriale Matrix macht den größten Anteil aus und besteht aus Proteoglykanen und Kollagenfibrillen mit den größten Durchmessern (Perem 2010). Auch die physikalischen EigenschaSen sind durch die molekularen Zusammensetzungen beeinflusst; 19

29 1.3 Knorpel so ist die perizelluläre Matrix mit einer Steifigkeit um 25 kpa relajv gering, wohingegen die der interterritorialen Matrix im Bereich von Megapaskal (MPa) liegt (Alexopoulos 2005 a und b) Kollagen II- IX- XI- Fibrille Abbildung 6: AuDau einer dünnen Kollagenfibrille. A: Querschni\. Ein Kern aus jeweils zwei Kollagen II- (blau) und Kollagen XI- (gelb) Mikrofibrillen werden von zehn Kollagen I I- Mikrofibrillen ummantelt. Außen auf liegen Kollagen- IX Moleküle. B: Skizze der gesamten Fibrille. Die N- terminalen Domänen von Kollagen X I ragen vom Inneren der Fibrille nach außen. Nach Kadler et al Die Fibrillen, die sich aus den Hauptkomponenten Kollagen II, IX und XI bilden, sind äußerst stabile Konstrukte (Mendler 1989, siehe Abb. 6). Das Grundgerüst der heterogenen Fibrillen bilden die Kollagenstränge von Typ II, in das sich die Moleküle von Typ XI einflechten. Außen ist die Fibrille mit FACIT- Kollagenen, hauptsächlich Typ IX, versehen, das kovalent gebunden ist (Seibel 2006). Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass dünne Fibrillen von etwa 20 nm Durchmesser einen Kern von vier Mikrofibrillen à 4 nm Durchmesser aufweisen, von denen zwei aus Kollagen XI und die anderen zwei aus Kollagen II bestehen. Diese werden ummantelt von 10 Mikrofibrillen Kollagen II und auf der Oberfläche der Fibrille liegen schließlich die Kollagen IX Moleküle (Holmes 2006). Typ IX Kollagen reguliert einerseits in einer konzentrajonsabhängigen Funkjon die Durchmesser von Typ II Fibrillen, daher trik es gehäus in den dünnen Fibrillen der perizellulären Kapsel auf (Poole und Wokon 1988, Wokon 1988). Zusätzlich ist es auch zuständig für die Quervernetzung mit Kollagen II Molekülen oder anderen Kollagen IX Molekülen (Eyre 2002). Die globulären Enden von Kollagen IX 20

30 1.3 Knorpel dienen wahrscheinlich der Einbindung der Fibrille in die Proteoglykanmatrix (Seibel 2006). Es bedarf daher einer fein abgesjmmten Zusammensetzung der Kollagene, damit eine funkjonsfähige Fibrille in vivo entsteht. 1.4 Zelle-EZM-Kontakt Bedeutung Die extrazelluläre Matrix erfüllt viele wichjge Aufgaben. Primär gibt sie dem Gewebe seine Stabilität und physiologischen EigenschaSen, wie beispielsweise die Elasjzität und Stoßfesjgkeit des Knorpels. Darüber hinaus dient sie aber auch als Speicher für beispielsweise Wachstumsfaktoren, über die die Zellen miteinander kommunizieren, als Substrat zur Zellmigrajon (z.b. für die Entwicklung von Geweben oder bei der Wundheilung) und sie beeinflusst zu einem nicht unerheblichen Teil über ihre physikalischen EigenschaSen das Zellschicksal (Lodish 2001). Zahllose Arbeiten haben inzwischen deutlich werden lassen, dass die Steifigkeit der Matrix (in vitro) oder des Gewebes (in vivo) einen Einfluss auf Zellfunkjonen wie Kontrakjon, Migrajon, Proliferajon, Zellorganisajon und auch Apoptose haben (zusammengefasst in Buxboim 2010). Ebenso spielt die Beschaffenheit der Matrix bei der Besjmmung des weiteren Werdegangs embryonaler und adulter Stammzellen eine entscheidende Rolle (Evans 2009, Guilak 2009) Rezeptoren der Zelle Die Zelle nimmt über ein komplexes System auf der Zellmembran Kontakt zur extrazellulären Matrix auf. Diese sogenannten fokale Adhäsionen (FA) können mehrere µm groß sein und sie verbinden über Integrine die EZM mit kontrakjlen Fasern in der Zelle, den Akjnfilamenten. Sie werden von unterschiedlichen Zelltypen gebildet und auch in Chondrozyten wurden Komponenten davon nachgewiesen (Sanz- Ramos 2012, Whitney 2012, El- Bikai 2010, Lo 2006). Neben den transmembranen Proteinen wie Integrin und Syndecan spielen noch über 100 andere Proteine auf der Zytoplasmaseite der Zelle eine große Rolle. Diese Proteine stellen direkt und indirekt Verbindungen zwischen Integrinen und den Akjnfilamenten her und regulieren den Zusammenbau, Umbau und Signalablauf, die durch die Adhäsion ausgelöst werden (für eine ausführliche Abbildung und Aufzählung der Komponenten siehe Lo 2006). Dabei sind diese FAs keine starren Einrichtungen der Zelle, sondern sie bilden sich akjv während einem Kontakt zu Matrixproteinen. Diese komplexe 21

31 1.4 Zelle- EZM- Kontakt und wandlungsfähige Bauweise macht die FAs zu einem bemerkenswerten sensorischen Organ, was auf unterschiedlichste externe Signale wie EZM- Proteindichte, Oberflächenbeschaffenheit, Steifigkeit und Perturbajon reagieren kann (Bershadsky 2006). Hauptsächlich wird der Kontakt über Integrine hergestellt. Dies sind heterodimere Transmembranproteine, die sich aus einer alpha- und einer beta- Untereinheit zusammensetzen. Sie sind aufgebaut aus einem großen extrazellulären Bereich, in welchem zwischen den Köpfen der Untereinheiten die Bindung an die EZM stalindet, einer kurzen transmembranen Domäne sowie einer ebenfalls kurzen intrazellulären Domäne, die über die β- Einheit mit dem Akjnskelek der Zelle interagiert. Über das Akjnskelek kommt es schließlich zu einer Bewegung der Zelle, d.h. sie zieht an der Matrix oder wandert an ihr entlang. Bisher kennt man in Säugejeren 18 α- und 8 β- Keken, die in verschiedenen Zusammensetzungen 24 Integrinrezeptoren bilden können. Durch die Kombinajon der unterschiedlichen Komponenten ergibt sich die hohe Variabilität der Integrine, die wiederum ermöglicht, dass sich Integringruppen auf einzelne Bindungen spezialisiert haben. So binden die Integrine α1β1, α2β1, α10β1 und α11β1 an najves, fibrilläres Kollagen (Knight 1998, Xu 2000, Zhang 2003, Raynal 2006, Heino 2009 ), wohingegen αvβ3 über das RGD- Mojf speziell an denaturiertes Kollagen bindet, da die RGD- Sequenz nur bei denaturiertem Kollagen demaskiert wird (Davis 1992). Syndecane, speziell Syndecan- 4, spielen eine wichjge, unterstützende Rolle für die Integrine beim Kontakt Zelle- EZM. Diese Homodimere bestehen wie die Integrine aus einer relajv kurzen intrazellulären und transmembranen Domäne sowie einem etwas größeren Kernprotein, an dem drei bis fünf Heparansulfat- und Chondroijnsulfatkeken hängen, die an ein breites Spektrum an Liganden binden können. Die intrazelluläre Domäne besteht aus zwei konservierten Abschniken, an die Proteine für die Signalkaskade binden, und dazwischen einer variablen Domäne, die den vier Syndecan- Spezies (Syndecan- 1 bis Syndecan- 4) spezifische EigenschaSen vermikelt. Syndecan- 1 bis - 3 werden gewebespezifisch exprimiert und nur Syndecan- 4 kommt in allen Gewebetypen vor (Morgan 2007). Für Chondrozyten spielen noch die Discoidin- Domain Rezeptoren DDR 2 eine Rolle, die speziell auf Zellen mesenchymalen Ursprungs vorkommen und die Proliferajon von Chondrozyten, Knochenwachstum und MMP (Matrix- Metalloprotease) - Expression regulieren. DDR 1 und DDR 2 stellen eine Unterfamilie der Rezeptor- Tyrosinkinasen (RTKs) dar; sie besitzen eine extrazelluläre Discoidin- homologe Domäne (DS), gefolgt von einer transmembranen Helix, eine verlängerte Region dicht an der Membran sowie eine katalyjsche Tyrosinkinase- Domäne im Zytoplasma (Vogel 1999, 22

32 1.4 Zelle- EZM- Kontakt Carafoli 2009). Beide DDRs werden während der Embryogenese und in adulten Geweben exprimiert und steuern unabhängig von β1 Integrinen Entwicklungsprozesse, Zelladhäsion, - migrajon, Proliferajon und die Remodellierung der EZM über MMPs (Leijnger 2007) Bindungsstellen am Kollagen Kollagen als das wichjgste Molekül der EZM weist eine große Anzahl an Bindungstellen für Rezeptoren von (Säugejer- )Zellen auf (siehe Tabelle 3). Diese sind spezifisch für besjmmte Kollagentypen beziehungsweise spezifisch auf verschiedenen Zelltypen zu finden (Leijnger 2007). Neben den Bindungsstellen für die Integrine α1β1, α2β1, α10β1 und α11β1 gibt es auf einer Vielzahl von Kollagenen Heparin- Bindungsstellen in den tripelhelikalen Regionen, die mit den Heparansulfat- Proteoglykanen der Syndecan- Rezeptoren der Zelloberflächen interagieren. Heparan- Bindungsstellen wurden bereits an Kollagen Typ I (z.b. Sweeney 1998, Stamov 2011, San Antonio 1994, Keller 1986), Typ II (Keller 1986), Typ IV (Koliakos 1989), Typ V (Delacoux 1998 und 2000) und Typ XI (Vaughan- Thomas 2001) beschrieben. Durch die hohe Glykosilierung des Heparans ist dieses negajv geladen und kann so an die basischen Aminosäuren Hydroxylysin, Lysin, Arginin und Hisjdin an den tripelhelikalen Enden der Kollagene anhasen (Stamov 2011). Darüber hinaus gibt es noch an den fibrillenbildenden Kollagenen Bindungstellenr Glykoprotein VI, LAIR- 1 (Leukocyte- associated immunoglobulin- like receptor) und für Spezies der Mannose- Rezeptor- Familie, die aber vor allem bei der Blutgerinnung oder Immunantwort eine Rolle spielen und daher hier nicht weiter behandelt werden (Leijnger 2007). 23

33 1.4 Zelle- EZM- Kontakt Struktur Kollagenspezifität biologische Funkjon (Auswahl) Integrin α1β1 Heterodimer aus α- und β- Vorwiegend Kollagen IV und VI, auch Proliferajon Fibroblasten, Untereinheiten fibrillenbildende Kollagene, Regulajon der spezifische Bindungsstellen in I und IV Kollagensynthese und MMP Integrin α2β1 Integrin α10β1 Integrin α11β1 indenjfiziert Expression Heterodimer aus α- und β- Vorwiegend fibrillenbildende Akjvierung von Mastzellen, Untereinheiten Kollagene, spezifische Bindungsstellen Kerajnozyten- und in I und III idenjfiziert Thrombozytenadhäsion Heterodimer aus α- und β- Vorwiegend Kollagen IV und VI, aber Entwicklung und Funkjon Untereinheiten auch II der Wachstumsplake Heterodimer aus α- und β- Vorwiegend fibrillenbildende unklar Untereinheiten Kollagene, spezifische Bindungsstelle in Kollagen I idenjfiziert Syndecan DDR1 Homodimer aus variabler Kollagen I, IV, V, XI Rezeptoren für Proteine der intrazellulärer und transmembra- EZM und ner Domäne sowie einem Wachstumsfaktoren, Kernprotein mit 3 bis 5 Steuerung von Heparansulfat- und Chondroijn- Chondrozytenproliferajon sulfatkeken und - funkjon Homodimer, extrazelluläre Fibrillenbildende Kollagene und Arterielle Wundheilung, Domäne mit Kollagen- Kollagen IV und VIII Regulajon von Bindungsstelle Zellproliferajon und MMP Expression DDR2 Homodimer, extrazelluläre Fibrillenbildende Kollagene, Kollagen Chondrozyten Proliferajon Domäne mit Kollagen- X; spezifische Bindungsstelle in und Knochenwachstum, Bindungstellen Kollagen II idenjfiziert Regulajon von Zellprolifer- ajon und MMP Expression Glykoprotein VI Heterotrimer, extrazelluläre Fibrillenbildende Kollagene Domäne hat zwei IG Domänen, Thrombozytenadhäsion und - akjvierung von denen eine Kollagen bindet LAIR- 1 Extrazelluläre Domäne besteht Fibrillenbildende Kollagene Regulajon der Zellen des aus einer IG Domäne Immunsystems Familie der Große extrazelluläre Domäne mit Fibrillenbildende Kollagene und Eigenimmunität, Endozytose Mannose- cysteinreicher Domäne, von Kollagen rezeptoren Kollagenbindestelle und acht bis Spezifität Kollagen IV, Gelajne, eventuell keine zehn C- Typ- Lekjn- Domäne Tabelle 3: Rezeptoren von Säuge[erzellen für Kollagene. Nach Lei[nger 2007, Sweeney 1998, Vaughan- Thomas 2001, Delacoux 2000, Pacifici 2005, Shimo M MP = Matrixmetalloprotease, E ZM= extrazelluläre Matrix, I G= Immunglobulin 24

34 1.5 Verwendung von Kollagen, Kollagenquellen 1.5 Verwendung von Kollagen, Kollagenquellen Verwendung Kollagen findet in der Nahrungsmikelindustrie in Form von Gelajne oder als Hydrolysat in diversen Anwendungen und als Nahrungsergänzungsmikel Verwendung, aber auch in technischen Bereichen wie z.b. der Beschichtung von Fotopapier. Darüber hinaus spielt es in der Kosmejk sowie der Pharmazie eine Rolle, für letztere wird es als sich auflösende Kapsel von Pulvern oder Dragees oder als Trocknungs- und Bindemikel in Tableken verwendet (Quelle: In der Medizintechnik wird es wie bereits erwähnt als Trägermaterial für die MACI verwendet, aber auch zur Wundheilung in Pulverform oder als Auflage wie z.b. ABE Collagen (Beese Medical), Catrix (Valeant Pharmaceujcals Germany GmbH), Nobakoll (Noba), Promogran (Johnson & Johnson) oder Suprasorb C (Lohmann & Rauscher). Neben weiteren Anwendungen im Tissue Engineering wie z.b. Knochenersatz (Hoyer 2012) findet es auch in verschiedenen Formen Anwendung als Trägersubstanz für Medikamente (Lee 2001 b) oder zur Beschichtung von Materialien zur Verbesserung der Biokompajbilität (Lloyd 2002, Lee 2002). Eine sehr ausführliche Zusammenfassung über die biomedizinische Anwendung von Kollagen in verschiedenen Formen gibt Parenteau- Bareil (2010) Kollagenquellen: Wirbel[ere Die Kollagene für die Kosmejk-, Lebensmikelindustrie und Medizinprodukte werden aus Wirbeljeren, i.d.r. aus Schlachtabfällen von Schwein und Rind, aber auch aus Fisch gewonnen. Da es sich dabei meistens um Extrakte aus der Haut, den Knochen und / oder Sehnen handelt, sind diese Kollagene vom Typ I bzw. I/III- Gemische. Häufig wird das Kollagen wegen der kostengünsjgeren Verarbeitung als Hydrolysat oder Gelajne extrahiert. Spielt die Kollagenquelle in der Kosmejkindustrie bis zu einem gewissen Grad wegen der Ästhejk noch eine Rolle, so ist dieser Punkt bei der Herstellung von Medizinprodukten wegen der Risiken, Krankheiten wie TSE (transmissible spongiforme Enzephalopathie), zu denen auch BSE (bovine spongiforme Enzephalopathie) gehört, oder von Viren ein für die Zulassung des Produktes elementarer Faktor. Bisher wurde die pathogene Form der Prionen, die als Auslöser der TSE gelten, nur in Wirbeljeren nachgewiesen (Imran 2011 a und b, Prusiner 1998). Da auch die physiologische Form der Prionen, die im Zuge der Krankheit durch aufgenommene pathogene Formen in einer Kekenreakjon ebenfalls umgewandelt werden, gehäus im zentralen Nervensystem ausrik und Invertebraten ein solches nicht besitzen, ist davon 25

35 1.5 Verwendung von Kollagen, Kollagenquellen auszugehen, dass eine Übertragung einer Form von TSE von Kollagen eines Invertebraten auf den Menschen auszuschließen ist Kollagenquellen Invertebraten Neben den bereits gut erforschten Wirbeljerkollagenen sind inzwischen auch viele Kollagene aus Wirbellosen mit teilweise außergewöhnlichen EigenschaSen beschrieben worden. So ist das Kollagen aus der Cujcula, einer azellulären Ausscheidung der Epidermis der Anneliden, mit einer Länge von nm das längste bisher bekannte Kollagen (zusammengefasst in Bartolomaeus 2005). Das Cujcula- Kollagen der Tiefseewürmer RiSia ist zwar arm an Hyp und Pro, jedoch wird durch ein glykosiliertes Thr an der ungewöhnlichen Yxx- Posjon der Alphakeke die gesamte Glykosilierung so erhöht, dass das Kollagen bei einer Schmelztemperatur von 54,7 C ein Leben in den extremen Lebensbedingungen des Wurmes an heißen Tiefseequellen ermöglicht (Bann 2000, Gaill 1991). Das sogenannte Mini- Kollagen in den Nesselkapseln des Polypen Hydra dagegen ist das bisher kleinste bekannte Kollagen. Es setzt sich zusammen aus einem ca. 15 nm langen zentralen tripelhelikalen Abschnik, der an den jeweiligen Enden von einer hydroxyprolinreichen Sequenz sowie einer terminalen Cys- reichen Domäne begrenzt wird. Durch intermolekulare Disulfidbrücken an den Cys- reichen Domänen ist dieses Kollagen so stabil, dass sich in den Kapseln ein Druck von bis zu 150 bar aukauen kann, der nöjg ist, um den Nesselfaden mit einer enormen Geschwindigkeit auszuschleudern (Özbek 2002, Engel 2001) Cnidaria, Quallen Die Miterfinder des Kollagens dürsen neben den Schwämmen die Cnidaria (Nesseljere) sein, da sie als erste mehrzellige Tiere mit einer bindegewebsähnlichen Struktur, der Mesogloea, zwischen ihrer Ekto- und Endodermis ausgestaket sind (für eine ausführliche Diskussion der Evolujon fibrillenbildender Kollagene siehe Exposito 2008 und 2010). Bereits seit 500 Millionen Jahren besiedeln Quallen die Meere (Stanley 1994). Sie bestehen zu etwa 98 % aus Wasser und nur etwa 0,1 % des Gesamtgewichtes machen die Proteine aus (Schneider 1988). Um diese große Menge Wasser in einem Körper mit einer nur dünnen Epidermis halten zu können und ihm eine gewisse Stabilität zu geben, ist das Kollagen ein wichjger Bestandteil der Qualle. Trotz der langen Existenz des Quallenkollagens sind elementare EigenschaSen wie Struktur oder Möglichkeiten der Zelladhäsion erhalten. Durch die geringe Spezialisierung der Gewebe der Cnidaria könnte dieses bei der 26

36 1.5 Verwendung von Kollagen, Kollagenquellen Verwendung mit fremden Zellen aber vorteilhas gegenüber den sehr spezialisierten, modernen Kollagentypen sein, was es zu einem vielversprechenden, neuarjgen Material für das Tissue Engineering macht. Das bisherige Interesse an Quallen und ihrem Kollagen begründete sich größtenteils auf der Nutzung der Quallen als Lebensmikel im asiajschen Raum. Hier werden die Mesogloea der Quallen wie Rhopilema esculentum, Rh. hispidum und Stomolophus meleagris in gepökelter Form angeboten und gelten wegen ihrer kaugummiarjgen Struktur als Delikatesse (Hsieh 2001, Kimura 1983, Omori 2004). Inzwischen ist auch das Augenmerk auf den medizinischen Gebrauch des Quallenkollagens geworfen worden. So wurden beispielsweise die Anwendung bei Gelenkrheumajsmus (Hsieh 2005), seine anjoxidajve Wirkung (Zhuang 2009 a und b) und die Möglichkeit der Verwendung in der Biomedizin (Addad 2011, Calejo 2009, Nagai 1999) bereits näher untersucht. Song et al. (2006) entwickelten zum ersten Mal eine Matrix für biomedizinische Zwecke aus dem Kollagen der Qualle Stomolophus nomurai meleagris (nach NCBI Taxonomy Browser Nemopilema nomurai). Sie konnten zeigen, dass die Matrix durch eine chemische Quervernetzung gegen enzymajschen Verdau stabilisiert werden konnte, das Material nicht zytotoxisch wirkte und primäre humane Fibroblasten darauf wuchsen. Eine Implantajon des Materials in Mäusen zeigte außerdem eine Immunreakjo n, wie sie auch von bovinem Kollagen und Gelajne hervorgerufen wurde. Die Autoren schlossen daraus, dass das Quallenkollagen als neues, vielversprechendes Material für biomedizinische Zwecke anzusehen ist. Weitere Anwendungen von Quallenkollagen beinhalten beispielsweise ein Wundgel (Angel 2010), Mikroparjkel für Medikamententransport (Calejo 2012) oder der Herstellung künstlicher Gefäße (Jeong 2007). Es wurden bereits einige Quallenarten auf ihre Zusammensetzung hin untersucht, wobei dem Kollagen als Hauptbestandteil der Qualle (nach 98% Wasser) besonderes Augenmerk zuteil wurde. Strukturelle Unterschiede zwischen verschiedenen Quallenkollagenen zeigten sich in der Zusammensetzung der alpha- Keken. So wurden Homotrimere ([α1] 3) bereits in Rhopilema esculentum (Zhuang 2009 a) und Rhizostoma pulmo (Addad 2011) beschrieben; heterotrimere Kollagene ([α1][α2][α3]) sind aus Stomolophus nomurai (Miura 1985), Stomolophus meleagris (Nagai 1999), Aurelia aurita (Shaposhnikova 2002) und Catostylus tagi (Calejo 2009) bekannt. Dabei zeigt sich, dass die Kollagenstruktur auch innerhalb der Familien variiert. Darüber hinaus wurden ausführlich die Zusammensetzungen der Aminosäuren sowie die Glykosilierung der Quallen (Song 2006, Stone 1970, Kimura 1983, Miura 1985) und auch anderer Cnidaria, wie der Seefeder (Tillet- Barret 1992), der Seeanemonen (Katzmann 1972 a, Nowack 1974, Nordwig 1969, Pikkarainen 1968), der Gorgonie (Kingsley 1990) und von Hydra (Barzansky 1975) untersucht. Auffällig war hierbei der im 27

37 1.5 Verwendung von Kollagen, Kollagenquellen Vergleich zu Wirbeljerkollagen geringe Hyp- Gehalt (Song 2006, Calejo 2009, Nagai 1999, Pikkarainen 1968) und die hohe Glykosilierung (Nordwik 1969, Barzansky 1975, Kimura 1983, Miura 1985). Durch den geringen Hyp- Gehalt sind i.d.r. die Schmelztemperaturen deutlich niedriger als die des Wirbeljerkollagens (Addad 2011, Nagai 1999). Die in Cnidaria beschriebenen Zucker an den Hydroxylysinresten setzen sich wie im Wirbeljerkollagen aus Glucose und Galactose in Form von Mono- und Disacchariden zusammen. Darüber hinaus wurden aber auch im Kollagen einer Seeanemone Fucose, Mannose und N- Acetylglucosamin nachgewiesen (Katzmann 1972 b). In einer weiteren Arbeit wurden in Hydra ebenfalls Glucose, Galactose, Fucose, Mannose und zusätzlich Rhamnose idenjfiziert, jedoch konnte nicht nachgewiesen werden, dass diese Zucker am Kollagen gebunden waren (Barzansky 1975). Diese Entdeckungen sind ein Hinweis darauf, dass auch das Quallenkollagen sich von Wirbeljerkollagen in mancherlei Hinsicht unterscheiden dürse. 1.6 Konzeption einer Matrix Was muss eine geeignete Matrix mitbringen? Um eine umfassende und schnelle Regenerajon des Gewebes zu ermöglichen und zum Vorteil des Pajenten sollte eine Matrix (im Folgenden auch als Scaffold oder Schwämmchen bezeichnet) bezüglich Material und Physik folgende EigenschaSen aufweisen: Die Oberfläche sollte die Zelladhäsion ermöglichen, da über diesen Kontakt das Zellschicksal gesteuert werden kann. Das Zellwachstum sollte unterstützt werden. Das Material sollte über die gesamte Einsatzzeit biokompajbel sein, d.h. weder das Originalmaterial noch die Abbauprodukte sollten toxisch wirken Das Scaffold sollte biodegradierbar und möglichst gänzlich abbaubar sein. Nur so kann von einer vollständigen Regenerajon des Gewebes gesprochen werden. Das Implantat sollte eine ausreichende Stabilität aufweisen, um vom Zeitpunkt der Implantajon bis zur vollständigen Regenerajon des Gewebes funkjonieren zu können. Die Porosität sollte hoch genug sein und über Querverbindungen verfügen, um die gleichmäßige Einwanderung von Zellen und die Vaskularisierung (nicht bei Knorpel) zu 28

38 1.6 Konzep[on einer Matrix ermöglichen. Dadurch ist eine ganzheitliche Geweberegenerajon möglich. Eine hohe Porosität birgt außerdem minimale Diffusionsbarrieren, wodurch eine ausreichende Versorgung der Zellen bzw. der Abtransport ihrer Abbauprodukte ermöglicht wird. Das Material sollte von gleichbleibender Qualität und gut zu bearbeiten sein, um dreidimensionale Strukturen mit variierten EigenschaSen oder Form maßgeschneidert für die jeweilige Anwendung herstellen zu können Welche Matrixformen gibt es bereits? Im Allgemeinen gibt es zwei dreidimensionale Matrixformen: das Gel, dessen polymerisiertes Netzwerk einen hohen Anteil an Wasser enthält, und den Schwamm oder Gikernetz, die sich aus festem Material zusammensetzen und i.d.r. eine höhere Stabilität als das Gel aufweisen. Eine Vielzahl an Polymeren fand bereits Einzug in die Herstellung von biokompajblen Matrices. Man kann dabei zwischen biologischen und synthejschen Materialien unterscheiden (siehe Tabelle 4). Obwohl biologische Materialien intuijv und aufgrund der oben genannten Punkte Zelladhäsion, Biokompajbilität und Biodegradierbarkeit ideal für diese Anwendung sind, sind synthejsche Materialien wegen ihrer leichten Handhabung und der Möglichkeit der Manipulajon der EigenschaSen ebenso im Einsatz. Auch die Herstellungsverfahren sind vielfäljg: Die Spannweite geht von dezellularisierten Kollagen- Matrices (Chondro- Gide ) über Gele, in die die Zellen direkt eingeschlossen werden (CaReS ) und / oder unmikelbar im Defekt polymerisiert werden (Ibusuki 2009, van Tomme 2008, Nguyen 2002), durch Gefriertrocknung hergestellte (Kollagen- )Matrices (z.b. O'Brien 2004), bis hin zu Verfahren aus völlig anderen Technologiebereichen. So können beim sogenannten Elektrospinnen synthejsche und biologische Polymere wie Kollagen bereits in dünnen Fasern verarbeitet werden (Jeong 2007, Li 2005, Barnes 2007 a, Coburn 2011) und Matrices aus Kollagen (Gelinsky, in Vorbereitung), Kalziumphosphat- Zement (Lode 2012) oder Alginatpasten (Luo 2012) werden durch 3D- Drucker passgenau hergestellt. Der Nachteil, dass synthejsche bzw. auch biologische Materialien wie Agarose keine Bindungsstellen für Zellen aufweisen, kann durch Einfügung von Proteinen oder Pepjden der EZM aufgehoben werden. So ergeben sich beispielsweise Konstrukte aus Polyethylenglykol (PEG)- Proteoglykan, PEG- Fibrinogen oder auch PEG- Kollagen (Gonen- Wadmany 2007, Appelman 2011), deren Steifigkeiten durch die Konzentrajonsänderung des synthejschen Polymers PEG variiert werden können (Shapira- Schweitzer 2007, Peyton 2008). Im anderen Fall kann durch eine Einführung unterschiedlicher Konzentrajonen des RGD- Mojfs in 29

39 1.6 Konzep[on einer Matrix Agarose- Hydrogele die Anzahl der möglichen Bindungsstellen für Zellen gesteuert werden, was wiederum einen Einfluss auf das Zellschicksal hat (Schuh 2012 a). Aus Kollagen maßgeschneiderte Matrices zu entwickeln stellt eine große Herausforderung dar, da dieses biologische Material nicht immer exakt die gleichen EigenschaSen aufweist. Es liegt jedoch auf der Hand, dass für die Knorpelregenerajon eine Kollagenmatrix mit am besten geeignet ist, da man damit die naturgemäße Umgebung der Zellen am ehesten nachstellen kann. Ein weiterer Vorteil ist, die sehr vielfäljgen Bindungsstellen der Zellen am Kollagen zur Verfügung zu haben. Es ist dadurch zu erwarten, dass die Zellen darüber in die richjge Zelllinie geleitet werden bzw. durch die natürliche Umgebung leichter ihren Phänotyp erhalten. Synthejsche Polymere sind durch ihre definierten Zusammensetzungen geeigneter, um Matrices mit gezielten EigenschaSen auszurüsten. Wegen seines natürlichen AuSretens im Knorpel ist jedoch Kollagen das Material der Wahl; hier ergeben sich für die Matrix Variajonsmöglichkeiten in der Porengröße, der Steifigkeit sowie der Nanostruktur. Letztere kann durch den Einsatz von molekularem Kollagen oder durch die Bildung von Kollagenfibrillen beeinflusst werden. biologische Polymere Quelle Literatur (Beispiele) Alginat Algen Park 2005 Agarose Algen Schuh 2012 a Kollagen i.d.r. Wirbeljere, auch Qualle Chvapil 1977, Speer 1979, Song 2006 synthejsche Chitosan Krebse Garcίa Cruz 2012, Hu 2012 Hyaluronsäure i.d.r. Wirbeljere Aigner 1998 Seide Kokons des Seidenspinners (Insekt) Mandal 2011, Tiğli 2011 Zellulose pflanzlich Vinajer 2007 Chondroijnsulfat i.d.r. Wirbeljere Fan 2006 Poly(α- Hydroxyester) Chung 2008, Barnes 2007 Polymere Poly(EthylenGlykol/- Oxid) Poly(NiPAAm) Poly(Propylenfumarat) Poly(Urethan) Poly(Vinylalkohol) Polylacjd (Polymilchsäure) Tabelle 4: Übersicht über einige der üblicherweise in vivo und in vitro verwendeten biologischen und synthe[schen Polymere. 30

40 2 Mo[ve für diese Arbeit 2 Motive für diese Arbeit 2.1 Hinführung Die Arbeiten zur Knorpelregenerajon haben bereits etliche Matrices hervorgebracht, die in vivo (Tierversuch oder klinische Studien) und / oder in vitro getestet wurden. Vergleiche der in vivo- Ergebnisse untereinander sind dabei sehr schwierig, da hier in den meisten Fällen nur histologische Untersuchungen angewendet wurden. Generell wurde auch selten durch eine Besjmmung des Anteils an Kollagen II am Gesamtkollagen (Typ I und II) auf mrna- oder auf Proteinebene die genauere Zusammensetzung des Knorpels untersucht. Nur dadurch kann einigermaßen aussagekräsig ausgedrückt werden, ob es sich bei dem neu synthejsierten Knorpel eher um den unerwünschten faserigen Knorpel mit einem hohen Anteil Kollagen Typ I, oder um den richjgen, hyalinen Knorpel mit nahezu 100 % Kollagen Typ II handelt (Galois 2006). Bisherige Matrices bereits auf dem Markt oder noch in der Entwicklung erfüllen in mancherlei Punkten noch nicht die Ansprüche, die man an eine ideale Matrix stellt. Häufig wird der faserige Knorpel gebildet, der nicht so resistent ist wie der hyaline und somit der Defekt in absehbarer Zeit erneut behandelt werden muss. Darüber hinaus ist es grundsätzlich erstrebenswert, synthejsche Polymere zu vermeiden, da sie nicht oder nur schlecht biodegradierbar sind und womöglich toxische Abbauprodukte bilden (Chung 2008). Biologische Polymere haben gegenüber synthejschen Vorteile, die speziell in der Knorpelregenerajon mit dem Kollagen zum Tragen kommen, da es besser verträglich und abbaubar ist und für die Zellen eine natürliche Umgebung darstellt. Sein Ursprung aus Wirbeljeren birgt aber ein nicht zu vernachlässigendes Risiko der Übertragung von TSE- Krankheiten. Bislang war es überdies schlechter in seinen physikalischen EigenschaSen zu manipulieren als synthejsche Biopolymere, wodurch diesbezüglich maßgeschneiderte Scaffolds aus Kollagen bisher nur schwer herstellbar sind. Daher war das Ziel dieser Arbeit, aus einem Quallenkollagen eine in ihren physikalischen EigenschaSen angepasste Matrix für die Knorpelregenerajon zu entwickeln. 2.2 Aufbau der Arbeit Die bisherigen Beschreibungen des Quallenkollagens als einem den fibrillenbildenden Wirbeljerkollagenen ähnlichen lassen dieses Kollagen als Matrixgrundlage geeignet erscheinen. Da 31

41 2.2 AuDau der Arbeit jedoch dieses Material nur vereinzelt und nicht in einem geeigneten Detailgrad beschrieben ist, wurden zunächst die Kollagene von vier verschiedenen Quallenarten ( Rhopilema nomadica, Rh. hispidum, Rh. esculentum und Aurelia aurita) näher untersucht, charakterisiert und hinsichtlich ihrer Adapjon und Eignung für eine Knorpelmatrix mit definierten EigenschaSen verglichen. Ein besonderes Augenmerk galt hier der Steifigkeit der Matrix, da sie entscheidend den Erhalt des chondrogenen Phänotyps beeinflusst. In einem zweidimensionalen Spreading Assay wurde dann die Affinität und das Verhalten von Chondrozyten auf Quallenkollagen im Vergleich zu Wirbeljerkollagenen diversen verglichen. Schließlich wurden Matrices mit verschiedenarjgen EigenschaSen Porengröße, Nanostruktur, Steifigkeit in der Zellkultur untersucht, das Quallenscaffold mit einer bereits auf dem Markt befindlichen 3D- Matrix (Opjmaix, Matricel) hinsichtlich Erhalt des Phänotyps und der Matrixsynthese hin geprüs sowie das Abbildung 7: Übersicht über die Struktur der vorliegenden Arbeit. Im Teil I wurden die Quallenkollagene hinsichtlich ihrer Biochemie und Potenjal der Quallenscaffolds zur Biophysik untersucht. Aus dem Kollagen wurden dann Scaffolds mit Redifferenzierung der Chondrozyten verschiedenen physikalischen EigenschaIen hergestellt. Der Einfluss nach Kuljvierung im Monolayer dieser EigenschaIen und des Kollagens selber auf Chondrozyten wurde ermikelt (siehe Abb. 7). dann in Teil I I in umfangreichen Zellkulturexperimenten untersucht. 32

42 3 Untersuchungen zum Kollagen sowie Herstellung und Varia[onsmöglichkeiten der ScaffoldeigenschaIen 3 Untersuchungen zum Kollagen sowie Herstellung und Variationsmöglichkeiten der Scaffoldeigenscha en 3.1 Analyse und Eigenscha en von allenkollagen Einleitung Über die physikalischen und biochemischen EigenschaSen der hier verwendeten Kollagene gibt es bisher nur ein unvollständiges Bild (siehe Tabelle 5). Da diese EigenschaSen des Kollagens jedoch einen direkten Einfluss auf die Herstellung bzw. auf die Zellen haben, sollten diese zunächst genauer untersucht werden. Darüber hinaus sollten Möglichkeiten gefunden werden, das Quallenkollagen zu fibrillieren, um auch den Einfluss der Nanostruktur auf die Zellen untersuchen zu können. Weil die natürlich vorkommende Struktur des Kollagens um den Chondrozyten die Fibrille ist, wurde diese für die Entwicklung einer Matrix zunächst als am geeignetsten angesehen. Aminosäure- Glykosilierung Schmelztemperatur Struktur (Gel) nicht bekannt 28,8 C, Nagai 2000** Homotrimer, Zhuang zusammensetzung Rh. esculentum Zhuang 2009 a, nicht vollständig 2009 a Rh. hispidum nicht bekannt nicht bekannt nicht bekannt nicht bekannt Rh. nomadica nicht bekannt nicht bekannt nicht bekannt nicht bekannt Aurelia aurita Rigby 1972* nicht bekannt 26 C, Rigby Banden, Shaposhnikova 2002 Tabelle 5: Übersicht über die soweit bekannten, bereits erfolgten Analysen der Kollagene der hier verwendeten Quallenarten.* A. coerulea entspricht A. aurita (Gershwin 2001).** Rh. asamushi entspricht Rh. esculentum (nach NCBI Taxonomy Browser) Material und Methoden: Alle verwendeten Chemikalien haken den Reinheitsgrat p.a Kollagenextrakjon Qualle und humane Plazenta Es wurden vier Quallen zweier verschiedener Gakungen untersucht, die in gefrorener oder gepökelter Form vorlagen (siehe Tabelle 6). Entsprechend ihrer Konservierungsart wurde das Kollagen 33

43 3.1 Analyse und EigenschaIen von Quallenkollagen bis einschließlich des Pepsinverdaus nach unterschiedlichen Verfahren extrahiert. Alle Arbeitsschrike erfolgten bei 4 C. Die gepökelten Schirme der Quallen Rhopilema esculentum (RhEsc) und Rhopilema hispidum (RhHisp) wurden zunächst in grobe Stücke zerschniken, mit Leitungswasser gespült und dann unter mehrmaligem Wasserwechsel mit desjlliertem Wasser über etwa 24 h entsalzt. Anschließend wurden die Quallenstücke in der fünffachen Menge 0,5 M Essigsäure (HAc) für etwa 1 h äquilibriert, bis sie glasig wurden, dann mit sechsfacher Menge 0,5 M HAc und 10 mg/g Ausgangsmaterial Pepsin (porcine gastric mucosa 1:15000 NF, Biozym Hamburg) mit einem Pürierstab (Braun) zerhäckselt, bis nur noch etwa maximal 2x2 mm² große Stücke vorhanden waren. Der Verdau erfolgte unter Rühren für 60 bis 72 h. Die gefrorenen Quallen Rhopilema nomadica (RhNom) sowie Aurelia aurita (Aurelia) waren nach dem Fangen ebenfalls von Tentakeln, Gonaden, Mund usw. befreit worden. Sie wurden mit einem Pürierstab homogenisiert, der ph wurde mit HAc auf 3 herabgesetzt un d der Pepsinverdau erfolgte mit 50 µg/ml Ausgangsmaterial (2500 U/mg porcine gastric mucosa, Roche) über Nacht. Nach dem Pepsinverdau erfolgte in allen Fällen eine Reinigungszentrifugajon bei g für 30 min, die unverdauliche Parjkel abtrennte und der Überstand wurde dann mit Natronlauge auf ph 7 neutralisiert, um das Pepsin irreversibel zu zerstören. Danach wurde das gelöste Kollagen mit 0,2 M NaH2PO4 und 17,5 % KCl über Nacht unter Rühren gefällt, durch mehrere Zentrifugajonsschrike bei g für 20 min auqonzentriert und gegen 0,05 % HAc in einem Dialyseschlauch mit einer Porengröße von 20 kd dialysiert. Um ein Vercrosslinken des Kollagens zu vermeiden, wurde das Kollagen in dieser Form bei - 20 C aukewahrt und erst bei Bedarf gefriergetrocknet. Um mögliche Schwankungen durch unterschiedliche Quallenjahrgänge oder Extrakjonen zu vermeiden, wurde von RhEsc für die gesamte Arbeit eine einzige Charge Kollagen verwendet. Für die Präparajon von humanem Plazentakollagen I/III nach Miller et al. (1984) wurde eine Plazenta, die über das Universitätsklinikum Schleswig Holstein bezogen worden war, mehrere Male mit Leitungswasser gespült, zerschniken und über Nacht in 1 M NaCl gewaschen. Nach dem Quellen in 0,1 M NaCl und 0,1 M NaH2PO4 bei ph 1,5 über Nacht wurde das Material mit einem Ultraturrax (IKA, Staufen, Deutschland) homogenisiert und dann mit 10 mg/g Trockengewicht mit 2500 U/mg Pepsin (porcine gastric mucosa, Roche) über Nacht verdaut. Unverdautes Material wurde anschließend mikels Ultrazentrifugajon bei g (Rotor Type 45 TI, Beckmann) für 1 h abgetrennt. Aus dem Überstand wurden dann die einzelnen Kollagentypen durch frakjonierte Salzfällung über Nacht abgetrennt, jeweils gefolgt von einem Zentrifugajonsschrik und einer Dialyse des Pellets gegen 0,05 % HAc über zwei Tage: Zunächst wurde das gesamte Kollagen mit 4,5 M NaCl gefällt und in 34

44 3.1 Analyse und EigenschaIen von Quallenkollagen einem weiteren Schrik mit 1,2 M NaCl gereinigt. Durch die anschließende Fällung bei 0,7 M NaCl wurde das Kollagen Typ V eniernt; das Pellet enthielt Kollagen Typ I und III. Für die Herstellung von Scaffolds wurde diese Frakjon nach erneuter Dialyse gefriergetrocknet verwendet. Für die Versuche zur Fibrillenbildung mit Kollagen Typ I wurde noch das Kollagen Typ III abgetrennt, indem das I/III enthaltende Pellet nach Dialyse in 1 M NaCl gelöst, mit Tris- HCl auf ph 7,2 eingestellt und auf 1,8 M NaCl aufgesalzt wurde. Quallenart verwendete Abkürzung Ursprung Bezugsquelle Konservierung Aurelia aurita Aurelia CRM, Kiel gefroren CRM, Kiel gefroren (Ohrenqualle) Rhopilema nomadica Ostsee, September 2004 RhNom Mikelmeer, Israel, Februar 2009 Rhopilema esculentum RhEsc Pazifik, China Liroy B.V., Rokerdam gepökelt Rhopilema hispidum Pazifik, China Vinh Loi, Berlin gepökelt RhHisp Tabelle 6: Übersicht über die hier verwendeten Quallenarten, ihre HerkunI und den Zustand des Ausgangsmaterials Analyjk Um die Reinheit der Extrakjonen sowie die biochemischen und physikalischen EigenschaSen des Kollagens zu besjmmen, wurden diverse analyjsche Verfahren angewandt. Als Vergleichsmaterial wurde bovines Kollagen aus der Haut (Collagen A, Biochrom), der Schweinehaut der Firma Matrix Bioscience (Mörlenbach, Deutschland), humanes Plazentakollagen sowie Standards Typ I und II (bovin, Universität Lübeck) verwendet. SDS- PAGE Die Kollagenstruktur wurde mit reduzierender SDS- PAGE Elektrophorese nach einem Protokoll basierend auf Laemmli (1970) auf einem 7 % Trenngel bei 20 ma pro Gel in einer Mini- Protean 3 Elektrophoresekammer (BioRad) untersucht (Eckert 1997). Die Färbung erfolgte mit Coomassie Brilliant Blue R250 (Merck), zur Eniärbung wurde 10 % HAc verwendet. Zur Dokumentajon wurden die Gele dann gescannt. Circulardichroismus Bei dieser Methode macht man sich zu Nutze, dass tripelhelikale Moleküle rechts- und linkspolarisiertes Licht unterschiedlich stark absorbieren. Aus der Differenz kann auf den Zustand des Moleküls und seine Konzentrajon geschlossen werden. Die Schmelzkurven der Kollagene wurden mit 35

45 3.1 Analyse und EigenschaIen von Quallenkollagen einem Circulardichroismus (CD)- Spektrometer (Jasco J- 715) bei einer Heizrate von 2 C/min bei 220 nm ermikelt. Die verwendete Quarzküveke hake einen Strahlengang von 1 mm (Hellma). Für Konzentrajonsbesjmmungen über CD- Spektrometrie wurde nach Kalibrierung mit einem Standard die gemessene Ellipjzität θ (entspricht der Absorpjon polarisierten Lichts) bei 220 nm über den ermikelten Faktor in die Kollagenkonzentrajon umgerechnet. Hydroxyprolinbes[mmung Exakter wurden die Kollagenkonzentrajonen chemisch über die Hydroxyprolinbesjmmung ermikelt. Dem Umstand, dass die Quallenkollagene unterschiedliche Mengen Hyp im Vergleich zu Wirbeljerkollagen (WT- Kollagen) enthalten, wurde durch Ermiklung eines anderen Faktors als dem für WT- Kollagene Rechnung getragen. Die Proben wurden in 6 N HCl in einem Gesamtvolumen von 1 ml bei 110 C für 24 h hydrolysiert, in einer Speedvac (Christ RVC 2-18, Labex) für ca. 8 h bei 60 C eingedamps und anschließend in 250 μl Wasser (HPLC- Wasser, Baker) aufgenommen. Die colorimetrische Analyse erfolgte nach Bergman et al. (1970), gemessen wurden die Proben schließlich in einem Photometer bei 550 nm (BioMate 3, Thermo Scienjfic) in 1 cm Polystyrol Küveken (Sarstedt). Über eine Standardreihe mit Hydroxyprolin (Sigma) wurde die Hyp- Konzentrajon dann berechnet. Bes[mmung Aminosäuren und Glykosilierung Für die Aminosäureanalyse nach Brinckmann et al. (1999) wurde 1 mg der Probe in 1 ml 6 M HCl für 24 h bei 110 C hydrolysiert, in einer RVC 2-18 Speed- Vac Zentrifuge (Christ) eingedamps und in Na- Probenpuffer ph 2,2 gelöst. Die Analyse erfolgte auf einer PEEK- Säule (# ) mit einem Biochrom B30 Analyzer (alles Biochrom, UK). Amino Acid Standards for Collagen Hydrolysates (A9531, Sigma) wurden als Standard verwendet. Für die Besjmmung der Glykosilierung (Tenni 1984) wurden 10 mg der Probe in 1 ml einer 2 M KOH für 24 bei 110 C hydrolysiert, mit 100 µl einer 100%igen HAc neutralisiert und anschließend wurden 150 µl einer 70%igen Perchlorsäure zugegeben. Der Überstand nach Zentrifugajon wurde eingedamps, in 500 µl Wasser, 500 µl 100% HAc und 2 ml n- Butanol gelöst und auqonzentriert auf einer Zellulosesäule (CHROMABOND Crosslinks, Macherey & Nagel) mit einem Gilson Aspec XL (Gilson, USA). Danach wurde die Probe mit Wasser eluiert, gefriergetrocknet und schließlich wie für die Aminosäureanalyse behandelt. Die Konzentrajon wurde über Leucin als externer Standard besjmmt. 36

46 3.1 Analyse und EigenschaIen von Quallenkollagen Fibrillenbildung Um die Rekonstrukjon von Fibrillen zu untersuchen, wurden Kollagenlösungen der Quallen RhEsc, RhHisp, RhNom und Aurelia sowie zur Kontrolle Plazentakollagen (human) untersucht. Die gefriergetrockneten Kollagene wurden in 0,05% HAc gelöst und durch Ultrazentrifugajon bei g (Rotor SW 65 K; Beckmann) für 30 min zentrifugiert, um Aggregate und Parjkel, die als Kristallisajonskeime wirken könnten, zu eniernen. Die Konzentrajon der Lösungen wurde anschließend über Hydroxyprolinbesjmmung besjmmt und die Lösungen dann auf die erforderlichen Konzentrajonen verdünnt. Zunächst musste überprüs werden, ob einige der bekannten Puffer für die Fibrillenbildung bei WT- Kollagen auch bei den Quallenkollagenen zu verwenden sind. Dazu wurden die Puffer TRIS- HCl (Stammlösung 1 M, ph 8; Hoyer et al. 2012) und TES (60 mm TES Pufferan, 60 mm KH2PO4, 270 mm NaCl, alles Roth; in den ph- Werten 6,4; 7,4 und 8,4) bei der Fibrillierung von RhEsc verwendet. Die Kollagenlösungen in einer Konzentrajonen von 2 mg/ml wurden 1:1 mit den entsprechenden Puffern versetzt und bei 25 C über Nacht inkubiert. Die Analyjk erfolgte dann wie später beschrieben. Die Nullwerte wurden im gleichen Verhältnis stak mit TRIS mit 0,05 % HAc versetzt und bei gleichen Bedingungen inkubiert. Anschließend wurde mit dem aus dem vorherigen Versuch als geeignet besjmmten Puffer eine quanjtajve Analyse der Fibrillenbildung aller Quallenkollagene im Vergleich zu Plazentakollagen untersucht. Die 1 mg/ml Lösungen wurden erneut 1:1 mit dem Puffer versetzt. Aufgrund der unterschiedlichen Schmelztemperaturen der Kollagene wurde die Fibrillenbildung dann bei möglichst schonenden Temperaturen durchgeführt: Aurelia 15 C, alle Rhopilema- Kollagene bei 20 C und das Plazentakollagen bei 37 C für jeweils 1 h. Die Nullwerte wurden im gleichen Verhältnis stak mit TRIS mit 0,05 % HAc versetzt und bei gleichen Bedingungen inkubiert. Der Erfolg der Fibrillenbildung wurde quanjtajv und qualitajv besjmmt. Für die quanjtajve Besjmmung wurden die Proben bei g bei 4 C für 15 min zentrifugiert, um die gebildeten Fibrillen vom Überstand abzutrennen. Das verbliebene, nicht fibrillierte Kollagen wurde aus den Überständen mikels CD- Spektroskopie besjmmt. Aus den Werten der drei Nullwerte wurde der Mikelwert ermikelt und die Werte der drei Replikate ins Verhältnis dazu gesetzt (Yunoki 2004). Die Fibrillen in den Pellets wurden durch Transmissionselektronen- Mikroskopie (TEM) qualitajv untersucht. Jeweils 5 µl der Pellets wurden in unterschiedlichen Verdünnungen auf Formvar- beschichtete Kupfernetzchen (SF 162-3, Plano GmbH, Deutschland) aufgetragen, mit 1 % Phosphorwolframsäure in desjlliertem Wasser negajv gefärbt und trocknen gelassen. Die Netzchen 37

47 3.1 Analyse und EigenschaIen von Quallenkollagen wurden schließlich mit einem Philips TEM 400 bei 60 kv mikroskopiert (Insjtut für Anatomie, Uni Lübeck). Der Fibrillendurchmesser wurde semiquanjtajv von den TEM- Bildern mit der Axio Vision 3.1 SoSware (Zeiss, Deutschland) von 2 bis 3 Bildern besjmmt, wobei mehrere Abschnike der dicksten Fibrillen vermessen wurden Stajsjk Alle Werte wurden als Mikelwert ± Standardabweichung angegeben. Graphen wurden als Scaker- Plots dargestellt oder, wenn nöjg, wegen der besseren Übersichtlichkeit als Mikelwert ± Standardabweichung. Stajsjsche Analysen wurden mit dem Programm GraphPad Prism Vers. 5 (GraphPad SoSware Inc.) durchgeführt. Als stajsjsche Tests wurden Kruskal Wallis Test mit anschließendem Dunn's Muljple Comparison Test (*p<0,05) bzw. ungepaarter T- Test (***p<0,0005) verwendet. 38

48 3.1 Analyse und EigenschaIen von Quallenkollagen Ergebnisse und Diskussion Analyjk Die Ausbeute der Kollagenextrakjon betrug bei den frischen Quallen Aurelia und RhNom etwa 0,5 %; bei den gepökelten Quallen RhEsc und RhHisp dagegen etwa 2 %. Dies ist hauptsächlich auf den wesentlich geringeren Wassergehalt des gepökelten Ausgangsmaterials zurückzuführen. Das Kollagen der gepökelten Quallen RhEsc und RhHisp wies sowohl in der Lösung als auch getrocknet eine mehr oder weniger deutliche gelbe Färbung auf. Die beiden anderen Kollagene dagegen waren klar bzw. weisslich. Der Grund für die Färbung konnte nicht ermikelt werden; vermutet wurde aber, dass sie womöglich durch die Pökelung verursacht wurde. Abbildung 8: Reduzierende SDS- Gelelektrophorese der untersuchten Quallenkollagene sowie Standards auf einem 7% igen Gel. Aurelia = Aurelia aurita; RhNom = Rhopilema nomadica; RhHisp = Rh. hispidum; RhEsc = Rh. esculentum; HPC = humanes Plazentakollagen; WT = Wirbel[er. Die Kollagenkonzentra[on wurde hierbei nicht beachtet. Die Pfeile geben die jeweiligen Posi[onen der α-, β- und γ- Banden an. Es ist anzumerken, dass Kollagene eine augenscheinlich andere elektrophore[sche Mobilität haben, die nicht ihrer tatsächlichen molekularen Masse entspricht (die α- Banden würden erwartungsgemäß bei 100 kd erscheinen). Dies ist womöglich auf einen geringen Anteil hydrophober Aminosäuren zurückzuführen (Hayashi 1980). In der Gelelektrophorese stellten sich die Quallenkollagene der Gakung Rhopilema als Homotrimer [α1]3 dar, wohingegen Aurelia als Heterotrimer drei Banden aufwies [α1][α2][α3] (siehe Abb. 8). Über den Banden der monomeren Alpha- Keken zeigten sich auch noch Banden der Di- und Trimere (β- und 39

49 3.1 Analyse und EigenschaIen von Quallenkollagen Reste pro 1000 Aminosäuren γ- Keken). Somit wies das Kollagen von Aurelia Monosaccharide Disaccharide strukturelle Ähnlichkeiten mit Wirbeljer- Kollagen Typ Rh. esculentum 0,07 9,24 V auf und die Kollagene von RhEsc, RhNom und Rh. hispidum 0,08 6,18 Rh. nomadica 0,06 7,1 RhHisp Ähnlichkeiten mit Wirbeljer- Kollagen Typ II Aurelia aurita 0,08 8,6 Kollagen Typ I* 0,67 1 Kollagen Typ II* 4 12 Kollagen Typ V* 5 17 Tabelle 7: Messung der Glykosilierung in Quallenkollagenen im Vergleich zu Wirbel[er- kollagenen. * Daten aus Miller (1984) (Miller 1984). Da in Kollagen jede drike Stelle von einem Glycin besetzt ist, spricht ein Glycingehalt von um die 300 AS- Reste pro 1000 AS- Resten (=30 %) für eine Isolierung mit sehr hohem Kollagengehalt. Die Aminosäureanalyse ergab, dass alle aus Quallen isolierte Kollagene bei einem Glycingehalt von 290 (Aurelia) bis 354 (RhNom) einen Reinheitsgrad von 96 bis 100 % aufwiesen (siehe Abb. 9). Wesentliche Unterschiede in der Zusammensetzung zwischen Quallen- und Wirbeljerkollagenen traten beim Gehalt an Hydroxyprolin (Hyp) und Hydroxylysin (Hyl) auf. Der Gehalt an Hyp war in den Abbildung 9: Aminosäurezusammensetzung der Quallen im Vergleich zu Wirbel[erkollagen. A: Aminosäurezusammensetzung als Reste pro 1000 Aminosäure- Reste. Die Daten für das Kollagen W T Typ I I aus Pieper (2002); hier wurden Asn/Asp und Gln/Glu zusammen gemessen, weswegen sie hier nicht aufgeführt wurden. Die Aminosäuren Met, Tyr, Phe und His sind hier nicht angegeben, da ihr Anteil unter 13 pro 1000 lag. Bei ihnen trat kein wesentlicher Unterschied zwischen Quallenkollagen und Wirbel[erkollagen auf. B: Differenz der Aminosäuren der Quallenkollagene zum WT Kollagen. Hier wird der geringere Anteil an Hyp und der höhere Anteil an Hyl der Quallenkollagene im Vergleich zu WT Kollagen deutlich. Auch zeigen die Quallenkollagene untereinander deutliche Unterschiede wie beispielsweise dem Asp- oder Pro- Gehalt. 40

50 3.1 Analyse und EigenschaIen von Quallenkollagen Kollagenen von RhEsc, RhHisp und RhNom etwa halb so hoch wie in WT Kollagen II; der von Aurelia war nur 1/3 des Wertes aus WT Kollagen. Dagegen war der Gehalt an Hyl in den Quallenkollagenen 5 10 mal höher als im WT Kollagen. Auch zeigten die Quallenkollagene untereinander deutliche Unterschiede wie beispielsweise dem Asp- oder Pro- Gehalt, die nicht auf die unterschiedlichen Gakungen zurückzuführen waren. Im Grad der Glykosilierung unterschieden sich die Quallen sowohl zu den Wirbeljerkollagenen, als auch untereinander (siehe Tabelle 7). Quallenkollagene wiesen insgesamt kaum bis keine Monosaccharide auf, dagegen haken sie ca. 3 bis 8 mal mehr Disaccharide als Wirbeljerkollagen Typ I. Gemessen an der Anzahl der Monosaccharide gleichen sie daher eher Wirbeljerkollagen Typ I, wohingegen die Glykosilierung mit Disacchariden bei allen Quallen Ähnlichkeit mit Wirbeljerkollagen Typ II aufweist. Die Schmelztemperaturen der Quallenkollagene waren im Vergleich zu Wirbeljerkollagenen deutlich niedriger (siehe Abb. 10). Aurelia- Kollagen schmolz bereits bei ca. 30 C, das der Quallen RhEsc, RhHisp und RhNom bei ca. 35 C und im Vergleich dazu die der Wirbeljere bei C. Kollagen erhält seine Stabilität unter anderem durch die WasserstoLrücken, die vom Hydroxyprolin zwischen den Monomeren innerhalb der Tripelhelix gebildet werden. Dadurch ist zu erklären, dass das Kollagen von Aurelia mit einem relajv geringen Hyp- Gehalt den niedrigsten Schmelzpunkt aufweist, wohingegen das Kollagen aus einem Wirbeljer mit sehr hohem Hyp- Gehalt den höchsten Schmelzpunkt besitzt (siehe Abb. 11). Es zeigt sich außerdem, dass die Quallen sich ihren Aurelia aurita Rh. esculentum Rh. nomadica Rh. hispidum Typ I (Rind) Typ I (Schwein) Typ I/III (Plazenta human) dθ /dt [mdeg/ C] Temperatur [ C] Abbildung 10: Erste Ableitung der Schmelzkurven im C D- Spektrometer bei einer Heizrate von 2 C/min und einer Wellenlänge von 220 nm. Das Kollagen beginnt bereits zu schmelzen, sobald dθ/dt nega[v wird. Der Peak entspricht dem Wendepunkt der Originalkurve, d.h. hier ist die HälIe des Kollagens geschmolzen. Der entsprechende Temperaturwert wird als Schmelztemperatur bezeichnet. 41

51 3.1 Analyse und EigenschaIen von Quallenkollagen Lebensräumen bezüglich der Thermostabilität ihrer Kollagene angepasst haben. Die Liadong- Bucht im Chinesischen Meer (Pazifik), einem typischen Lebensraum von Rhopilema esculentum, wies im Juli 2004 eine Temperatur von etwa 27 C auf (Dong 2008), die Ostsee hingegen im gleichen Zeitraum eine Temperatur von nur etwa 17 C; zum Zeitpunkt des Fangs sogar nur noch 14 C (Quelle: Messstajon des IfM Geomar, Kiel: Säugejere hingegen haben eine Körpertemperatur von etwa 37 C, was Kollagene mit höheren Schmelztemperaturen erfordert. Hyp-Reste pro 1000 AS 100 Säugetier 37 C 80 Aurelia aurita Rh. nomadica Rh. esculentum Rh. hispidum Kalb (Typ I) Pazifik 27 C Ostsee 17 C Schmelztemperatur [ C] Abbildung 11: Zusammenhang zwischen dem Hydroxyprolingehalt und der Schmelztemperatur von Quallenkollagenen im Vergleich zu Wirbel[erkollagen Typ I. Mit zunehmendem Hyp- Gehalt steigt die Schmelztemperatur linear an. Angegeben sind außerdem die Umgebungstemperaturen, aus denen die Kollagene stammen. Die Wassertemperaturen der Gebiete, aus der die Quallen Aurelia (Ostsee) und RhEsc (Pazifik) stammen, sind wegen der besseren Vergleichbarkeit jeweils vom Juli 2004, obwohl Aurelia im September 2004 gefangen wurde. Der Fangzeitpunkt von RhEsc war nicht zu ermi\eln. Daten von der Messsta[on des I FM- Geomar, Kiel bzw. Dong Fibrillenbildung quanjtajv Zunächst wurde in einem quanjtajven Versuch mit verschiedenen Puffern jeweils unterschiedlicher ph- Werte bzw. Konzentrajonen ein Puffer gesucht, der für die Fibrillenbildung von Quallenkollagen, speziell RhEsc, geeignet war. Dieser wurde dann in einem zweiten Versuch verwendet, um die grundsätzlichen FibrillierungseigenschaSen der verschiedenen Quallenkollagene im Vergleich zu humanem Plazentakollagen zu eruieren. 42

52 3.1 Analyse und EigenschaIen von Quallenkollagen Die Untersuchungen ergaben zunächst, dass grundsätzlich sowohl der TRIS- als auch der TES- Puffer zur Fibrillenbildung geeignet waren (siehe Abb. 12). Im TES- Puffer bei einem ein ph- Wert von 7,4 und ph 8,4 bildeten sich die meisten Fibrillen; das Pellet beider ph- Werte bestand aus etwa 90 % des Gesamtkollagens. Dies sjmmt überein mit Arbeiten mit Lachskollagen (Yunoki 2004) und Rakenschwanzkollagen (Williams 1978), wo ein ph- Wert 7 für die Fibrillenbildung als opjmal beschrieben wurde. Der TRIS- Puffer zeigte die effekjvste Fibrillenbildung bei einer Endkonzentrajon von 25 mm; hier war das meiste Kollagen fibrilliert. Auch eine Konzentrajon von 50 mm erbrachte einen etwas geringeren Anteil fibrillierten Kollagens. TRIS-Puffer ph 8,0 * 100 Fibrillenbildung [% von Kontrolle] TES-Puffer , TRIS-Konzentration [mm] 6,4 7,4 8,4 ph-wert Abbildung 12: Quan[ta[ve Untersuchungen zur Fibrillenbildung mit RhEsc. Eine 2mg/ml- Kollagenlösung wurde 1:1 mit den Puffern T RIS ph 8 (links) bzw. T ES- Puffer (rechts) versetzt. Die Kollagenkonzentra[onen im Überstand nach erfolgter Fibrillenbildung bei 25 C wurde bes[mmt und darüber der Anteil der gebildeten Fibrillen im Pellet berechnet. Die angegebenen Werte beziehen sich auf den Mi\elwert aus drei Nega[vkontrollen. n=3. Der Vergleich der Quallenkollagene zeigte, dass RhEsc in TRIS- Puffer die meisten Fibrillen bildete (ca. 90 %); vergleichbar mit Plazentakollagen mit ca. 100 % (siehe Abb. 13). RhHisp zeigte mit knapp unter 70 % eine deutlich unvollständigere Fibrillenbildung und Aurelia mit weniger als 20 % das geringste Potenjal. Da RhNom bezüglich Struktur und Glykosilierung dem Kollagen von RhHisp sehr ähnlich ist, wurden dieses Kollagen hier nicht mit untersucht. 43

53 3.1 Analyse und EigenschaIen von Quallenkollagen * Fibrillenbildung [% von Kontrolle] RhHisp RhEsc Aurelia Plazenta Abbildung 13: Quan[ta[ve Untersuchungen zur Fibrillenbildung mit Kollagenen von RhHisp, RhEsc und Aurelia im Vergleich zu Kollagen aus Plazenta. 1 mg/ml- Lösungen wurden 1:1 mit einem 100 mm TRIS- Puffer ph 8 versetzt. Die Kollagenkonzentra[onen im Überstand nach erfolgter Fibrillenbildung bei 20 C (RhHisp, RhEsc), 15 C (Aurelia) und 37 C (Plazenta) wurde bes[mmt und darüber der Anteil der gebildeten Fibrillen im Pellet zurückgerechnet. Die angegebenen Werte beziehen sich auf den Mi\elwert aus drei Nega[vkontrollen. n= Fibrillenbildung qualitajv Alle Quallenkollagene bildeten klar erkennbar Fibrillen. Auf den TEM- Bildern war eine deutliche Querstreifung der Plazentakollagen- Fibrillen zu erkennen (Abb. 14 A). Eine Querstreifung war auch auf den Fibrillen von RhEsc zu erkennen, allerdings war diese nicht so scharf abgesetzt wie erstere und in beiden Fällen wies die Periode eine Länge von 67 nm auf. Dagegen zeigten die Fibrillen von RhNom, RhHisp sowie Aurelia keinerlei erkennbare Querstreifung. Die Fibrillen mit dem breitesten Durchmesser ergab das Plazentakollagen mit 88.3 ± 13.5 nm, deutlich dünner waren hingegen die Fibrillen von RhEsc mit 53.4 ± 8.6 nm (Abb. 14 B). Die Fibrillen der anderen Quallenkollagene unterschieden sich dazu im Durchmesser nur noch gering. 44

54 3.1 Analyse und EigenschaIen von Quallenkollagen Abbildung 14: E M- Aufnahmen von Fibrillen (A) und die Vermessung der Durchmesser (B). Maßstabsbalken = 200 nm. Die Pfeile weisen auf die Querbänderung. Die Balken im Sca\erplot geben den Mi\elwert an; mehrere Auszählungen aus einem Bild und mehreren Bildern wurden zusammengenommen. 45

55 3.1 Analyse und EigenschaIen von Quallenkollagen Diskussion Die vorliegenden Daten zeigen, dass die Quallenkollagene Ähnlichkeiten mit Wirbeljerkollagenen aufweisen, sich aber dennoch durch einige EigenschaSen davon abheben. So kann man aufgrund der Zusammensetzung ihrer α- Helices die Quallen der Gakung Rhopilema (RhEsc, RhHisp, RhNom) mit der vermutlichen Zusammensetzung [α1] 3 als dem Wirbeljerkollagen Typ II- ähnlich bezeichnen. Zhuang et al. (2009 a) zeigen ebenfalls, dass es sich bei dem Kollagen um ein Homotrimer handelt und ähnliche LaufeigenschaSen im Gel wie das Wirbeljerkollagen Typ I aufweist. Ein Vergleich mit WT Kollagen Typ II fehlt hier allerdings. Dagegen ist das Kollagen von Aurelia dem WT Kollagen Typ V mit seiner heterotrimeren Struktur relajv ähnlich (Miura 1985). Entscheidend für eine Einordnung in die Kollagentypen ist jedoch auch der Grad der Glykosilierung (siehe Tabelle 7 und 8). Der hohe Glykosilierungsgrad der Cnidaria- Kollagene sind bereits bekannt (Kimura 1983, Nowack 1974, Tillet- Barret 1992), was sich auch hier widerspiegelte. Jedoch war keines der Quallenkollagene nennenswert monosaccharidisch glykosiliert; im Unterschied zu WT Kollagen, das 0,67 (Typ I), 4 (Typ II) bis 5 (Typ V) Monosaccharide pro 1000 Aminosäuren aufweist (Miller 1984). Mit etwa 6 bis 9 Disacchariden pro 1000 Aminosäuren sind die Kollagene der Quallen ähnlich hoch glykosiliert wie das WT Kollagen II (12). Die Kollagene der Gakung Rhopilema sind daher und wegen ihrer homotrimeren Struktur mit WT Kollagen II vergleichbar. WT Kollagen V ist mit 17 Disacchariden pro 1000 AS noch höher glykosiliert, dennoch kann das Aurelia- Kollagen wegen seiner heterotrimeren Struktur eher dem WT Kollagen V zugeordnet werden. Moleküle Disaccharide (pro 1000 AS) entspricht insgesamt WT I Heterotrimer 1 - WT II Homotrimer 12 - WT V Heterotrimer 17 - RhEsc Homotrimer 9,2 WT II RhHisp Homotrimer 6,2 WT II RhNom Homotrimer 7,1 WT II Aurelia Heterotrimer 8,6 WT V Tabelle 8: Vergleich und Einordnung der Quallenkollagene zu den Wirbel[erkollagenen. W T= Wirbel[er Wirbeljer- Atelokollagen des Typs II ist für die Verwendung als Implantat gänzlich ungeeignet, da es bekanntermaßen Arthrijs induziert (Brand 2007). Daher sind die bisher verwendeten Kollagene Typ I oder Typ I/III- Gemische, die jedoch der Nanostruktur des Knorpels nicht ganz entsprechen. Da das Quallenkollagen durch seine eniernte VerwandtschaS zu Wirbeljerkollagen womöglich die 46

56 3.1 Analyse und EigenschaIen von Quallenkollagen arthrijsinduzierenden EigenschaSen von Kollagen II nicht aufweist, ist es jedoch mit seiner Typ- II - Ähnlichkeit als Material zur Knorpelregenerajon vielversprechend. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass verschiedene Quallenkollagene in vitro Fibrillen bilden können. Elektronenmikroskopische Untersuchungen haken bereits gezeigt, dass das Kollagen in der Mesogloea von Quallen aus Fibrillen mit einem sehr dünnem Durchmesser von nm besteht, die offensichtlich keine Querstreifung aufwiesen (Miura 1985). Die Autoren vermuteten die Ursache dafür in der sehr hohen Glykosilierung des Kollagens (23-25 glykosilierte Hyl pro 1000 Aminosäuren, Notbohm 1999), da die Zucker das Kollagen hydrophiler machen, weswegen vermutlich eine dünnere Fibrille bereits ausreicht, um ein entropisches Gleichgewicht herzustellen (Kadler 1996). Auch bei den hier verwendeten Kollagenen zeichnet sich dieses Bild ab. Das Plazentakollagen, das größtenteils aus quasi nicht glykosiliertem Kollagen I bestand, bildete mit etwa 90 nm die dicksten Fibrillen mit deutlicher Querbänderung. Dagegen wiesen die hoch glykosilierten Quallenkollagene alle deutlich dünnere Fibrillen auf. Im Knorpel treten mit ca. 16 nm ausgesprochen dünne Fibrillen auf und dies besonders in der perizellulären Matrix (Poole 1985 ). Für die Entwicklung einer Matrix zur Knorpelregenerajon, die der natürlichen Umgebung möglichst nachempfunden sein sollte, sind daher dünne Fibrillen wünschenswert. Wegen ihres geringen Fibrillendurchmessers dürsen sich von daher Quallenkollagene besonders dafür eignen. Die Zusammensetzung der Aminosäuren in Quallen wurde bereits hinlänglich untersucht (Zhuang 2009 a, Miura 1985, Song 2006, Kimura 1983, Nagai 1999). Auffällig war dabei der im Verhältnis zu WT Kollagen geringe Gehalt an Hydroxyprolin (Miura 1985, Nagai 1999). Dieser Umstand steht im direkten Zusammenhang mit der geringeren Schmelztemperatur der Kollagene (Mizuno 2003). Da Quallen im Meer jedoch selten Temperaturen über 30 C ausgesetzt sind, müssen ihre Kollagene auch nicht so thermostabil sein wie die der Wirbeljere (ca. 40 C) oder ein Extrembeispiel aus dem Meer - die der Tiefseewürmer RiSia mit knapp 55 C (Bann 2000, Gaill 1991). Jedoch beschreiben Rigby und Hafey (1972) in einer Aurelia coerulea ( Aurelia aurita, Gershwin 2001) aus dem Pazifik einen etwa 1,5 fachen Hyp- Gehalt des hier gemessenen Aurelia- Kollagens. Der Pazifik hake zum Zeitpunkt des Fanges 26 C, was in klarem Gegensatz zur Ostsee steht, die selten Temperaturen über 20 C erreicht. Die Versuche zur Thermostabilität und Aminosäurezusammensetzung des gesamten, getrockneten Tieres sind so abweichend von den hier vorgenommenen Messungen, dass die Werte nicht ohne weiteres miteinander vergleichbar sind. Jedoch zeigt dies, dass die Organismen womöglich die Hydroxylierung des Prolins je nach Umfeld anpassen, was möglich ist, da es sich um eine poskranslajonale Modifikajon handelt. 47

57 3.1 Analyse und EigenschaIen von Quallenkollagen Die Analysen zeigten, dass sich die untersuchten Quallenkollagene Aurelia, RhHisp, RhNom und RhEsc in Struktur, Glykosilierung und Aminosäurezusammensetzung nicht wesentlich zu Wirbeljerkollagenen unterschieden. Eine gravierende Abweichung stellte jedoch die deutlich geringere Schmelztemperatur der Quallenkollagene dar. Zweifelsohne entspricht die Schmelztemperatur des Kollagens den jeweiligen Umweltbedingungen. Für Anwendungen bei höheren Temperaturen wie beispielsweise in der Zellkultur oder dem menschlichen Körper sind die geringen Schmelztemperaturen des Quallenkollagens allerdings nachteilig. Es konnte aber bereits gezeigt werden, dass sich Quallenkollagene wie andere Kollagene auch durch Vernetzung untereinander (Crosslinking) thermisch stabilisieren lassen (Addad 2011, Song 2006) und sie somit für das Tissue Engineering geeignet sind. 3.2 Wie sind die Eigenscha en zu variieren? - Physik Einleitung Eine dreidimensionale Matrix für das Tissue- Engineering sollte nicht nur in puncto Passgenauigkeit im Defekt maßgeschneidert sein, sondern auch die gewebespezifischen Anforderungen erfüllen, da Zellen in der Lage sind, über ihre Rezeptoren die physikalischen EigenschaSen ihrer Umwelt wie EZM- Struktur (Farjanel 2001, Wall 2005), Porengröße (Nehrer 1997, O'Brien 2007) und Steifigkeit (Discher 2005, Engler 2006, Schuh 2010, Schuh 2012 a, Schuh 2012 b) wahrzunehmen und diese somit Einfluss auf das Zellschicksal haben. Die Verwendung von fibrillärem Kollagen für eine möglichst gewebetreue Matrix ist naheliegend, da Kollagen in vitro in der Regel in dieser Konformajon ausrik, wobei der Durchmesser der Fibrillen je nach Gewebetyp stark variiert (Hulmes 2002). Auch die Porengröße bzw. - struktur muss den Anforderungen entsprechend angepasst sein, sie sollte einerseits genug Zellen bei der Besiedlung aufnehmen und ausreichend Diffusion ermöglichen. Andererseits sollte sie den Zellen ein geeignetes Umfeld bieten, was im Falle der Chondrozyten relajv große Poren ab einem Durchmesser von 85 µm (Nehrer 1997) bis zu 500 µm (Lien 2009) bedeutet. Besonderes Augenmerk wurde hier aber auf die Steifigkeit gerichtet, da sich ihre Bedeutung für die Zellen in diversen Arbeiten herauskristallisiert hake (siehe Kapitel 4.3). Jedes Gewebe weist eine mehr oder weniger spezifische Steifigkeit auf, wobei zwischen der ganzheitlichen Steifigkeit und derjenigen der Mikroumwelt um die Zelle herum unterschieden werden muss (siehe Abb.15). So besitzt der Gelenkknorpel insgesamt eine Steifigkeit 48

58 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik im Bereich von Megapascal (MPa), jedoch weist die perizelluläre Matrix im Chondron direkt um den Chondrozyten eine Steifigkeit von etwa kpa auf (Stolz 2004). Abbildung 15: Steifigkeiten der Mikroumgebungen unterschiedlicher Gewebe. Die Matrix, die die Knorpelzellen umgibt, weist eine Steifigkeit von etwa kpa auf. Nach Buxboim et al Eine Herausforderung ist es allerdings bei der Herstellung der Matrix, die einzelnen Parameter unabhängig voneinander zu steuern (siehe Abb. 16). So stellt es einen Unterschied für die physikalischen EigenschaSen dar, ob molekulares oder fibrilläres Kollagen verwendet wird, da Fibrillen stabiler als molekulares Kollagen sind, was sich in einer höheren Schmelztemperatur und mechanischen Stabilität widerspiegelt (Yunoki 2004 und 2008). Die Variajon der Porengröße bringt ebenfalls eine Veränderung der Steifigkeit mit sich: Je kleiner die Poren sind, desto mehr stützende Elemente sind vorhanden, die zu einer Erhöhung der Steifigkeit führen. Zur Variajon der Steifigkeit kann man die Substratkonzentrajon, die Porengröße oder - anzahl sowie die Anzahl der Quervernetzungen ändern. Durch die einfachste Variante, der Veränderung der Substratkonzentrajon, werden jedoch einerseits die Diffusion und andererseits die Anzahl der möglichen Adhäsionsstellen am Substrat verändert. Letzteres hat jedoch ähnliche Auswirkungen auf die Zellen wie eine Veränderung der Steifigkeit einer Matrix (Arnold 2004, Engler 2004 a, Engler 2004 b, Semler 2005, Khajwala 2006). Eine Variajon der Porengröße oder - anzahl führt ebenfalls zu einem indirekten Einfluss auf die Zellen durch unterschiedliche Diffusion oder ungleich besiedelten Matrices und direkt durch den Zell- Matrix- Kontakt (Murphy 2010, Woodfield 2005, Lien 2009, Nehrer 1997, O'Brien 2007). Denn in kleinen Poren erfahren die Zellen eine dreidimensionale Umgebung mit vielen Adhäsionsstellen, wohingegen große Poren wie ein zweidimensionaler Untergrund erscheinen, auf dem sie nur mit ihrer Unterseite hasen. 49

59 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik Abbildung 16: Möglichkeiten, die Steifigkeit einer Matrix zu variieren. Dies kann entweder über die Substratkonzentra[on, die Porenstruktur oder - anzahl sowie das Einbringen von Quervernetzungen erfolgen. Allerdings bringt nur letztere Mehode keine Nebeneffekte wie z.b. eine veränderte Diffusion mit sich und ist daher zu bevorzugen. Der Einfluss der Steifigkeit auf Zellen in 3D wurde bereits in Matrices verschiedener Substrate untersucht (siehe Tabelle 9). Dabei wurde die Steifigkeit mit Billigung unerwünschter Kreuzeffekte über die Substratkonzentrajon (z.b. Choi 2012, Critser 2010) oder den ph- Wert (Yamamura 2007) gesteuert oder es kam zu keiner befriedigenden Bandbreite der Steifigkeiten (z.b. Oliveira 2010, Keogh 2010). Nachteilig ist auch die Verwendung von Polymeren wie Agarose und PEG, die keine Bindungsstellen aufweisen und somit der Einfluss der Steifigkeit nicht direkt nachgewiesen werden kann (Schuh 2010, Bryant 2004, Bok 2010). Darüber hinaus gibt es etliche Arbeiten, in denen die Steifigkeit einer Kollagenmatrix indirekt durch AnheSung an einen Untergrund erhöht wird (z.b. Freyria 2009, Galie 2011, John 2010, Halliday 1995). Die Aussagen hierbei sind jedoch krijsch zu sehen, da womöglich die Steifigkeit nicht homogen ist und durch das Zusammenziehen der Matrix 50

60 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik Unterschiede in der Porengröße ausreten. Auch die Messung der Steifigkeit ist hierbei nur mit größerem Aufwand möglich (John 2010). Nach derzeijgem Stand der Literatur gab es noch keine Arbeit, in der die Steifigkeit der Scaffolds nur über eine Variajon der Quervernetzung in einem größeren Bereich variiert wurde. Die Bedeutung der großen Spannbreite der Steifigkeit liegt jedoch darin, durch deutliche Unterschiede in der Steifigkeit eine klare Reakjon der Zellen darauf aufzeigen zu können. Obwohl sich die Kollagenmatrix als Modell zur Untersuchung des Einflusses der Steifigkeit eignen könnte, war das Hauptziel dieser Arbeit jedoch insgesamt, eine geeignete Matrix mit einer vorteilhasen Steifigkeit zu entwickeln. Matrix Steifigkeit variiert durch Literatur PEG- Gele mit Fibrinogen 0,45 bis 5,8 kpa (*) Substratkonzentrajon Peyton 2008 PEG- Gele mit Fibrinogen maximal 0,34 ± 1 kpa (#) Substratkonzentrajon Shapira- Schweitzer 2007 PEG Hydrogel kpa (*) Substratkonzentrajon Bryant 2004 PEG Hydrogel bis zu 1,3 kpa (#) Substratkonzentrajon Bok 2010 Agarose 1,5 ± 0,7 bis 2580 ± 225 kpa Substratkonzentrajon Normand 2000 Substratkonzentrajon Schuh 2012 a und b Substratkonzentrajon bzw. Bian 2013 (*) Agarose mit RGD bzw. Agarose 3,7 ± 1,9 kpa bis 53,2 ± 14,6 unmodifiziert kpa bzw. 2,3 ± 1,1 kpa bis 36,1 ± 0,3 kpa (*) Methacrylierte Hyaluronsäure bis ca. 50 kpa (*) Quervernetzungsgrad Kollagen - Schwämmchen 1,8 kpa, keine Variajon (*) UV & DHT Oliveira 2010 Kollagen GAG Scaffold n.b. DHT & EDC- Konzentrajonen Vickers 2006 Kollagen- GAG- Scaffolds max. etwa 1,8 kpa (*) unterschiedliche Keogh 2010 Fixajonsmethoden Kollagen- GAG Scaffolds max. etwa 1,1 kpa (*) unterschiedliche Lee 2001 a Fixajonsmethoden Kollagengele 0,015 und 0,044 Pa (#) Substratkonzentrajon Choi 2012 Kollagengele 0,1 und 0,4 kpa (#) Substratkonzentrajon Baker 2011 Kollagengele 17,2 ± 1,7 bis 134,3 ± 33,4 kpa Substratkonzentrajon Critser 2010 (#) Kollagengele 5 kpa bis etwa kpa (*) ph- Wert Kollagenscaffold mit Gradient /- 487 kpa bis /- Substratkonzentrajon Yamamura 2007 Hadjipanayi kpa (n.b.) Tabelle 9: Übersicht über Matrices mit verschiedenen Steifigkeiten (Auswahl). Zu beachten ist, dass die Messungen mit unterschiedlichen Methoden erfolgten und die Werte daher nicht direkt miteinander vergleichbar sind. * = Druckprüfung; # = rheologische Messungen. U V = U V- Bestrahlung; D HT = dehydrothermale Behandlung; P EG = Polyethylenglykol. 51

61 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik Das Hauptaugenmerk galt in diesem Kapitel, die Matrix aus Quallenkollagen mit gezielten physikalischen EigenschaSen auszustaken. Dies machte gleichzeijg die Etablierung von Analyseverfahren notwendig, was hauptsächlich die Besjmmung der Steifigkeit der Konstrukte sowie den Grad der Quervernetzung umfasste. Die Möglichkeit, Quallenkollagen zu fibrillieren wurde bereits im Kapitel 3.1 nachgewiesen, jedoch musste noch die Herstellung einer dreidimensionalen Matrix erprobt und die Fibrillen darin nachgewiesen werden. Die Variajon der Porengröße über die Einfrierkinejk war bereits zuvor ausgiebig untersucht worden (Schoof 2000, O'Brien 2004, Kang 1999). Poren bilden sich dort, wo Eiskristalle des Lösungsmikels das umliegende Kollagen verdrängt haben und bei der anschließenden Gefriertrocknung das Eis sublimiert wird. Die Größe der Eiskristalle, die über die Einfrierkinejk gesteuert wird, besjmmt demnach auch die Größe der Poren. Da der Schwerpunkt der Untersuchungen jedoch auf dem Einfluss der Steifigkeit liegen sollte und die Porengröße ebenfalls interagiert, wurde der Einfachheit halber eine Porengröße gesucht, die eine möglichst breite Variajon der Steifigkeit zuließ. Letztere sollte durch verschieden starke Quervernetzungen erreicht werden, wobei eine physikalische und eine chemische Methode wegen ihrer einfachen Handhabung verwendet werden sollten. Bei der UV- Bestrahlung (Vizárová 1994, Kato 1995) werden keine zusätzlichen Stoffe eingebracht, weswegen die Methode untoxisch ist. Die aromajschen Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin absorbieren das UV- Licht (Sionkowska 2005), wodurch es einerseits zu Quervernetzungen kommt, gleichzeijg das Kollagen aber auch zerstört wird (Sionkowska 2005, Weadock 1995). 1- Ethyl- 3- (3- dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) ist ein Quervernetzer, der anders als z.b. Glutaraldehyd nach der Reakjon nicht als Teil der Verbindung zurückbleibt, sondern als Harnstoff ausgespült wird (Weadock 1983, Olde Damnik 1996; siehe Abb. 17). Die Quervernetzung erfolgt über die Akjvierung von Carboxylgruppen von Glutamin- und Abbildung 17: Ein- Stufen- Reak[on von EDC mit carboxyl- und aminhal[gen Molekülen. EDC wird, umgewandelt in Harnstoff, wieder aus der Reak[on enzernt. Nach dem Datenbla\ des Herstellers. 52

62 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik Asparaginsäureresten und der darauf folgenden Bildung von Pepjdbindungen in der Gegenwart von Lysin- oder Hydroxylysinresten und führt so zu einer Stabilisierung, was bereits auch bei Quallenkollagen Anwendung fand (Song 2006, Addad 2011). Um zu gewährleisten, dass für die physikalischen Messungen möglichst gleichförmige Matrices entstehen, wurden die Schwämmchen in einer speziell angeferjgten Gießform gegossen, darin gefriergetrocknet und später extern quervernetzt. Zunächst wurde an molekularen Schwämmchen versucht, durch Verwendung zweier Kollagenkonzentrajonen mit unterschiedlichen UV- Dosen bzw. EDC- Konzentrajonen eine möglichst breite Variajon der Steifigkeit zu erreichen. Es sollte dabei der in den Geweben beschriebene Bereich der Mikroumgebungen von < 10 kpa (Muskel, Fek) über ca kpa (Knorpel) bis zu kpa (Knochen, siehe Abb. 15) erreicht werden. Danach sollte die beste Variante auf die Herstellung von fibrillären Schwämmchen übertragen werden. Als Analyseverfahren kamen neben der Messung der Steifigkeit und Thermostabilität (indirekter Nachweis der Quervernetzungen) noch Untersuchungen zur Löslichkeit, Enzymresistenz sowie im Falle der Fibrillenscaffolds rasterkrasmikroskopische (AFM) Untersuchungen hinzu. Nach der Festlegung auf eine Quervernetzungsmethode sollte dann auch noch sichergestellt werden, dass diese keinen Einfluss auf die Porengröße häke Material und Methoden Scaffold Herstellung Zunächst wurde der Einfluss der Kollagenkonzentrajon, der Fixierungsmethode und der Kollagenstruktur (molekular bzw. fibrillär) auf die Scaffold- EigenschaSen mit RhEsc Kollagen untersucht. Zur Herstellung der Scaffolds wurde das gefriergetrocknete Quallenkollagen über Nacht bei 4 C in einer Konzentrajon von 10 bzw. 20 mg/ml auf einem Rükler in 0,05 % HAc gelöst. Um LuSblasen zu eniernen, wurde die Lösung dann bei 3500 g für 10 min bei 4 C abzentrifugiert, von hinten in eine Spritze gegeben und dann mit einer Kanüle in die Kammern einer eigens angeferjgten Gussform gespritzt. In einer Gussform konnten 24 Scaffolds mit einem Durchmesser von jeweils 6 mm und einer Tiefe von 3 mm hergestellt werden (siehe Abb. 18). Die Scaffolds wurden dann in den Gussformen bei entsprechender Temperatur über Nacht eingefroren. Um die Geschwindigkeit dabei zu reduzieren, wurden sie in Styroporkisten gegeben. Es war keine direkte Einflussnahme auf die Einfriergeschwindigkeit möglich, weswegen bei jeder Herstellung einer neuen Charge eine Temperaturaufzeichnung mit einem Muljmeter (Peaktech) erfolgte, wobei sich der Sensor an der 53

63 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik Gießform befand. Da sich hierbei immer Einfrierkurven stak Geraden ergaben, wurde per Definijon der relajv lineare Bereich zwischen +5 C und dem ersten Erreichen von - 5 C zur Besjmmung der Einfrierkinejk verwendet. Danach wurden die Schwämmchen noch in der Gießform an der Lyophilisajonsanlage VaCo 5 (Zirbus Technology, Deutschland) für mindestens zwei Tage getrocknet. Auswiegen der ferjgen Scaffolds zeigte, dass sich die Volumina in den jeweiligen Formen um maximal 1,9 % unterschieden, was als akzeptable Abweichung betrachtet wurde. Abbildung 18: A: Skizze vom AuDau der Giesskammer. 1) Schrauben 2) Deckpla\e aus Aluminium 3) Dichtung aus Teflon 4) formgebende Giesskammer aus Polyoxymethylen (POM) 5) Dichtung mit Einspritzlöchern aus Teflon 6) Deckpla\e aus Aluminium. Die Form wurde nach dem Zusammensetzen umgedreht, sodass die Einspritzlöcher schließlich nach oben zeigten. B: Fer[ge, gefriergetrocknete Matrices (20 mg/ml) von der Seite und oben. Die Pfeile zeigen auf die noch anhaienden Speiser. Maßstab in mm. Das Gießen der fibrillären Schwämmchen erfolgte auf die gleiche Weise. Jedoch wurden sie dann zur Fibrillierung in den Gießformen gegen 100 mm TRIS- HCl ph 8 über mehrere Tage bei 4 C und schließlich für 12 h bei Raumtemperatur dialysiert. Der letzte Schrik sollte gewährleisten, dass nach erfolgter Dialyse Fibrillen entstehen. Um eine geeignete Methode zur Herstellung dieser Scaffolds zu finden, wurde der erste Teil der Dialyse bei 4 C unter unterschiedlichen Bedingungen durchgeführt: zwei Tage sieben Tage zwei Tage geschlossene Form, fünf Tage geöffnete Form, um die Dialyse ohne umschließende Form zu erleichtern 54

64 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik Der Nachweis von Fibrillen in den Schwämmchen erfolgte durch AFM (atomic force microscopy), die freundlicherweise vom Freiberger Insjtut für Leder- und KunststoLahnen (FILK, Freiberg) durchgeführt wurde Quervernetzung Zur Fixierung wurden die Scaffolds nach der Gefriertrocknung physikalisch oder chemisch behandelt. Die physikalische Fixierung erfolgte nacheinander auf Ober- und Unterseite über UV- C- Licht bei 254 nm (Weadock 1995, Suh 1999, Yunoki 2003) in einem UV- Schrank (Stratalinker 1800, Stratagene) unterschiedlich lang, was eine entsprechende Variajon der Strahlendosis ergab. Der Zusammenhang zwischen Bestrahlungsdauer und Dosis konnte durch das Gerät ermikelt werden. Chemisch wurden die Scaffolds mit 1- Ethyl- 3- (3- dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)- Hydrochlorid (Thermo Scienjfic) in 80% Ethanol vercrosslinkt (Hoyer 2012). Dazu wurden sie für 1,5 h in der EDC- Lösung (etwa 0,5 ml pro Schwämmchen) der entsprechenden Konzentrajon bei RT unter leichtem Schwenken inkubiert, anschließend mehrfach mit Wasser gespült, über Nacht bei 4 C mit 1 % (w/v) Glycin (Biomol) inkubiert, erneut mehrfach in Wasser und schließlich in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und darin aukewahrt Analyjk: Porengröße Die Porengröße wurde besjmmt, um eine Aussage über die Scaffolds treffen zu können. Andererseits sollte sicher gestellt werden, dass durch die Fixierungsmethode keine Veränderung der Porengröße ausrat. Dafür wurde jeweils ein Scaffold, das auf - 20 C eingefroren wurde, mit 0,05; 0,15 bzw. 1 % EDC- Lösung fixiert, in PBS eingeweicht und schließlich mit Tissue Tek in CryoMold- Gefäßen (beide Sakura, Torrance, USA) bei - 20 C eingefroren. Geschniken wurden sie dann mit einem Leica CM3050 Cryotom und später lichtmikroskopisch ausgewertet. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden an fixierten Scaffolds freundlicherweise vom Insjtut für Anatomie der Universität zu Lübeck sowie am Zentrum für translajonale Knochen-, Gelenk- und Weichgewebeforschung der TU Dresden gemacht. 55

65 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik Analyjk: Steifigkeit Die Steifigkeit wurde nach Stok et al. (2009) durch Kompressionstests auf einer Materialprüfmaschine (Zwick/Roell 1456, Ulm) mit einem 5 N KraSaufnehmer gemessen. Eine geeignete Größe für den Prüfstempel wurde nach Spilker et al. (1992) ermikelt; der Durchmesser betrug 1,38 mm. Die Probe wurde vorher für wenigstens 15 min in PBS getränkt, in die Halterung gegeben und dort, mit PBS überschichtet, für wenigstens 5 min ruhen gelassen. Die Halterung befand sich auf einem Mikrokoordinatenjsch; eine Plexiglasabdeckung verhinderte das Hochbiegen der Probe (siehe Abb. 19). Abbildung 19: Messanordnung zur Steifigkeitsbes[mmung der Schwämmchen an der Materialprüfmaschine. Links: Schema[scher AuDau, nicht maßstabsgetreu. Rechts: Foto des Sensors. Der Stempel wurde stufenweise 5 %, 15 % und 25 % der Probendicke jef in die Probe gefahren und gehalten, bis das System sich entspannt hake. Bei dem Kollagenscaffold handelt es sich wegen der Flüssigkeit in den Poren um ein viskoelasjsches System. Um zu erreichen, dass der Druck nur vom Kollagen selber getragen wird, wurde das E- Modul im Gleichgewichtszustand nach der Entspannung gemessen, wenn die Flüssigkeit nach einem neuen Druckeinfluss aus dem System entwichen war (Buckley 2009). Das E- Modul wurde aus dem Mikelwert der letzten zehn Werte der Gleichgewichtsphase von drei Eindrückstufen besjmmt: E- Modul [kpa] ist die Steigung aus der Dehnung (x) und Spannung (y) Dehnung = Eindringjefe [mm]/dicke der Probe [mm] 56

66 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik Spannung = KraS [mn] / Fläche des Stempels [mm²] Als Oberfläche der Probe wurde die Einstellung definiert, bei der der Sensor 0,1 mn Widerstand erfasste Analyjk: Thermostabilität, DSC Mit der Dynamischen Differenzialkalorimetrie (differenjal scanning calorimetry, DSC) können Phasenübergänge über die aufgenommene oder abgegebene Wärmemenge eines Materials beim Erhitzen, Abkühlen oder unter isothermen Bedingungen erfasst werden. So kann beispielsweise das Schmelzen von Kollagenproben unter konstanter AuNeizung als ein endothermer Vorgang besjmmt werden. Die nassen Proben wurden gründlich in Wasser gespült, durch ausdrücken auf einem Tuch von überflüssigem Wasser befreit, in 50 µl Aluminiumpfännchen (Perkin Elmer, BO und BO ) versiegelt und schließlich in einem Pyris 6 DSC mit zugehöriger SoSware (Perkin Elmer, USA) bei einer Heizrate von 2 C/min erhitzt. Ein leeres Pfännchen diente dabei als Referenz. Die erhaltene Schmelzkurve ist in folgende Abschnike eingeteilt: Bei der Onset(- Temperatur) schneidet die Tangente im Wendepunkt die Grundlinie, als Peak(- Temperatur) wird die maximale Denaturierungstemperatur bezeichnet (Menjnk 2002). Da bei einigen Messungen die Onset- Temperatur nicht eindeujg zu besjmmen waren, wurde grundsätzlich die Peak- Temperatur für die Messungen herangezogen Analyjk: Löslichkeit Über die Löslichkeit wurde der nicht quervernetzte Anteil des Scaffolds besjmmt. Dazu wurden die abgewogenen Scaffolds jeweils mit 250 μl 0,05 % HAc versetzt und anschließend über Nacht auf dem Rükler bei 23 C inkubiert. Die unlöslichen Anteile wurden durch Zentrifugajon bei g für 10 min abgetrennt und der lösliche Anteil im Überstand, der aus najvem und denaturiertem Kollagen bestand, mikels Hydroxyprolin- Besjmmung gemessen Analyjk: Enzymresistenz Der Enzymverdau mit Trypsin kann eine mögliche Denaturierung bzw. Quervernetzung aufzeigen, da Trypsin Proteine spezifisch zwischen Lysin und Arginin spaltet und tripelhelikales Kollagen für das Enzym nicht zugänglich ist. 57

67 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik Dazu wurden die einzelnen Schwämmchen bei 4 C mit 600 μl 95 mm NaHCO3- Puffer ph 8,2 wie unter Punkt beschrieben für 3 x 30 s homogenisiert. 50 μl der Lösung wurden abgenommen (unverdaute Probe) und zur restlichen Lösung wurden 50 μl einer 450 µg/ml Trypsinlösung (PAN Biotech GmbH, U/mg) in NaHCO3- Puffer gegeben. Nach einem Verdau für 2 min bei 23 C wurden die Proben zum Abstoppen der Reakjon direkt für die Elektrophorese (siehe Punkt ) vorbereitet Ergebnisse und Diskussion: Einfluss der Fixierungsmethode und der Kollagenkonzentrajon auf die Steifigkeit Mit der EDC- Fixierung konnte eine deutlich größere Variajon der Steifigkeit erreicht werden als mit der UV- Fixierung, sofern die höhere Kollagenkonzentrajon von 20 mg/ml verwendet wurde (siehe Abb. 20). Dies spiegelt Ergebnisse wider, bei denen mit dehydrothermaler Behandlung (DHT) beziehungsweise Glutaraldehyd wesentlich geringere Steifigkeiten erreicht wurden als mit EDC (Keogh 2010, Lee 2001 a, Vickers 2006 siehe Tabelle 9). Das Spektrum der Steifigkeit reichte bei den 20 mg/ml Schwämmchen von ca. 4 kpa (0,05 % EDC) bis ca. 23 kpa (1 % EDC), wobei die Sämgungskurve anzeigt, dass mit höheren EDC- Konzentrajonen keine wesentliche Erhöhung der Steifigkeit zu erwarten wäre. Wie spätere Versuche zeigten, waren mit 1% EDC fixierte Scaffolds in anderen Chargen jedoch mit bis zu ca. 40 kpa davon deutlich abweichend (siehe Tabelle 13), was auf die nicht immer gleichen Bedingungen bei der manuellen Herstellung zurückzuführen ist. Die Schwämmchen mit der geringeren Kollagenkonzentrajon ließen sich nicht durch Erhöhung der EDC- Konzentrajon in ihrer Steifigkeit variieren; sie sjeg nie über durchschniklich 4 kpa. Schwämmchen, die mit einer EDC- Konzentrajon unter 0,25 % fixiert wurden, waren ähnlich weich wie unfixierte Schwämmchen und ließen sich daher nicht mehr messen. Die UV- Fixierung erwies sich als gänzlich ungeeignet, um die Steifigkeit zu variieren. 10 mg/ml Schwämmchen waren wegen ihrer Weichheit nicht messbar, und die höher konzentrierten Schwämmchen erreichten auch nach einer Bestrahlung von 440 kj keine größere Steifigkeit als ca. 4 kpa. 58

68 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik EDC-Fixierung UV Fixierung E-Modul [kpa] mg 10 mg EDC-Konzentration [w/v %] 20 mg UV-Dosis pro Seite [kj] Abbildung 20: Abhängigkeit des E- Moduls von der EDC- Konzentra[on bzw. UV- Dosis bei Schwämmchen mit unterschiedlicher Kollagenkonzentra[on. Bei Verwendung von E DC konnte eine stufenweise Erhöhung der Steifigkeit bis hin zu ca. 23 kpa mit den 20 mg/ml- Scaffolds erreicht werden (links). U V- Bestrahlung brachte bei allen verwendeten Dosen und Kollagenkonzentra[onen keine Erhöhung. Die 10 mg/ml- Matrices waren trotz dieser Fixierung noch zu weich, um gemessen zu werden. n=3-4 Dass die Kollagenkonzentrajon der Schwämmchen einen Einfluss auf die Steifigkeit hake, war zu erwarten. Für die vorliegenden Arbeit war es jedoch notwendig, eine Konzentrajon zu ermikeln, die eine prakjkable Variajon der Steifigkeit über EDC- bzw. UV- Fixierung erlaubt. Eine Konzentrajon von 20 mg/ml erwies sich demnach als besonders geeignet. Diese ist zwar verhältnismäßig hoch (vergl. Roche 2001, Pieper 2002), aber nicht ungewöhnlich (Mukaida 2005). Die Verwendung höherer Konzentrajonen war wegen der daraus resuljerenden hohen Viskosität der Lösung und der damit verbundenen schlechten Handhabbarkeit nicht möglich.löslichkeit und Thermostabilität Die Analysen der Löslichkeit zeigten, dass die EDC- Fixierung zu einer so umfangreichen Quervernetzung führte, dass sich schon bei geringen Konzentrajonen (0,25 %) kein lösliches Kollagen im Überstand mehr nachweisen ließ (siehe Abb. 21). Die UV- Bestrahlung war diesbezüglich keine so effekjve Methode zur Quervernetzung. Zwar konnte bereits durch eine relajv geringe Bestrahlungsdosis von 53 kj je Seite ein um das Vierfache geringerer löslicher Anteil festgestellt werden, jedoch lösten sich immer noch mehr als 30 % des Schwämmchens. Eine doppelte Dosis von 106 kj ergab nochmals eine Reduzierung um etwa die HälSe, eine noch höhere Dosis ergab keine wesentliche Änderung mehr. Dennoch konnte die Löslichkeit durch Behandlung mit der höchsten Dosis von 424 kj signifikant im Vergleich zur Kontrolle reduziert werden. Die EDC- Fixierung hake nicht nur auf die Steifigkeit sondern auch auf die Thermostabilität der Schwämmchen einen deutlichen Einfluss (siehe Abb. 22). Unfixierte Schwämmchen wiesen eine 59

69 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik Schmelztemperatur von ca. 36,5 C auf (siehe Abb. 23 oben links). Bereits eine geringe Quervernetzung mit 0,05 % EDC führte zu einer Erhöhung der Schmelztemperatur; sie erreichte mit etwa 63 C ihren Höchstwert bei einer EDC- Konzentrajon von 1 % (w/v). Da auch diese Kurve ebenso wie die der Steifigkeitsmessung den Verlauf einer Sämgungskurve aufwies, ist davon auszugehen, dass eine höhere EDC- Konzentrajon keine wesentliche Erhöhung der Schmelztemperatur und somit vermehrter Quervernetzung erbringen würde. EDC - Fixierung UV-Bestrahlung Löslicher Anteil [%] * ,25 0,5 0 1 EDC-Konzentration [% w/v] UV-Dosis pro Seite [kj] Abbildung 21: Lösliche Anteile der 20 mg/ml- Scaffolds nach EDC- Fixierung (links) und UV- Fixierung (rechts) im Überstand nach Lösen über Nacht, bes[mmt über Hydroxyprolinbes[mmung. Die Nullproben sind für beide Methoden die selben Peak-Temperatur [ C] Schwämmchen gewesen. n=3 70 Die UV- Bestrahlung erbrachte keine 65 Erhöhung der Thermostabilität bei 60 zunehmender Strahlendosis, jedoch eine 55 deutliche Reduzierung des Energieflusses, 50 was durch eine Absenkung der Peakhöhe 45 erkennbar war (siehe Abb. 23). Unfixierte EDC-Konzentration [w/v %] Scaffolds wiesen eine Schmelztemperatur (Peak) von ca. 36,5 C auf, mit einer Peakhöhe deutlich über 0,4 kj. Mit Abbildung 22: Abhängigkeit der Schmelztemperatur von der EDC- Konzentra[on. Verwendet wurden 20 mg/ml Scaffolds, die bei einer Heizrate von 2 C/min im D SC gemessen wurden. n=2 60 zunehmender UV- Bestrahlung blieb der Peak

70 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik stets bei ~36,5 C, wohingegen die Peakhöhe etwa um ¼ auf ca. 0,1 kj sank. Dieses Ergebnis ist auf zwei Möglichkeiten zurückzuführen: 1) Die UV- Bestrahlung führt zu einer Denaturierung des Kollagens. Die kürzeren tripelhelikalen Abschnike benöjgen jetzt weniger Energie (Enthalpie), um aufzuschmelzen. Die Stärke der Quervernetzung, die aufgrund der geringeren Löslichkeit der bestrahlten Scaffolds eindeujg vorliegt, ist nicht hoch genug, um die Schmelztemperatur der Scaffolds zu erhöhen oder die Quervernetzung zwischen den kurzen Kollagenstücken erhöht die Schmelztemperatur nicht. Durch Überlagerung von Denaturierung und Quervernetzung sind die Effekte nicht ganz voneinander zu trennen. 2) Die UV- Bestrahlung führt zu einer zunehmenden Quervernetzung des Kollagens. Durch die immer dichter liegenden Quervernetzungen werden die tripelhelikalen Abschnike, die noch aufschmelzen können, immer kürzer. Für kürzere Keken wird weniger Engergie benöjgt. Die Quervernetzungen selber schmelzen dann womöglich in einem hier nicht mehr messbaren Bereich (oberhalb von 90 C). Abbildung 23: Einfluss der UV- Bestrahlung auf die Schmelzkurven der Scaffolds. Mit zunehmender Dosis war eine Abnahme der Peakhöhe zu erkennen. Die unterschiedlichen Linien stellen einzelne Replikate dar (n=2-3). Der Peak liegt jeweils im Bereich von 36,5 C, dargestellt durch die gestrichelte Linie. Die jeweiligen Kurven wurden auf ein einheitliches Anfangsniveau verschoben, daher ist der Energiefluß als rela[v anzusehen. 61

71 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik Gegen den zweiten Punkt spricht allerdings, dass bei zunehmender Quervernetzung durch EDC ebenfalls die Enthalpie sinken müsste und außerdem sich bei den UV- bestrahlten Scaffolds auch nach maximaler Dosis noch lösliche Anteile fanden, d.h. keine (ausreichende) Quervernetzung staland. Eine Konzentrajonsbesjmmung über Hydroxyprolin ließ keinen Rückschluss zu, ob es sich dabei um najves oder denaturiertes Kollagen handelte. Die hier verwendete UV- Röhre hake ein Wellenspektrum von 254 nm (UV- C). Dies entspricht der für Proteine unkrijschsten Wellenlänge, da diese ihre Absorpjonsmaxima bei nm (Pepjdbindung zwischen den Aminosäuren) und um 280 nm (aromajsche Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin) haben (Goldfarb 1951, Belitz 2001). Da die so behandelten Matrices dennoch quervernetzt wurden, erschließt sich nur aus ihrer zunehmend geringen Löslichkeit mit steigender UV- Dosis. Womöglich ist die Bestrahlung mit 254 nm für das Kollagen sehr schonend, kann aber nicht zur Variajon der Steifigkeit verwendet werden. Dennoch kommt es auch bei dieser Wellenlänge zu einer Denaturierung des Kollagens durch Radikale (Rabotyagova 2008). Abbildung 24: Gelelektrophorese von EDC- und UV- fixierter Scaffolds nach Trypsinverdau. Links UV- fixierte, rechts E DC- fixierte Schwämmchen. : unverdaut; : Trypsin- verdaut. Mit zunehmender U V- Fixierung wird die α- Bande reduziert. Dies könnte an einer Zunahme an quervernetztem Kollagen liegen (* am Beginn des Trenngels und ** in den Taschen). Da auch unfixierte Schwämmchen Abbaubanden zeigen (***), gibt es womöglich nicht- tripelhelikale Stellen im Quallenkollagen, die durch das Trypsin angegriffen wurden. Mit zunehmender U V- Fixierung nehmen diese Banden in ihrer Intensität nicht zu, sondern ab, was daruf hinweist, dass die UV- Fixierung zu keiner wesentlichen Denaturierung, aber einer gewissen Quervernetzung führen könnte. In den E DC- fixierten Proben war bei keiner E DC- Konzentra[on eine Bande zu erkennen, da das Kollagen 62 bereits bei geringen E DC- Konzentra[onen so hoch quervernetzt war, dass kein unverdautes Kollagen mehr ins Gel einwandern konnte und keines für das Trypsin zur Verfügung stand (siehe Löslichkeitsversuch).

72 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik In der Gelelektrophorese nach dem Trypsinverdau zeigte sich zunächst, dass das Quallenkollagen womöglich nicht- tripelhelikale Abschnike besitzt, an denen das Trypsin ansetzen konnte (siehe Abb. 24). Außerdem wurden durch das Bild der unverdauten Proben die Ergebnisse des Löslichkeitsversuches bestäjgt: Schon durch eine geringe Fixierung mit 0,25 % EDC war die Löslichkeit soweit herabgesetzt, dass kein Kollagen mehr im Gel nachzuweisen war. Dagegen war bei allen verwendeten UV- Dosen noch eine α- Bande zu sehen, die jedoch mit zunehmender Bestrahlung abnahm. Dies dürse auf eine Zunahme an Quervernetzungen zurückzuführen sein, denn schon bei der geringsten Dosis waren größere Aggregate in den Taschen des Gels sowie an der Grenze von Sammel- zu Trenngel zu erkennen. Eine Denaturierung trat nach diesen Ergebnissen wohl bei beiden Methoden nicht auf, denn auch mit zunehmender EDC- Konzentrajon waren keine Abbaubanden nach Trypsinverdau zu sehen bzw. nahm die Intensität der Abbaubanden mit zunehmender UV- Dosis ab. Dies schließt aber nicht aus, dass durch UV- Bestrahlung entstandene Bruchstücke quervernetzt werden, wodurch sie für das Trypsin wieder unzugänglich würden. Die Daten der Steifigkeitsmessung ergaben zusammenfassend, dass sich Schwämmchen mit einer höheren Kollagenkonzentrajon von 20 mg/ml für eine Variajon der Steifigkeit besser eignen als solche mit einer geringeren Konzentrajon. Die geringere Steifigkeit der 10 mg/ml Scaffolds könnte einerseits durch das geringere Vorhandensein von Baumaterial zu erklären sein und andererseits durch die weniger vorhandenen Stellen für Quervernetzungen. Darüber hinaus resuljeren 20 mg/ml Schwämmchen, die mit verschiedenen EDC- Konzentrajonen quervernetzt worden waren, in einer ausgeprägten Variabilität bis hin zu ca. 23 kpa. Schon geringe EDC- Konzentrajonen führten zu einer quasi vollständigen Unlöslichkeit und die Thermostabilität wurde von 36,5 C auf etwa 63 C durch EDC- Fixierung erhöht, wodurch die Quervernetzung indirekt nachgewiesen werden konnte. Da die UV- Fixierung nicht sicher Quervernetzungen induzierte, das Kollagen womöglich auch hier denaturiert wurde (Weadock 1995) und außerdem keine so große Bandbreite an Steifigkeiten hervorzubringen war, wurde der EDC- Fixierung im Folgenden und auch für die spätere Herstellung der Schwämmchen für die Zellkulturen der Vorzug gegeben Porengröße und Einfluss der EDC- Fixierung darauf Unklar war, ob die Porengröße durch eine EDC- Fixierung variiert würde, was unerwünschte Nebeneffekte zur Folge häke. Song et al. (2006) beschrieben zwar, dass eine EDC/NHS Quervernetzung die Mikrostruktur von Kollagenscaffolds nicht signifikant verändern würde, jedoch beschrieben Park et al. (2002) einen Einfluss der EDC- Fixierung auf die Porengröße, der noch dazu 63

73 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik abhängig von der Einfriertemperatur war. Es musste folglich überprüs werden, ob auch in dem hier beschriebenen System eine Auswirkung der EDC- Fixierung in unterschiedlichen Konzentrajonen feststellbar wäre. Die Ausmessung von jeweils zehn Poren in drei Schniken eines Schwämmchens ergab eine durchschnikliche Porengröße der inneren und äußeren Poren von ca. 80 µm. Nur bei den mit 1 % (w/v) fixierten Scaffolds waren die äußeren Poren mit ca. 70 µm messbar kleiner (siehe Abb. 25), was einer Größenredukjon von ca. 12 % entspricht. Eine Verringerung von 12 %, die einerseits nur bei der 1 % EDC- Fixierung zu beobachten war und zudem nur im Randbereich ausrat, wurde für die Fragestellung des Einflusses der Steifigkeit auf die Zellen schließlich als nicht entscheidend betrachtet. Abbildung 25: Einfluss der EDC- Vercrosslinkung auf die Porengröße. Vermessen wurden jeweils 10 Poren in 3 Schni\en aus einem Scaffold der jeweiligen EDC- Konzentra[on. Alle 30 Messungen wurden hier als ein Ergebnis aufgetragen (n=30). außen ist der Randbereich des Scaffolds, innen der mi\lere Bereich. Eine sta[s[sche Relevanz war nicht festzustellen Fibrillenscaffolds Die Herstellung von gleichförmigen Fibrillenscaffolds erwies sich als sehr aufwändig. Das übliche Verfahren, eine Kollagenlösung mit Puffer zur Fibrillenbildung zu versetzen, entpuppte sich hier als ungeeignet, da die dann sehr viskose Lösung nicht mehr in die Gießformen zu spritzen war. Daher wurden die Schwämmchen wie üblich gegossen und die kompleke Gießform dann für eine gewisse 64

74 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik Zeit in 100 mm TRIS- HCl ph 8 gegeben. Durch die zwei Einspritzlöcher für jedes Schwämmchen sollte über diesen Zeitraum genug Puffer eindiffundiert sein, um eine Fibrillierung zu ermöglichen. AFM- Aufnahmen zeigten, dass auf den Scaffolds selber keine Fibrillen nachzuweisen waren (siehe Abb. 26). Das Material, das bei der Vorbereitung für die AFM aus den unfixierten Scaffolds herausgespült wurde, zeigte in allen Scaffoldtypen allerdings fibrilläre Strukturen, die mit zunehmender Inkubajonsdauer in TRIS deutlicher als solche zu erkennen waren. Gleichwohl war auf keiner der Proben die für Fibrillen typische Querstreifung zu erkennen. Die Scaffolds, die nur für zwei Tage in TRIS inkubiert worden waren, zeigten außen diffuse Strukturen mit einem Durchmesser von etwa 80 bis 120 nm. Nach 7 Tagen Inkubajon waren in den Proben bereits deutlich fibrilläre Strukturen zu erkennen, die einen Durchmesser von etwa 75 bis 90 nm aufwiesen. Eine Inkubajon für zwei Tage in geschlossener Gießform mit anschließender Inkubajon der offenen Scaffolds brachte schließlich Fibrillen von etwa nm Durchmesser hervor, die auch in Bündeln mit einer Stärke von etwa 100 bis 160 nm ausraten. Damit waren diese Fibrillen ähnlich stark wie die, die aus einer Kollagenlösung direkt hergestellt worden waren (siehe Kapitel ). Im AFM wurde jeweils nur ein Scaffold untersucht, daher sind präzise Aussagen über das Vorkommen und die Beschaffenheit von Fibrillen in den so geferjgten Scaffolds hier nicht möglich. Dennoch ist zu erkennen, dass eine längere Inkubajonsdauer eher zu fibrillären Strukturen führt. Außerdem ist es für die Fibrillenbildung vorteilhas, wenn die Diffusion des Puffers in das Kollagen ungehemmt stalinden kann. Da hierfür jedoch die Gießform geöffnet werden musste und die Scaffolds somit ihre definierte Form durch das Quellen verloren, erwies sich diese Methode letztlich für die hiesige Fragestellung als ungeeignet. Die Fibrillenscaffolds waren sehr schlecht reproduzierbar und so unterschieden sich die einzelnen Chargen deutlich in Struktur und Steifigkeit (Daten nicht gezeigt). Aufgrund dieses Umstandes und der geringeren Eignung in der Zellkultur (siehe Kapitel ) wurde diese Matrix später nicht mehr weiter verwendet. 65

75 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik Abbildung 26: A FM- Aufnahmen von Fibrillenscaffolds. Bilder A, C und E: direkt auf dem Scaffold aufgenommen. Bilder B, D und F: Material, das aus dem Scaffold gespült wurde, neben dem Scaffold aufgenommen. A, B: 2 Tage Dialyse. C, D: 7 Tage Dialyse. E, F: 7 Tage Dialyse, davon 5 Tage offene Form. Bei der vermeintlichen Querstreifung auf Bild C und F handelt es sich um ein Artefakt, da sie in einer einheitlichen Richtung über das Bild, jedoch nicht in der entsprechenden Richtung auf den fibrillären Strukturen verläui (klar zu erkennen in Bild D). Durch diesen Effekt ist allerdings nicht gänzlich auszuschließen, dass eine tatsächliche Querstreifung vorhanden ist. Die Aufnahmen wurden freundlicherweise von F ILK gemacht. 66

76 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik Physikalische EigenschaSen der Scaffolds aus verschiedenen Quallenkollagenen Temperaturresistenz Steifigkeit 60 E-Modul [kpa] Peak-Temperatur [ C] Rh. esculentum Rh. hispidum Rh. nomadica Aurelia aurita Plazenta (human) EDC-Konzentration [w/v %] EDC-Konzentration [w/v %] Abbildung 27: Einfluss der EDC- Fixierung auf die physikalischen EigenschaIen von Scaffolds aus unterschiedlichen Quallenkollagenen. Links: Ans[eg der Schmelztemperatur (Peak- Temperatur), rechts: Veränderung der Steifigkeit (E- Modul). Sca\erplot, n=3 Die Scaffolds aus RhEsc, RhNom, RhHisp und Aurelia wurden mit EDC- Lösungen in unterschiedlichen Konzentrajonen fixiert und ihre physikalischen EigenschaSen gemessen (siehe Abb. 27). Zum Vergleich wurden Scaffolds aus humanem Plazenta- Kollagen (Typ I/III) in gleicher Weise hergestellt und behandelt. Die Schmelztemperatur sjeg bei allen mit EDC- behandelten Scaffolds entsprechend der Dosis in ähnlicher Intensität an. Jedoch erreichten die Scaffolds der unterschiedlichen Kollagenquellen keine einheitliche Schmelztemperatur; die maximal erreichbare Temperaturresistenz spiegelte auch die Temperaturresistenz des Ausgangsmaterials wider. Auch eine einheitliche Steifigkeit wurde nicht erreicht. Schwämmchen aus RhEsc, RhHisp und Plazentakollagen konnten mit zunehmender EDC- Konzentrajon steifer gemacht werden; sie lagen schließlich alle im Bereich von ca. 10 bis 18 kpa. Dagegen blieben die Scaffolds aus Aurelia und RhNom mit ca. 3 bis 6 kpa deutlich darunter, was keinen wesentlichen Ansjeg der Steifigkeit insgesamt erkennen lässt. Bei der Zunahme von Steifigkeit und Temperaturresistenz fällt auf, dass die Schwämmchen aus RhEsc und RhHisp deutliche, diejenigen aus Kollagen von Aurelia und RhNom dagegen keine erkennbaren Zunahmen erfuhren. Da das Kollagen von RhNom dem von RhHisp in puncto Struktur, Aminosäurezusammensetzung und Glykosilierung sehr ähnlich ist, können diese Faktoren offensichtlich keinen Einfluss auf die physikalischen EigenschaSen der Scaffolds haben. Jedoch könnte dieser Umstand auf die unterschiedlichen Zustände des Ausgangsmaterials zurückzuführen sein, da es sich bei RhEsc und RhHisp um gepökelte und bei RhNom und Aurelia um frisch gefangene Quallen handelte. Ohne weitere Analysen war es jedoch nicht möglich, die Auswirkungen des Pökelns auf das 67

77 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik Kollagen zu besjmmen. Die Daten legten aber nahe, dass sich RhEsc eignete, um damit schwerpunktmäßig weiter zu arbeiten Zusammenfassende Diskussion Ziel war es, eine Herstellungsmethode der Scaffolds zu finden, die es ermöglichte, mit einer Auswahl an Methoden die physikalischen EigenschaSen zu variieren. Diese sollten später (siehe Kapitel 4.3) auf ihre Eignung, den chondrozytären Phänotyp zu erhalten, getestet werden. Entscheidende EigenschaSen der Scaffolds waren die Molekülstruktur (d.h. fibrillär und molekular), der Vernetzungsgrad und die damit zusammenhängende Steifigkeit. Diese Versuche wurden zunächst mit Kollagen von RhEsc durchgeführt und die als am besten bewertete Methode abschließend auf alle hier verwendeten Quallenkollagene angewendet. Zunächst wurde untersucht, welche Fixierungsmethode (chemisch oder physikalisch) die größte Variajonsmöglichkeit der Steifigkeit erlauben würde. Dazu wurden die Scaffolds jeweils mit unterschiedlichen Dosen UV- Licht bzw. Konzentrajonen von EDC fixiert. Es stellte sich heraus, dass es durch die UV- Fixierung nur zu einer unvollständigen Quervernetzung kommt und die chemische Vernetzung entsprechend besser ist (Suh 1999). Eine Denaturierung des Kollagens konnte zwar durch Überschneidungen von Effekten, die aus der Quervernetzung resuljerten, nicht direkt nachgewiesen werden. Jedoch ist hinlänglich bekannt, dass durch Bestrahlung mehrere Schädigungen des Kollagens wie die Zerstörung aromajscher und schwefelhaljger Aminosäuren, Aggregajon, Quervernetzung, Aufspaltung und Zerstückelung sowie teilweiser Auffaltung des Kollagens ausreten können (Sionkowska 2005, Weadock 1995). Bei der UV- Bestrahlung war im Gegensatz zur EDC- Fixierung kein Ansjeg der Schmelztemperatur und der Steifigkeit zu erkennen und die Löslichkeit war selbst bei der hier maximal verwendeten Dosis nicht vollständig zurückgegangen, was für eine nicht zufriedenstellende Fixierung sprach. Daher wurde für die weiteren Versuche auf die EDC- Fixierung zurückgegriffen. Anschließend wurden Methoden gesucht, das Quallenkollagen zu fibrillieren. Die Puffer TES und Tris sind bereits als Puffer zur Fibrillenbildung bekannt (Hoyer 2013, Yunoki 2004). Eine geeignete Konzentrajon von Tris musste allerdings noch ermikelt werden bzw. überprüs werden, ob es auch für Quallenkollagen geeignet wäre. Bekannt sind Arbeiten zur Fibrillenbildung bisher von Wirbeljerkollagen, an dem die Fibrillenbildung bei C durchgeführt wird, was für das relajv temperaturempfindliche Quallenkollagen ungeeignet ist. Offensichtlich ist die Fibrillenbildung in vitro bei den Temperaturen möglich und nöjg, wie sie auch im natürlichen Lebensraum des Organismus 68

78 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik ausreten. So konnte beispielsweise die Fibrillierung von Kollagenen Typ I aus dem Lachs, der in kalten Fließgewässern vorkommt, bei 4 C durchgeführt werden (Yunoki 2004, Hoyer 2012). Die Fibrillenbildung beim Quallenkollagen dagegen verlief bereits bei 25 C, was auch der Temperatur des Lebensraumes von Rh. esculentum entspricht (Dong 2008). Analysen von EM Bildern ergaben, dass dabei in vivo Fibrillen von etwa nm Durchmesser entstehen, was auf die relajv hohe Glykosilierung zurückzuführen ist (Miura 1985). Dieser Durchmesser ist auch von Fibrillen im Knorpel bekannt (Hulmes 2002, Kadler 2008), was das Quallenkollagen für die Knorpelzüchtung theorejsch besonders geeignet macht. Die Fibrillenbildung konnte in Lösungen indirekt quanjtajv und direkt über EM- Aufnahmen nachgewiesen werden. Jedoch blieb der letzte Beweis, dass die Fibrillen auch im Scaffold ausraten, noch aus. Lediglich durch AFM- Aufnahmen von Fibrillen neben dem Scaffold lässt sich darauf schließen, dass es sich bei den auf diese Weise hergestellten Scaffolds um Fibrillenscaffolds handelte. Die relajv dicken Fibrillen im Bereich von 60 nm (Fibrillen) bis 160 nm (Fasern) könnten aber womöglich für Chondrozyten schon unakrakjv sein, da die typische Knorpelfibrille im Chondron einen Durchmesser von ca. 5 nm aufweist (Eyre 2002, Wokon 1988). Über den Einfluss der Porengrößen auf die Zellen und über die Methoden, diese unterschiedlichen Porengrößen bewusst zu steuern, gibt es bereits zahlreiche Arbeiten. Schoof et al. haben ausführliche Untersuchungen über die Vorgänge beim Einfrieren unternommen. Kang et al. beschrieben bereits 1999 eine Möglichkeit, durch unterschiedliche Einfriertemperaturen die Porengröße und - struktur von Kollagenmatrices zu variieren. Bei - 20 C ergaben sich wabenarjge Poren im Bereich von 250 µm, wohingegen bei niedrigeren Temperaturen von - 80 C und C die Poren im Durchmesser kleiner wurden, dafür aber röhrenförmig. Bei C ergaben sich schließlich aneinander gelagerte Röhren mit einem Durchmesser von ca. 45 µm, die kaum durch Querstreben getrennt waren. Der Zweck der hier vorliegenden, verhältnismäßig oberflächlichen Untersuchungen war weniger, diese Untersuchungen an Quallenkollagen zu wiederholen, als vielmehr sich schnell auf eine Einfriermethode bzw. Porengröße festzulegen, die einerseits die Variajon der Steifigkeit noch zulässt und andererseits für die Besiedlung mit Chondrozyten von Vorteil war, d.h. hohe Zellzahl nach der Besiedlung sowie die Erhaltung des chondrozytären Phänotyps. Die Untersuchungen zur Quervernetzung zeigten, dass die physikalische Vernetzung mit UV- Licht zu keiner vollständigen Vernetzung führte, da selbst nach Bestrahlung mit einer sehr hohen Dosis noch immer lösliche Anteile im Scaffold nachweisbar waren. Dennoch zeigten sich diese Scaffolds in der Zellkultur selbst bei vierwöchiger Inkubajon als sehr haltbar (Daten nicht gezeigt). Allerdings wäre auch bei einer leichten Quervernetzung zu erwarten, dass die Schmelztemperatur steigen würde, offensichtlich wird ein solcher Ansjeg durch einen anderen Effekt überlagert, beispielsweise 69

79 3.2 Wie sind die EigenschaIen zu variieren? - Physik zunehmend durch Denaturierung verkürzte Moleküle. Dies würde zu einer Erniedrigung der Schmelztemperatur mit einer gleichzeijgen Quervernetzung dieser kurzen und langen Moleküle führen, was wiederum eine Erhöhung der Schmelztemperatur und einen Kompensajonseffekt zur Folge häke. Das thermische Verhalten von Kollagen wird durch viele Variablen beeinflusst wie z.b. der Wassergehalt des Moleküls (Luescher 1974, Sionkowska 2005), die Länge des Polymers, die Denaturierung, der Salzgehalt sowie der ph- Wert. Von daher lässt sich nicht ausreichend klären, wie dieser Effekt zustande kommt. Schließlich ist nicht auszuschließen, dass sich tatsächlich mehr Quervernetzungen ausbilden, dadurch die Moleküle bei gleicher Temperatur immer weniger aufschmelzen können, was die Enthalpie erniedrigt. Der eigentliche Schmelzpunkt könnte dann außerhalb des hier angewendeten Messbereiches liegen. In diesem Labor konnte jedoch mit den Aluminiumjegeln nicht bei höheren Temperaturen als ~ 90 C gemessen werden und bis dahin war kein weiterer Peak feststellbar (Daten nicht gezeigt). Für das Vorhaben, Matrices mit gezielten physikalischen EigenschaSen zu entwickeln, stellte sich demnach heraus, dass das Kollagen RhEsc in einer Konzentrajon von 20 mg/ml bei einer mäßigen Einfrierrate (ca. 0,1 bis 0,2 C/min) mit anschließender EDC- Fixierung die in der Steifigkeit variabelsten Matrices erbrachte, was für weiterführende Versuche zum Einfluss der Steifigkeit Voraussetzung war. 4 Untersuchungen in der Zellkultur Im Abschnik 3.1 wurde einerseits gezeigt, dass das Quallenkollagen leichte Unterschiede zum Wirbeljerkollagen aufweist, wie beispielsweise die Bildung dünnerer Fibrillen oder die geringe Schmelztemperatur. Andererseits wurde der Nachweis erbracht, dass Matrices aus Quallenkollagen, insbesondere RhEsc, in ihren physikalischen EigenschaSen wie Kollagenstruktur, Porengröße und Steifigkeit variabel herzustellen sind. Neben diesen physikalischen Effekten war auch erwartet worden, dass das Quallenkollagen selber einen Einfluss auf die Zellen haben würde. Zell- Matrix- Interakjonen sind wichjge Regulatoren zellulärer Funkjonen wie Matrixsynthese, Proliferajon und Dedifferenzierung. Daher sollten in diesem Abschnik die Einflüsse sowohl des Quallenkollagens als auch die der Matrices mit unterschiedlichen physikalischen und morphologischen EigenschaSen in Zellkulturexperimenten untersucht werden. Ziel war es, die Variante zu ermikeln, die am besten für die Knorpelregenerajon geeignet wäre. 70

80 4 Untersuchungen in der Zellkultur Möglichkeiten zur biomedizinischen Anwendung von diversen Quallenkollagenen wurden bereits erkannt (Hsieh 2005, Zhuang 2009 a, Zhuang 2009 b, Addad 2011, Calejo 2009, Nagai 1999). Auch eine dreidimensionale Matrix wurde bereits entwickelt und diese zeigte, mit verschiedenen Zelltypen besiedelt, ähnliche EigenschaSen wie ein Gegenstück aus Wirbeljerkollagen (Song 2006). Arbeiten mit Chondrozyten zur Knorpelregenerajon fehlten jedoch bisher gänzlich. Quallen sind von ihrem Körperbau sehr einfache Organismen mit nur einer geringen Gewebeorganisajon und ihre Kollagene entwickelten sich lange vor denen der Wirbeljere (Exposito 2008). Daher war davon auszugehen, dass die Bindung von Wirbeljerzellen an Quallenkollagen von der an Wirbeljerkollagen abweichen dürse. Z unächst sollte ein Spreading Assay einen Überblick über die AdhäsionseigenschaSen porciner Chondrozyten auf Quallenkollagen im Vergleich zu Wirbeljerkollagenen in 2D verschaffen. In einem weiteren Schrik wurden dann 3D Matrices eines Typs aus Quallenkollagen RHEsc mit solchen aus humanem Plazentakollagen (HPC) und den käuflichen Matrices OpjMaix (Matricel) aus porcinem Kollagen I/III in der Zellkultur mit primären Chondrozyten verglichen. Letztere, gedacht für die Anwendung in der Zellkultur, diente als Vertreterin für andere 3D Matrices aus porcinem Kollagen, die bereits in der MACI Anwendung finden. Die Matrices aus HPC waren auf die gleiche Weise hergestellt worden wie diejenigen aus RhEsc, wodurch geklärt werden sollte, ob etwaige Unterschiede zwischen Opjmaix und RhEsc nicht auf die verschiedenen Herstellungsmethoden zurückzuführen wären. Chondrozyten können sensijv die genaue supramolekulare Organisajon ihrer Umgebung wahrnehmen, d.h. sie können zwischen fibrillärem und molekularem Kollagen unterscheiden (Farjanel 2001). Auch die Porengröße wird über die Posijonen der Rezeptoren registriert, über die die Zellen Kontakt zur EZM aufnehmen ( Reilly 2010). In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Porengröße nur am Rande untersucht, d.h. zwei Scaffoldtypen mit unterschiedlichen Poren wurden in der Zellkultur getestet. Viel ist bereits über den Einfluss der Steifigkeit auf den Phänotyp verschiedenster Zelltypen in 2D und 3D bekannt (Engler 2006, Schuh 2010, Schuh 2012 a, Schuh 2012 b), wobei der dahinter stehende Mechanismus noch nicht ganz aufgeklärt ist. Sicher ist, dass die Zellen über die mit dem Akjnskelek in Verbindung stehenden Integrinen an die extrazelluläre Matrix binden. Als wichjge Vertreter dieser Gruppe konnten bereits α5β1 (Friedland 2009) für Fibronekjn sowie die Einheiten α1, β1 und β3 bei der Bindung an Kollagen idenjfiziert werden. Über ihr Akjn- Myosin- Skelek ziehen die Zellen an der EZM und erspüren mechanische Antworten darauf an der Zell- Matrix- Grenzfläche, was daraunin eine Änderung im Expressionsmuster der Zelle bewirkt (Sanz- Ramos 2012, Buxboim 2010). Für Chondrozyten wurde bereits in verschiedenen Modellen in 2D gezeigt, dass sie besser ihren chondrozytären Phänotyp bei vergleichsweise geringen Steifigkeiten von 71

81 4 Untersuchungen in der Zellkultur 4 kpa (Schuh 2010) bzw. 12,1 kpa (Genes 2004) erhalten. In 3D erhielten Chondrozyten in mit RGD angereicherten Agarosegelen unabhängig der Steifigkeit ihren Phänotyp (Schuh 2012 b) und auch eine Redifferenzierung war von dieser unabhängig (Schuh 2012 a). Die Steifigkeit wurde in diesem System über die Alginat- Konzentrajon variiert, was Veränderungen auch in anderen physikalischen EigenschaSen mit sich bringen kann (siehe Kapitel 3.2). Dieses Problem wurde in der vorliegenden Arbeit umgangen, indem Kollagen mit verschiedenen Quervernetzungsgraden verwendet wurde. Außerdem stellte dies ein System dar, dass der in vivo- Situajon wesentlich näher kam als 2D. Daten aus Versuchen in 2D sind nicht ohne weiteres in 3D übertragbar (Reilly 2010, Cukierman 2001). Daher war es notwendig, die geeignete Steifigkeit für Chondrozyten in 3D zu ermikeln, was eine Matrix mit einem breiten Steifigkeitsspektrum erforderte. Dies war offensichtlich in noch keiner Arbeit bisher gelungen, ohne dabei andere Faktoren zu verändern (siehe Tabelle 9). Um den Einfluss der physikalischen Unterschiede zu untersuchen und daraus das opjmale RhEsc Scaffold zu entwickeln, wurden im nächsten Versuch RhEsc Matrices mit unterschiedlicher Porengröße, aus molekularem und fibrillärem Kollagen hergestellte Schwämmchen sowie molekulare Schwämmchen mit unterschiedlichen Steifigkeiten untersucht. Die Steifigkeiten wurden hier entsprechend denen der Mikroumwelt mesenchymaler Gewebezellen gewählt, d.h. ~ 3 kpa (orienjert an Schuh 2010, entspricht etwa Fek), ~ 12 kpa (Muskel) und ~ 40 kpa (Knochen, siehe Abb. 40). Alle Versuche wurden mit primären Chondrozyten durchgeführt, um eine direkte Reakjon der ausgebildeten Zellen deutlich machen zu können. In der Anwendung bei der MACI werden hingegen aus gesundem Knorpel wenige Zellen entnommen und diese im Monolayer vermehrt, wobei eine Dedifferenzierung zu fibroblastoiden Zellen mit einem hohen Typ I Anteil und einem ausgeprägten Akjnskelek ausrik (von der Mark 1977, Grundmann 1980). Um also eine umfassende Erprobung der Matrix aus Quallenkollagen zu erreichen, sollte schließlich noch ihr Potenjal, dedifferenzierte Chondrozyten zur Redifferenzierung anzuregen, untersucht werden. Dies könnte dann auch einen Hinweis auf die Möglichkeit geben, schnell proliferierende mesenchymale Stammzellen mit Hilfe dieser Matrix zu Chondrozyten zu differenzieren und somit eine neue Anwendungsmöglichkeit der Matrix zu eröffnen. Alle Zellkulturversuche sollten zeigen, wie die Chondrozyten auf die verschiedenen 3D Matrixtypen und - formen reagieren. Ziel war es, eine Matrix zu generieren, die bestmöglich den Erhalt des chondrozytären Phänotyps unterstützte. Dieser wurde besjmmt, indem die Synthese von Kollagen I und II auf mrna- und Proteinebene analysiert und die Proliferajon mikels DNA- Gehalt ermikelt wurde. Histologische Untersuchungen dienten zur Untermauerung der quanjtajven Analysen. 72

82 4.1 Material und Methoden Zellkultur und Analyse allgemein 4.1 Material und Methoden Zellkultur und Analyse allgemein Zellkultur Für die in vitro Versuche wurden frisch isolierte porcine Chondrozyten aus dem Knie von 3-6 Monate alten Schweinen verwendet. Das Material wurde über einen Schlachtereibetrieb in Bad Oldesloe bezogen und war in der Regel vom gleichen Tag, höchstens jedoch vom Vortag. Das Kniegelenk war in der Regel unversehrt. Verletzte Knie wurden nicht verwendet oder die Verletzung wurde großzügig umgangen. Alle Arbeitsschrike erfolgten unter den üblichen sterilen Bedingungen. Zur Isolierung des Knorpels wurden die Knie zunächst mit etwas 70 % Ethanol desinfiziert und unter der Sterilbank wurde dann der Ober- vom Unterschenkel getrennt. Der Knorpel wurde dann von den ventralen und dorsalen Kondylen des Oberschenkels mit einem Skalpell abgehobelt, wobei darauf geachtet wurde, die Randbereiche großzügig zu umgehen, um eine Kontaminajon mit fremden Zellen (z.b. Fibroblasten) zu vermeiden. Die weitere Präparajon erfolgte wie in Schuh et al. (2010) beschrieben. Kurz zusammengefasst wurde der Knorpel über Nacht in RPMI- Medium mit Hyaluronidase, Kollagenase II (beide Worthington, Lakewood, CO) und Kollagenase P (Roche, Deutschland) und Penicillin/Streptomycin- Zusatz bei 5 % CO2 und 37 C in einer Wheaton- Flasche unter Rühren verdaut. Die Suspension wurde am nächsten Tag mikroskopisch auf bakterielle Kontaminajonen hin untersucht, durch ein Zellsieb gefiltert, und anschließend mehrmals mit PBS gewaschen und zentrifugiert. Das Zellpellet wurde schließlich in einer geringen Menge Medium aufgenommen. Die Zellvitalität wurde mit Trypanblau (Biochrom) besjmmt und die Zellzahl mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer ermikelt. DarauNin wurde die Zellsuspension auf eine Konzentrajon von 16,67*10 6 Zellen ml- 1 verdünnt und davon wurden je 60 µl zur Besiedlung einer Matrix verwendet, um eine finale Zellzahl von 106 Zellen pro Schwämmchen zu erhalten. Die verwendete Zellzahl war zuvor durch Versuche ermikelt worden, um einerseits maximal viele Zellen pro Matrix zu erhalten und andererseits keinen Filtereffekt bei zu vielen Zellen zu haben, wodurch die Mehrzahl der Zellen am äußersten Rand der Matrix gesiedelt häken. Die Besiedlung von fixierten, in PBS getränkten Matrices erfolgte, indem die Matrices zunächst auf sterilen Wundauflagen (Fuhrmann, Deutschland) ausgedrückt wurden und dann in 96er Mikrojterplaken gegeben wurden, in die bereits die 60 µl Zellsuspension vorgelegt war. Da 60 µl deutlich unter dem rechnerischen Volumen von ca. 85 µl der Matrix lag, nahmen die Matrices quasi die gesamte Zellsuspension auf. Die Matrices wurden nun sofort mit 200 µl RPMI- Medium überschichtet und für 2-4 h inkubiert. Schließlich wurden sie jeweils in eine 24er Mikrojterplake umgesetzt, die zuvor mit 2 % w/v Agarose (Gibco- BRL) in PBS beschichtet worden war, um eine Co- Kultur auf dem Gefäßboden zu vermeiden. Die Kuljvierung 73

83 4.1 Material und Methoden Zellkultur und Analyse allgemein erfolgte in wie in Schuh et al. (2010) beschriebenem RPMI- Medium mit einem Zusatz von 35 µm 2- Phospho- L- Ascorbinsäure Trinatriumsalz (Sigma) für 28 Tage bei 5 % CO2 und 37 C; das Medium wurde alle 2-3 Tage gewechselt. Die entnommenen Proben wurden kurz in PBS gewaschen und sofort in flüssigem Sjckstoff, zur Lagerung dann bei - 20 C eingefroren. Für histologische Untersuchungen wurden sie in CryoMold Einbelormen mit Tissue Tek (Sakura, Torrance, USA) eingebeket und bei - 20 C eingefroren. Überzählige Zellen wurden noch am Tag der Isolierung eingefroren (Schuh 2010) Homogenisieren der besiedelten Scaffolds Zur RNA- Isolajon, DNA- und Proteinanalysen wurden die Schwämmchen in Precellys Röhrchen mit 2,8 mm Kugeln in einem Precellys 24 Homogenisator (alles Peqlab) für 3*15 s bei 5000 rpm homogenisiert und anschließend sofort auf Eis gegeben. Die dazu verwendeten Lösungen und Volumina werden bei den entsprechenden Analyseverfahren beschrieben mrna Isolierung und RT- PCR mrna wurde aus den Scaffolds mit einem NucleoSpin RNA II - Kit (Macherey & Nagel, Deutschland) isoliert. Die Homogenisierung der Matrices erfolgte in 353,5 µl des ersten Puffers RA 1 mit β- Mercaptoethanol (Sigma) und das Lysat wurde dann nach Herstellerangaben weiter verarbeitet. Die RNA- Konzentrajon wurde mit einem NanoDrop 2000c UV- vis- Spektrophotometer (Thermo Scienjfic) besjmmt. Wenn nöjg, wurde die RNA noch mit 5 M Ammonium Acetat (Ambion) nach Herstellerprotokoll gefällt und das Pellet für 10 min bei 37 C getrocknet, um störendes Ethanol restlos zu eniernen. In diesem Fall wurde das Pellet in 12 µl RNAse freiem Wasser aufgenommen. Jeweils 500 ng RNA wurden in cdna umgeschrieben (Revert Aid TM H Minus First Strand cdna Synthesis Kit, Fermentas) und die RT- PCR wurde dann mit Maxima Probe/ROX qpcr Master Mix - Kit (Fermentas) in einem Thermocycler (icycler, Bio- Rad) durchgeführt. Primersequenzen und Sonden sind in Tabelle 10 aufgeführt. Die Expression von mrna col I bzw. II wird einerseits durch die absoluten Werte als Verhältnis von mrna col / mrna GAPDH dargestellt, um die Zu- oder Abnahme der Kollagentypen verfolgen zu können. Da aber eine klare Aussage über den Differenzierungszustand von Chondrozyten am besten über den Anteil des für hyalinen Knorpel so wichjgen Kollagen Typ II zu treffen ist (Galois 2006), wird auch der Anteil von Kollagen Typ II als mrna col I / (mrna col I + mrna col II) angegeben. Für den 74

84 4.1 Material und Methoden Zellkultur und Analyse allgemein Startwert T0 wurden drei Aliquots von jeweils 10 6 Zellen von der Zellsuspension genommen, mit der dann auch die Besiedlung staland. Name Hersteller Typ sgapdh F TIB Molbio Primer 5'-CACCATCTTCCAGGAGCGAG sgapdh R TIB Molbio Primer 5'-GGCCCCACCCTTCAAGT sgapdh TM TIB Molbio Sonde 5'- 6FAM-TGCTGGTGCTACGTATGTTGTGGAGTCC--BBQ COL1A1 S TIB Molbio Primer 5'-GTGATCTGCGACGAAATCAAGAA COL1A1 A TIB Molbio Primer 5'-GGGTGACACCTCGCCTTC COL1A1 TM TIB Molbio Sonde 5'-6AFM-TGTCCCAGCGCCAGAGTCCCT--BBQ 51_COL_FW1 Microsynth Primer 5'-GGGCAACGACGGTCAACCAG 51_COL_REV1 Microsynth Primer 5'-CTTGGCACCGGGAGCACCAG 51_COL_PROBE1 Microsynth Sonde 5'FAM-CCAGGACCGCCAGCAGGACCCACG-BHQ1 Tabelle 10: Übersicht über die verwendeten Primer und Sonden DNA- Konzentra[on Über die DNA- Konzentrajon wurde indirekt die Proliferajon besjmmt. Hierzu wurden die Schwämmchen in 500 µl einer 10 % Triton- X 100 in PBS homogenisiert, für 5 min bei g bei 6 C abzentrifugiert und 10 µl des Überstands dann für die Analyse verwendet (Quant- it PicoGreen dsdna Assay Kit, Invitrogen). Dazu wurden schwarze 96er Mikrojterplaken (Nunc, Dänemark) verwendet und das Auslesen erfolgte auf einem Mithras 940 Plate Reader (Berthold Technologies) bei 520 nm. Der beigefügte DNA- Standard wurde für die Standardkurve verwendet. Jeweils 2-3 Proben aus dem Überstand eines Schwämmchens wurden analysiert und der Mikelwert daraus als der Wert des eigentlichen Replikates verwendet. Bei der Isolierung der DNA aus den Matrices konnte nie alles Material gewonnen werden, weswegen eine Umrechnung in die Zellzahl aufgrund der Annahme, eine diploide Zelle enthält 7,7 pg DNA (Kim 1988), nicht sinnvoll war. Daher ist hier die Zu- oder Abnahme der DNA- Konzentrajon im Vergleich zum Startzeitpunkt indirekt als Proliferajon bzw. Apoptose zu betrachten. Dabei war es nicht möglich, potenjelle Überlagerungen von Proliferajon und Apoptose verschiedener Zellkohorten innerhalb einer Probe zu unterscheiden Proteinanalysen, Slotblot Die tatsächliche Expression von Kollagen Typ I und II wurde immunologisch über einen Slotblot überprüs. Alle Arbeiten wurden bei 4-6 C durchgeführt. Jedes Schwämmchen wurde wie 75

85 4.1 Material und Methoden Zellkultur und Analyse allgemein beschrieben in 250 µl einer 0,1 %igen Pepsinlösung (porcine gastric mucosa, 2500 U/mg, Roche) in HAc ph 2,8 homogenisiert und über Nacht bei 4 C auf einem Rükler die nicht- kollagenen Proteine verdaut. Der Verdau wurde dann mit einem Tropfen 1 M Tris- Base ph 7 gestoppt, die Suspension in ein neues Röhrchen überführt und die Reste mit 100 µl zusätzlichem Wasser nachgespült und dazugefügt. Nach einer Zentrifugajon bei g für 20 min wurde der Überstand in ein neues Röhrchen überführt und das Volumen besjmmt. Das Kollagen wurde nun mit einer Endkonzentrajon von 40 % Ethanol für wenigstens 1 h bei - 20 C gefällt. Nach einer erneuten Zentrifugajon wurden die Überstände verworfen und die Pellets durch Lyophilisajon getrocknet. Anschließend wurden sie in einem entsprechenden Volumen Wasser gelöst und bei - 20 C gelagert. Als Standards wurden bovines Kollagen Typ I und II (Universität Lübeck) verwendet, deren Konzentrajon zuvor über die Aminosäureanalyse besjmmt worden war. Proben und Standards wurden mit Hilfe eines Minifold II Slot- Blot Array Systems (Schleicher & Schuell) auf eine Nitrozellulosemembran (BioRad) aufgetragen. Diese wurde dann getrocknet, für 2 h bei RT in Blocklösung 5 % Milchpulver (Fluka) in TBS- T (10 mm Tris, 150 mm NaCl, 0,05 % Triton- X- 100, ph 8) geblockt, im Erstanjkörper (anj Kollagen I bzw. II) inkubiert, mehrmals in TBS- T gewaschen, mit dem Zweitanjkörper inkubiert und dann erneut gewaschen. Die Anjkörper wurden jeweils in Blocklösung verdünnt und die Inkubajon erfolgte entweder für 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 C. Bei den Erstanjkörpern handelte es sich um anj typ I ab90395 (monoklonal, Maus, Abcam) in einer Verdünnung von 1:250 bzw. II- II- 6B3 (Developmental Studies Hybridoma Bank, Universität Iowa) in einer 1:1000 Verdünnung; bei dem Zweitanjkörper um Polyclonal Rabbit Anj- Mouse (Dako, Dänemark). Jeweils 0,13 ml/cm wurden von den Anjkörperlösungen verwendet. Zur Färbung wurde die Membran dann für 10 min in AP- Puffer (100 mm Tris, 100 mm NaCl, 5 mm MgCl2, ph 9,5) äquilibriert und in 0,2 ml/cm2 mit einem BCIP/NBT- Gemisch gefärbt. Dafür wurde eine 1:1 Lösung einer 48 mg/ml 5- bromo- 4- chloro- 3- indolyl phosphate (BCIP) in 100 % Dimethylformamid (DMF) und einer 75 mg/ml nitro blue tetrazolium chloride (NBT, beide Roth) in 70 % DMF 1:125 fach in AP- Puffer verdünnt. Schließlich wurden die Membranen mit Wasser gewaschen und gescannt. Die densitometrische Auswertung erfolgte mit ImageJ 1.45s (Najonal Insjtutes of Health, USA). Da unterschiedlich viele Mengen der Proben verwendet wurden (allerdings nicht innerhalb der zwei Nachweise Typ I bzw. II), wird das Ergebnis jeweils als Anteil von Kollagen Typ II am Gesamtkollagen I + II (%) dargestellt. Dieser Nachweis ist wegen des großen Aufwandes nicht mit vielen Replikaten durchführbar, weswegen er nur als semi- quanjtajver Nachweis gesehen werden kann. Hinzu kommt, dass wegen der eher geringen und daher kaum nachweisbaren Mengen an Protein zu Beginn des 76

86 4.1 Material und Methoden Zellkultur und Analyse allgemein Versuches (Tag 1 und 7) nur die Analysen der Proben von Tag 28 stalanden. Die gebildeten Mengen Kollagen sind daher kumulajv Histologie Die eingebeketen Schwämmchen wurden in einem Leica CM3050 Cryotom bei - 22 bis - 23 C in 10 µm dicke Scheibchen geschniken, auf einem Objekkräger platziert und über Nacht an der LuS getrocknet. Die Schnike erfolgten verjkal möglichst in der Mike des Schwämmchens. Die Alcian- Färbung wurde bei ph 2,5 nach Weindl (2005) durchgeführt, wodurch sich alle und nicht nur die stark ssulfajsierten GAGs und Proteoglykane blau bis grün anfärben lassen. Eine Abweichung vom Protokoll stellte die Verwendung von 0,5 %iger stak 3 %iger HAc dar. Alle Reagenzien waren von Roth; Entellan zum Eindecken der Präparate von Merck. Mikels Kernechtrot wurden die Zellkerne angefärbt. Die Immunfärbungen für Kollagen Typ I und II wurden nach Schuh et al. (2010) durchgeführt. Die Erstanjkörper waren wie beim Slotblot anj Typ I ab90395 bzw. II- II- 6B3. Die Anjkörper wurden 1:50 verdünnt. Die Zellkerne wurden mit 4',6- Diamidino- 2- Phenylindol (DAPI, Sigma) nach dem gleichen Protokoll gegengefärbt. Alle Proben wurden mit einem Axioplan 2 Mikroskop (ZEISS, Deutschland) mit der zugehörigen SoSware Axiovision analysiert. 4.2 Verhalten von Chondrozyten auf allenkollagen im Vergleich zu Wirbeltierkollagen in 2D und 3D Material und Methoden Spreading Assay Die Konzentrajonen von den Quallenkollagenen RhEsc, RhHisp, RhNom und Aurelia und HPC (in 0,05% HAc gelöst) sowie von Kollagen Typ I (porcin, Matrix Bioscience GmbH) und Typ II (bovin, Universität Lübeck) wurden durch Aminosäureanalyse besjmmt, wobei der geringere Hyp- Gehalt der Quallenkollagene berücksichjgt wurde. Dann wurden die Lösungen mit einer Konzentrajon von 30 µg/ml in jedes Well einer 96er Mikrojterplake (TPP Techno Plasjc Products AG, Schweiz) gegeben und für zwei Tage unter einer Bench getrocknet; die endgüljge Beschichtung war demnach 4,5 µg pro 77

87 4.2 Verhalten von Chondrozyten auf Quallenkollagen im Vergleich zu Wirbel[erkollagen in 2D und 3D. cm². Um eine Denaturierung der Quallenkollagene während der Zellkultur zu vermeiden, wurden alle Beschichtungen mit 0,5 % EDC wie in Kapitel beschrieben quervernetzt und schließlich wurden unbesetzte Bereiche mit 1 % BSA (Frakjon V, Roth) geblockt. Eingefrorene Chondrozyten wurden aufgetaut, für eine Nacht in einer Dichte von 13x10 6 Zellen pro T75 Flasche in RPMI- Medium ohne Ascorbat kuljviert, trypsiniert, zentrifugiert und das Zellpellet wurde dann in einem angemessenen Volumen RPMI- Medium aufgenommen. Jedes Well wurde dann mit Zellen besiedelt und die Proben für 24 h bei 37 C, 5 % CO2 kuljviert. Die Verteilung der unterschiedlichen Phänotypen wurde auf mikroskopischen Aufnahmen besjmmt, wofür zwei Bilder von drei Replikaten mit einem Axiovert 40 C Mikroskop (Zeiss) nach 24 h aufgenommen wurden. Die manuelle Auszählung wurde erleichtert durch das Programm Image J 1.45s (Najonal Insjtutes of Health, USA). Die Unterscheidung erfolgte in flache und nicht flache Zellen, wobei letztere die runden Zellen sowie die Grenzfälle beinhaltete (Schlegel 2008) REM Die Aufnahmen für die Rasterelektronenmikroskopie der Scaffolds wurden freundlicherweise vom Insjtut für Anatomie der Uni Lübeck gemacht. Dazu wurden die Proben auf Aluminiumträger gegeben und mit Plajn beschichtet. Das Mikroskopieren erfolgte in einem SEM 505 (Philips, Niederlande). Diese Bilder wurden auch herangezogen, um eine grobe Einschätzung über die Porengröße durch Vermessung mit Axio Vision, Version (Zeiss) vorzunehmen Besiedlung der Scaffolds Die Scaffolds aus RhEsc und HPC wurden wie in der allgemeinen Beschreibung mit 1x10 6 Zellen durch Eintunken des feuchten Scaffolds in die Suspension besiedelt. Opjmaix Scaffolds wurden nach Herstellerangaben durch AuSropfen der Zellsuspension auf die trockenen Schwämmchen besiedelt Stajsjk Alle Werte wurden als Mikelwert ± Standardabweichung angegeben. Graphen wurden als Scaker- Plots dargestellt oder, wenn nöjg, wegen der besseren Übersichtlichkeit als Mikelwert ± Standardabweichung. Stajsjsche Analysen wurden mit dem Programm GraphPad Prism Vers. 5 (GraphPad SoSware Inc.) 78

88 4.2 Verhalten von Chondrozyten auf Quallenkollagen im Vergleich zu Wirbel[erkollagen in 2D und 3D. durchgeführt. Die verwendeten Tests waren Kruskal Wallis Test mit anschließendem Dunn's Muljple Comparison Test bzw. ungepaarter T- Test. * p<0,05; **p<0,01; ***p<0, Ergebnisse EigenschaSen der Kollagenmatrices Messungen der Steifigkeiten zeigten, dass alle Schwämmchentypen eine ähnliche Steifigkeit im Bereich von 10,4 ± 0,6 bis 13,4 ± 2,2 kpa aufwiesen. Auch eine ausreichende Quervernetzung trat auf, wie durch die Zunahme der Schmelztemperaturen auf über 50 C gezeigt werden konnte (siehe Tabelle 11). RhEsc und HPC Schwämmchen haken die Abmessungen von 3 mm Höhe und 6 mm Durchmesser sowie einen Porenabmessungen von ca. 190 x 90 µm beziehungsweise 200 x 70 µm in Name Maße Kollagen Konzentrajon Steifigkeit Schmelzpunkt Porengröße[µ des [kpa] [ C] m] 10,4 ± 0,6 68,5 ± 0,7 200 x 70 ** 12,3 ± 3,7 55,5 ± 0,4 190 x 90 ** 13,4 ± 2,2 51,6 ± 0,8 90 (Breite) Ausgangsmateri als HPC 3 x 6 mm Typ I/III mit Resten Typ V, 20 mg/ml human RhEsc 3 x 6 mm Typ II ähnlich, RhEsc 20 mg/ml Opjmaix 3 x 5 mm Typ I mit Elasjn- Resten, 15 mg/ml* porcin* Tabelle 11: Zusammenstellung der allgemeinen und physikalischen EigenschaIen der Scaffolds. * Daten von Saxena et al ** Länge x Breite, die Vermessung von den REM- Bildern war schwierig, weswegen keine sta[s[sche Auswertung erfolgte. Länge und Breite. Die Poren waren wabenförmig und mehr oder weniger länglich. Im Vergleich dazu waren Opjmaix- Schwämmchen mit einer Abmessung von 3 mm Höhe und 5 mm Durchmesser etwas kleiner und sie wiesen eine Porengröße von etwa 90 µm in der Breite auf. Dabei fiel die tunnelarjge Struktur mit einer Länge von einem Vielfachen des Durchmessers auf (siehe Abb. 28). 79

89 4.2 Verhalten von Chondrozyten auf Quallenkollagen im Vergleich zu Wirbel[erkollagen in 2D und 3D. Abbildung 28: R EM- Aufnahmen der Schwämmchen. (A) RhEsc Matrix, (B) H PC Matrix,(C) Op[maix; die Pfeile geben die Richtung der Kanäle an. Maßstabsbalken 100 µm Spreading Assay Nach 24 h Besiedlung war kein signifikanter Unterschied in der Menge der anhasenden Zellen pro Gesichtsfeld feststellbar (Abb. 29 A). Signifikante Unterschiede waren jedoch im Anteil der nicht- flachen Zellen erkennbar (Abb. 29 B). Auf allen Quallenkollagenen waren 80,1 ± 7 bis 96,2 ± 1,4 % der Zellen nicht abgeflacht, ähnlich wie auf WT Kollagen II mit 93,2 ± 1,6 %. Dagegen waren auf HPC und WT Kollagen I mit 38,7 ± 12,1 % bzw. 53,8 ± 17,5 % deutlich weniger nicht- flache Zellen zu finden. Die Unterschiede auf den Quallenkollagenen waren nicht signifikant. Die Daten weisen darauf hin, dass pchs Unterschiede in der Struktur dieser Kollagene durch AnhaSung ihrer Rezeptoren erkannten. 80

90 4.2 Verhalten von Chondrozyten auf Quallenkollagen im Vergleich zu Wirbel[erkollagen in 2D und 3D. Abbildung 29: Ergebnisse des Spreading Assays mit pchs auf unterschiedlichen Substraten nach 24 h. A: flache und nicht- flache Zellen pro Gesichtsfeld (d.h. Foto). Die Summen der anhaienden Zellen waren nicht signifikant unterschiedlich, n=6. B: Anteil der nicht- flachen Zellen pro Gesichtsfeld (d.h. Foto). C: Ausschni\e aus den Fotos aus der Mikroskopie mit Beispielen für flache (Doppelpfeil) und runde Zellen (einfacher Pfeil). Maßstab = 64 µm. 81

91 4.2 Verhalten von Chondrozyten auf Quallenkollagen im Vergleich zu Wirbel[erkollagen in 2D und 3D Zellkultur in 3D RhEsc Matrices wurden gegen HPC Matrices und Opjmaix in der Zellkultur getestet, um deren Eignung für das Knorpel- Tissue- Engineering zu testen. Während einer 28 tägigen Inkubajon wurde bei keinem der getesteten Typen eine Schrumpfung festgestellt. Abbildung 30: Auswirkung der Kul[vierung der porcinen Chondrozyten auf verschiedenen Matrices auf mrna- Expression, DNA- Gehalt und Proteinsynthese während einer Versuchsdauer von 28 Tagen. (A) RT- PCR- Analyse der Kollagen I und I I- Expression, dargestellt als Anteil Kollagen I I an der Summe von I und I I. n=4. (B) D NA- Gehalt pro mm³. n=3-4 (C) Auswertung des Slotblots der Proteine nach 28 Tagen Zellkultur. Die Punkte repräsen[eren die Messungen von zwei Scaffolds. (D) Abbildung des Slotblots. Innerhalb der Proben, aber nicht zwischen Typ I und II, wurden unterschiedliche Mengen Probe aufgetragen. Die Ergebnisse der mrna Analyse wurden als Anteil Typ II an der Summe der beiden Kollagene Typ I und II in % ausgedrückt. Frisch isolierte Zellen zum Zeitpunkt der Besiedlung exprimierten 98,8 ± 2,1 % Typ II Kollagen (Abb. 30 A). Bis zum ersten Tag war ein Rückgang auf etwa 80 % in HPC und dagegen in RHEsc und Opjmaix fast kein Rückgang des Typ II Anteils zu verzeichnen. An Tag 7 und 14 exprimierten die Zellen in RhEsc deutlich mehr Typ II (~77 bis 75 %) als die Vergleichsproben HPC (~38-39 %) und Opjmaix (~25-53 %). An Tag 28 schließlich exprimierten die Zellen auf RhEsc noch immer ~54 % Kollagen Typ II und die Zellen auf HPC etwas weniger (~ 48 %). Opjmaix mit ~11 % führte zu einer deutlich geringeren Expression Typ II der Zellen. Die Proteinsynthese wurde mikels Slotblot nach 28 Tagen analysiert und auch hier wird das Ergebnis als Anteil Kollagen II an der Summe der Kollagene I und II angegeben (Abb. 30 C und D). Keine der 82

92 4.2 Verhalten von Chondrozyten auf Quallenkollagen im Vergleich zu Wirbel[erkollagen in 2D und 3D. unbesiedelten Matrices gab ein posijves Signal (Daten nicht gezeigt). HPC (~ 98 %) und RhEsc (~ 94 %) zeigten einen deutlich höheren Anteil an gebildetem Kollagen II als Opjmaix (~ 75 %). Diese Ergebnisse reflekjeren die Ergebnisse der RT- PCR für RhEsc und Opjmaix, jedoch nicht für die HPC Matrix, die über den Versuchszeitraum einen relajv geringen Anteil mrna Kollagen II aufwies, aber einen sehr hohen Anteil in der Proteinanalyse zeigte. Die Proliferajon wurde über den DNA- Gehalt untersucht (Abb. 30 B). Die Besiedlung auf Opjmaix und RhEsc erwies sich als ähnlich effekjv, wohingegen HPC Matrices etwas mehr Zellen als RhEsc aufnahmen. In RhEsc und HPC war keine deutliche Änderung im DNA- Gehalt erkennbar, in Opjmaix war ein Ansjeg von ~9 bis ~15 ng/cm3 an Tag 1 bis 7 und bis zu ~25 ng/cm3 an Tag 28 zu verzeichnen, was einer hohen Proliferajon entspricht. Alcian- und Kernechtrot- Färbung zeigte eine homologe Verteilung der Zellen nach 28 Tagen in den Scaffolds, wobei in RhEsc und HPC Matrices mehr Klumpen von neu synthejsierten GAGs zu erkennen waren. In allen Scaffoldtypen war jedoch das meiste Material an den Rändern zu finden (Abb. 31). In der Immunhistologie wiesen die Matrices HPC und Opjmaix eine leichte Färbung der Matrix für Typ I auf, die sich aber durch die Struktur von neu synthejsiertem Material unterscheiden ließ. Keine der Matrices sprach auf die Färbung von Kollagen II an. Nach 28 Tagen wiesen die Proben RhEsc deutlich mehr Kollagen II als I auf, ebenso die Matrix HPC. Dagegen war auf Opjmaix deutlich mehr Kollagen I als II zu erkennen. Dieser Eindruck bestäjgt das Bild der Proteinanalyse. Abbildung 31: Alcian- Färbung der Proben nach 28 Tagen Zellkultur. In allen Matrices war die neu synthe[sierte Matrix recht homogen verteilt, wobei das gros an den Randbereichen zu finden war. Maßstabsbalken = 100 µm 83

93 4.2 Verhalten von Chondrozyten auf Quallenkollagen im Vergleich zu Wirbel[erkollagen in 2D und 3D. Abbildung 32: Immunhistologische Färbungen von Kollagen Typ I bzw. I I der Proben nach 1 und 28 Tagen in Zellkultur. H PC und Op[maix wiesen eine leichte Färbung der Matrix für Typ I auf, die sich aber durch die Struktur von neu synthe[siertem Material unterscheiden ließ. Keine der Matrices sprach auf die Färbung von Kollagen II an. Nach 28 Tagen wiesen die Proben RhEsc deutlich mehr Kollagen II als I auf, ebenso die Matrix HPC. Dagegen war auf Op[maix deutlich mehr Kollagen I als I I zu erkennen. Maßstabsbalken = 50 µm. 84

94 4.2 Verhalten von Chondrozyten auf Quallenkollagen im Vergleich zu Wirbel[erkollagen in 2D und 3D Diskussion Hier wurden einerseits das Adhäsionsverhalten der porcinen Chondrozyten auf den vier Quallenkollagenen im Vergleich zu Wirbeljerkollagen untersucht. Außerdem wurde das Potenjal von 3D Matrices aus einem Quallenkollagen (RhEsc) im Vergleich zu HPC- Matrices und Opjmaix zum Erhalt des chondrozytären Phänotyps untersucht, mit dem Ziel, hyalin- ähnliche Strukturen wie im natürlichen Knorpel zu erhalten. Im Spreading Assay entwickelten pchs auf Quallenkollagenen, HPC, WT Kollagen I und II nach 24 h signifikant unterschiedliche Phänotypen, wobei der chondrozytäre Phänotyp am besten auf den Quallenkollagenen und WT Kollagen Typ II erhalten wurde. Es ist anzunehmen, dass dieser Effekt auf dem Mechanismus begründet ist, mit dem die Zellen an das Kollagen binden. Differenzierte Chondrozyten treten kugelförmig bis eiförmig auf (Schlegel 2008, Benya 1982, Nehrer 1997) mit einer hohen Expression von Kollagen Typ II, einer geringen Expression Typ I (Brodkin 2004, Schuh 2010) und einer geringen Proliferajonsrate (Nehrer 1997, Freyria 2009), da Zellmorphologie und die Organisajon des Akjnskeleks den Eintrik in den Zellzyklus fördern (Iwig 1995, Assoian 1997 a und b). Im Gegensatz dazu wird das Abflachen von Chondrozyten von einer höheren Organisajon des Akjnskeleks (Glowacki 1983, Benya 1988, Brown 1988, Mallein- Gerin 1991) begleitet, was in einer Dedifferenzierung der Zellen resuljert. Diese Zellantworten werden durch den Typ des Rezeptors gesteuert, mit dem die Zellen an die EZM binden. Chondrozyten binden an fibrilläre Vertebratenkollagene über eine Vielzahl von Rezeptoren, hauptsächlich Integrine, DDR2 und Syndecane (Leijnger 2007, Couchman 2010). Die transmembranen Integrine verbinden die kontrakjlen Akjnfilamente mit der EZM (Woods 2007). Nur die Integrine α1β1, α2β1, α10β1 und α11β1 binden an najve fibrilläre Kollagene, indem sie das sogenannte GXX'GER- Mojv erkennen. Dieses kann entweder GFP*GER, GLP*GER oder GASGER (Xu 2000) sein, wobei es sich bei P* um ein Hyp handelt. In Invertebraten und auch in Quallen wurden bereits Vertreter der Integrine gefunden (Reber- Müller 2001), wobei ein direktes Binden an Kollagen noch nicht beschrieben wurde (Heino 2009, Ağbaş 1994, Knack 2008). Es wird eine indirekte Bindung über zwischengeschaltene Proteine wie Fibronekjn vermutet (Heino 2009). Diese Möglichkeit wird unterstützt durch die Tatsache, dass in Cnidaria das GXX'GER- Mojv nicht zwingend vorhanden ist, wie Analysen der Sequenzen von Hydra vulgaris (Genbank- Nr. ABG ), H. magnapapillata (XP_ ) und der Qualle Podocoryna carnea (CAA ) zeigten. Alle diese Vertreter zeigten leicht abweichende GXX'GER- 85

95 4.2 Verhalten von Chondrozyten auf Quallenkollagen im Vergleich zu Wirbel[erkollagen in 2D und 3D. Abbildung 33: Integrin- Syndecan- Signalweg. Syndecan- 4 interagiert mit Integrin nach der Bindung an das Substrat auf einem noch nicht geklärten Weg und steuert auch davon unabhängig über einen Rho- Signalweg bzw. über α- Ac[nin die Stressfasern und die Bildung fokaler Adhäsionen. FAK= focal adhesion kinase; Scr= Tyrosinkinase; p190rhogap= Rho- GTPase ac[va[ng protein; RhoA= Proteinkinase; Rac 1= GTPase; P KCα= protein kinase C α; RhoGDI= Rho G DP- dissocia[on inhibitor; ROCK I= Rho- associated, coiled- coil containing protein kinase 1; Myosin *P= phosphoriliertes Myosin. Nach Xian et al Sequenzen, die möglicherweise eine Adhäsion von Säugejerzellen an Quallenkollagen über Integrine mit einer geringeren Affinität ermöglichten (Xu 2000, Addad 2011). 86

96 4.2 Verhalten von Chondrozyten auf Quallenkollagen im Vergleich zu Wirbel[erkollagen in 2D und 3D. Auch DDR- ähnliche Proteine wurden bereits in Invertebraten gefunden, aber noch ist nicht bekannt, ob sie an Kollagen binden können (Heino 2009). Das Erkennungsmojv GVMGFP für DDR- 1 und - 2 (Konitsiojs 2008, Xu 2011) konnten nicht in den hier analysierten Sequenzen der Cnidaria gefunden werden, daher dürse die Bindung von Säugejerzellen an Quallenkollagen über DDR- Rezeptoren ausgeschlossen werden. Es wurde bereits gezeigt, dass Quallenkollagen ein geringeres Abflachen von Osteoblasten hervorrus als WT Kollagen I. Gleichzeijg wurde gezeigt, dass die Zellen dabei stak über Integrine hauptsächlich über Syndecane binden (Addad 2011), von denen Invertebraten nur eine Variante stak vier in Wirbeljeren zu haben scheinen (Couchman 2010). Syndecane sind transmembrane, homodimerische Proteoglykane, die mit Heparansulfat- und Chondroijnsulfatkeken bestückt sind, welche wiederum die Bindung an die verschiedensten Substrate bilden. Integrine, die sich durch eine direkte Verbindung zum Akjnskelek auszeichnen, bewirken durch ihre Bindung eine Veränderung des selben (Maniojs 1997, Xian 2010, Couchman 2010, Lo 2006). Syndecan- 4 ermöglicht die Bildung von FA in Verbindung mit a5ß1- Integrin, aber Syndecan- 4 vermikelt ebenso einen eigenen Signalweg, der das Zytoskelek steuert (siehe Abb. 33). Die Verbindung zwischen Rezeptor und Akjnskelek erfolgt über die Akjvierung von Rho A durch eine PKC α oder direkt über α- Acjnin (Dovas 2006, Okina 2009, Ridley 1992, Xian 2010, Okina 2012). Obwohl also auch Syndecane direkt das Zytoskelek beeinflussen, ist durch den unterschiedlichen Signalweg davon auszugehen, dass die Reakjonen der Zellen auf Genexpressionsebene sich bei den beiden Bindungsmechanismen unterscheiden dürsen. Ein deutlicher Unterschied war im Phänotyp der Zellen auf Kollagen I (flach) und Kollagen II (nicht flach) zu erkennen. Analysen der Sequenzen von humanem Kollagen I ( α1: P ; α2: P ) und Kollagen II (CAA ) zeigten ähnlich viele Integrinbindungsstellen, wodurch die Ursache für die Unterschiede nicht in der Integrinbindung liegen dürsen. Dagegen könnte die unterschiedliche Glykosilierungen eine große Rolle spielen. Durch die Hydrathülle der hydrophilen Zucker könnte es zu einer sterischen Hinderung der Zellen bei der Bindung kommen (Yang 1993), was zu einer geringeren Adhäsion und Abflachung führt (Liao 2009). Dieser Umstand würde neben der Abrundung auf dem hoch glykosilierten Kollagen Typ II auch oder zusätzlich den Effekt auf dem Quallenkollagen erklären. Neben der Qualität der Bindung, d.h. über welchen Rezeptor sie zustande kommt, spielt auch die Quanjtät der Bindungen eine nicht minder große Rolle. Nach einem Rezeptor- Sämgungs- Modell (Gaudet 2003) ist eine Zelle abgerundet, wenn sehr wenig Substrat vorhanden ist und somit nur ein geringer Anteil der Rezeptoren in die Bindung involviert sind (Abb. 34 oben). Eine Sämgung von Substrat führt ebenso zum Abrunden, da die Bindungsstellen sehr dicht beieinander liegen und die 87

97 4.2 Verhalten von Chondrozyten auf Quallenkollagen im Vergleich zu Wirbel[erkollagen in 2D und 3D. Abbildung 34: Modelle zur Erklärung der Zelladhäsion. Oben: Rezeptor- Sä]gungs- Modell. Ist die Dichte des Substrates (S- Dichte) sehr gering, können nur wenige der vorhandenen Rezeptoren (hier beispielsweise Integrine) an Substrat binden und die Zelle bleibt abgerundet. Bei ausreichender Substratdichte hingegen flacht sich die Zelle ab, da dadurch mit allen Rezeptoren das erreichbare Substrat gebunden werden kann. Bei Substratüberschuss erreicht die Zelle maximale HaIung mit allen Rezeptoren bereits auf nur einer geringen Fläche der Zellmembran; die Zelle bleibt ebenfalls abgerundet (nach Gaudet 2003). Unten: Anwendung des Substrat- Sä]gungs- Modells auf die Überlegungen zur Bindung an den hier verwendeten Kollagenen. Auf dem Quallenkollagen binden die Zellen mit wenig Rezeptoren, haptsächlich Syndecane. Eine sterische Hinderung der Bindung durch die Hydrathülle des glykosilierten Kollagens könnte die Bindung weiter abschwächen; die Zelle bleibt abgerundet. Auf dem WT Kollagen Typ I sind alle Rezeptoren, hauptsächlich Integrine, an dem Substrat in ausreichender Dichte gebunden, die Zelle muss sich hier allerdings abflachen. Auf dem WT Kollagen II ist vermutlich eine ähnlich hohe Substratdichte vorhanden wie auf WT Kollagen I, jedoch führt auch hier die Hydrathülle zu einer sterischen Hinderung der Bindung, wodurch die Zelle trotz ausreichender Substratdichte abgerundet bleibt. Zelle sich daher nicht abflachen muss, um eine ausreichend feste Bindung zu erreichen. Sind jedoch nur mäßig viele Bindungsstellen vorhanden, flacht sich die Zelle ab, um nach Möglichkeit alle Rezeptoren daran zu binden. Dieses Modell könnte auch erklären, warum Chondrozyten ihre runde Morphologie sowohl erhalten, wenn keine Adhäsionsstellen vorhanden sind wie in Alginat (Schuh 2012 b, Benya 1982) als auch im Gegenzug in Kollagengelen mit einem Überschuss an Bindungstellen 88

98 4.2 Verhalten von Chondrozyten auf Quallenkollagen im Vergleich zu Wirbel[erkollagen in 2D und 3D. (Galois 2006). Dass die Substratkonzentrajon einen Einfluss auf die Morphologie hat, wurde bereits gezeigt (Engler 2004 a, Choi 2012, Erickson 2009). Im Falle des Quallenkollagens dürse die abgerundete Form an den fehlenden Integrinbindungsstellen liegen, somit sind nicht alle Rezeptoren der Zelle, die meisten davon Syndecane, gebunden (siehe Abb. 34 unten). WT Kollagen I dagegen weist viele Integrinbindungsstellen auf, jedoch in nicht so hoher Dichte, als dass es zu einer Abrundung der Zelle durch eine Substratsämgung kommen würde. WT Kollagen II hingegen führte trotz der ähnlich vielen Integrinbindungsstellen vermutlich durch die Glykosilierung des Kollagens zu einer Abrundung der Zellen. Die Adhäsion an Kollagen ist ein äußerst komplexes Ereignis, das von vielen Faktoren abhängt und bei dem sich sogar die Rezeptoren untereinander beeinflussen (Sweeney 2008, Morgan 2007). Vermutlich überlappen sich mehrere Bindungsvorgänge und erlauben es daher nicht, die Ergebnisse aus dem Spreading Assay vollständig zu erklären. Daher müssten in zukünsigen Projekten die individuellen Bindungsvorgänge von Säugejerzellen an Quallenkollagen noch näher untersucht werden. Bei der Kuljvierung von pchs in den 3D Matrices zeigte sich, dass die Zellen ihren chondrozytären Phänotyp am besten auf den RhEsc Matrices erhielten. Auf den HPC Matrices waren die Ergebnisse relajv ähnlich, die Zellen zeigten jedoch im Verlauf des Versuchs einen deutlich geringeren mrna Kollagen II Anteil. Auf Proteinebene zeigten die HPC- Matrices sogar einen höheren Typ II Anteil als die RhEsc Matrices. Das HPC war mit ca. 13 Disaccharide pro 1000 AS und prakjsch keinen Monosacchariden relajv hoch glykosiliert. Dies lag an einer nicht ganz vollständigen Extrakjon des Kollagens, was zur Folge hake, dass noch ein Anteil von ca % Kollagen Typ V enthalten war (Daten nicht gezeigt). Mit seinen ähnlich vielen Integrinbindungsstellen und der hohen Glykosilierung war es daher vergleichbar mit Kollagen II. Die deutlich unterschiedlichen Ergebnisse von Kollagen II und HPC im Spreading Assay ließen sich nicht ohne weiteres erklären, jedoch bestäjgten die Ergebnisse aus dem 3D- Versuch, dass die Anzahl der Bindungsstellen und / oder die Glykosilierung zum Erhalt des chondrozytären Phänotyps eine Rolle spielen. Die Diskrepanz zwischen der geringen mrna col II Expression und dem hohen Anteil von Kollagen Typ II auf Proteinebene kann aus poskranskripjonaler Regulierung der mrna oder in unterschiedlichen mrna- und Proteinumsatzraten resuljeren (Fu 2007). Alle Scaffoldtypen zeigten eine gleichförmige Verteilung der Zellen und auch nach 28 Tagen Zellkultur keine nennenswerte Schrumpfung, was in früheren Arbeiten nicht immer der Fall war (Nehrer 1997, Pieper 2002, Mukaida 2005, Freyria 2009, Lee 2001 a, Vickers 2006). Der Vergleich der Ergebnisse mit 89

99 4.2 Verhalten von Chondrozyten auf Quallenkollagen im Vergleich zu Wirbel[erkollagen in 2D und 3D. der Literatur gestaltete sich als schwierig, da unterschiedliche VersuchsauKauten (z.b. Verwendung eines Gels und / oder dedifferenzierter Zellen) verwendet wurden. Besonders die durchgehende Verwendung eines Kollagen I und II- Verhältnisses (Galois 2006) häke die Ergebnisse vergleichbar gemacht. Mit einem Anteil von ~ 54 % (mrna) und ~ 94 % (Protein) sind die Ergebnisse auf den RhEsc Matrices ähnlich gut wie Wirbeljerkollagene in vergleichbaren Experimenten (Freyria 2004, Pieper 2002, Nehrer 1998, Dorotka 2005). Die deutlichen Unterschiede der Ergebnisse zwischen den Matrices RhEsc und Opjmaix könnte man auf die unterschiedliche Porenstruktur zurückführen (Nehrer 1997, Murphy 2010, Lien 2009), da HPC mit einer ähnlichen Porenstruktur wie RhEsc auch ähnliche Resultate aufwies. Die Ergebnisse aus dem Spreading Assay zeigten jedoch deutlich, dass die Unterschiede auch zu einem gewissen Teil den unterschiedlichen Kollagenen zugeschrieben werden konnten, obwohl dabei beachtet werden muss, dass die Adhäsion in 2D sich deutlich von der in 3D unterscheidet (Reilly 2010, Cukierman 2010). Der auffällige Unterschied zwischen dem Potenjal von HPC in 3D im Vergleich zu der hohen Anzahl abgeflachter und damit dedifferenzierter Zellen in 2D ist möglicherweise einem weiteren Effekt zuzuschreiben dem Unterschied in der Steifigkeit, die auf der Plasjkoberfläche in dem Spreading Assay einem Vielfachen von der Steifigkeit der Matrix entspricht. Die Steifigkeit einer Matrix spielt eine entscheidende Rolle für das Zellschicksal ( Discher 2005, Engler 2006, Schuh 2010, Schuh 2012 a, Schuh 2012 b, Khajwala 2006). So wurden auch gute Ergebnisse auf Kollagen I Gelen erzielt (Freyria 2009, Galois 2006), was durch die sehr geringe Steifigkeit der Gele erklärt werden könnte. Die hier verwendeten Matrices wiesen alle eine in etwa gleiche Steifigkeit auf (siehe Tabelle 11), weswegen die unterschiedlichen Potenjale zum Erhalt des Phänotyps zwischen diesen nicht auf Effekte der Steifigkeit zurückzuführen sind. In 2D ist eine für Chondrozyten bevorzugte Steifigkeit etwa ~ 4 kpa (Schuh 2010). Ob dieser Wert auch in 3D Matrices bevorzugt werden würde, sollte im nächsten Versuch (Kapitel 4.3 ) geklärt werden. In diesem Kapitel konnte gezeigt werden, dass Quallenkollagen sowohl in 2D als auch in 3D den chondrozytären Phänotyp erhalten kann. Dies wurde auf die unterschiedlichen Bindungsmechanismen von Säugejerzellen an Quallenkollagen wegen einerseits mangelnder Integrinbindungsstellen, andererseits auf die vermehrte Bindung an Quallenkollagen über Syndecane zurückgeführt. Nicht ausgeschlossen werden konnte auch eine sterische Hinderung der Zellen durch die Glykosilierung. In 3D zeigte Quallenkollagen vergleichbar gute Ergebnisse wie Wirbeljerkollagen; auch in Vergleich zu bisherigen Arbeiten. Darüber hinaus besteht der große Vorteil von Quallenkollagen gegenüber den Wirbeljerkollagenen die geringere Gefahr einer BSE- Übertragung. 90

100 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? 4.3 Was bewirken die physikalischen Eigenscha en? Material und Methoden In diesem Abschnik werden die Einflüsse der physikalischen EigenschaSen auf die Zellen beschrieben. Dazu wurde einerseits ein Versuch gemacht, bei dem die Morphologien der Scaffolds, d.h. fibrilläre sowie molekulare Scaffolds - letztere zusätzlich mit unterschiedlichen Porenstrukturen- variiert wurden. In einem weiteren Versuch wurden dann molekulare Scaffolds mit unterschiedlichen EDC- Konzentrajonen quervernetzt, um unterschiedliche Steifigkeiten zu erreichen. So sollte der Einfluss der Steifigkeit auf die Chondrozyten untersucht werden. Für alle Untersuchungen wurde ausschließlich Kollagen von RhEsc verwendet. Es wurden auf die in Abschnik beschriebene Weise molekulare und fibrilläre Matrixtypen hergestellt, die mit zwei verschiedenen Geschwindigkeiten eingefroren wurden, um unterschiedliche Porengrößen zu erreichen (siehe Tabelle 12). Die Einfriergeschwindigkeiten um 0,1 C/min wurde durch eine zusätzliche Isolierung erreicht, die extrem schnelle Einfriergeschwindigkeit von 34 C/min durch Einfrieren ohne jegliche Isolierung bei - 80 C. Um bei dem Versuch Morphologie einen Effekt durch unterschiedliche Steifigkeiten auszuschließen, wurde versucht, durch Fixierung der sehr unterschiedlichen Matrices mit 0,5 bzw. Versuch Bezeichnung Kollagenstruktur Dialyse Einfrierkinejk Steifigkeit Morphologie 1 % EDC- Lösungen annähernd ähnliche Steifigkeiten zu schaffen. FibLa fibrillär 50 mm Tris 0,1 C/min auf - 20 C MolSch molekular - 34 C/min auf - 80 C MolLa molekular - 0,11 C/min auf - 20 C 4 kpa molekular - 0,3 C/ min auf - 20 C 12 kpa molekular - n.b. auf - 20 C 40 kpa molekular - 0,26 C/min auf - 20 C Tabelle 12: Übersicht über die verwendeten Schwämmchen und ihre Herstellungsmethode REM- Bilder der fixierten Scaffolds wurden freundlicherweise vom Zentrum für translajonale Knochen-, Gelenk- und Weichgewebeforschung der TU Dresden aufgenommen. Diese Bilder wurden auch herangezogen, um eine grobe Einschätzung über die Porengröße durch Vermessung mit Axio Vision, Version (Zeiss) zu unternehmen. 91

101 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? Ergebnisse EigenschaSen der Matrices Versuch Morphologie Die verwendeten Matrices ließen aufgrund der verschiedenen Kollagenstrukturen bereits mit bloßem Auge Unterschiede erkennen (siehe Tabelle 13). Eine annähernd ähnliche Steifigkeit zwischen den Matrixtypen konnte trotz der Fixierung in unterschiedlichen EDC- Konzentrajonen nicht erreicht werden. Die Matrices FibLa und MolSch waren mit 7,7 ± 2,2 bzw. 10,1 ± 1,5 kpa eher leicht bis mäßig steif und die Matrix MolLa mit 17,2 ± 4 kpa im mikleren Bereich von den zu erreichenden Steifigkeiten. Versuch Typ Beschaffenheit Steifigkeit [kpa] n=3 Peak ( C) Porengröße [µm] Steifigkeit Morphologie n=2 FibLa glasig, gelb spröde 7,8 ± 1,8 47,6 ± 0,4 ca. 160 in einem Bereich von ca MolSch weißlich elasjsch 10,7 ± 2,9 62,7 ± 0,7 850 x 60-80* MolLa weißlich elasjsch 17,2 ± 4 58,3 ± 0, x * 3 kpa weißlich elasjsch 2,8 ± 0,2 (n=2) n.b. n.b. 12 kpa weißlich elasjsch 12,3 ± 1,0 n.b. n.b. 40 kpa weißlich elasjsch 42,9 ± 2,3 n.b. n.b. Tabelle 13: Übersicht über die allgemeinen und physikalischen EigenschaIen der hier verwendeten Schwämmchen. *Angabe von Länge x Breite; die Vermessung aus den REM- Bildern war schwierig, daher wurde auf eine sta[s[sche Auswertung verzichtet. Die Porenstrukturen im Inneren unterschieden sich maßgeblich (siehe Abb. 35). So erschienen die fibrillären Matrices lockerer und großporiger als die molekularen Varianten; mit mehr oder weniger runden Poren. Die durchschnikliche Porengröße lag bei ca. 160 µm, wobei Porendurchmesser von ca. 70 bis 220 µm ausraten. Beide molekulare Varianten waren eher von Kanälen versetzt, die vom Rande her ins Zentrum orienjert waren. Dieses Bild war besonders bei MolSch auffällig. Die offensichtlich kleinsten Poren wies MolSch auf (ca µm Durchmesser) jedoch mit deutlich längeren Kanälen als MolLa. Die Größenbesjmmung über die REM- Bilder erwies sich insgesamt als sehr schwierig, weswegen auf eine stajsjsche Auswertung verzichtet wurde. 92

102 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? Abbildung 35: R EM- Aufnahmen der Schwämmchen. Für den Querschni\ wurde die Probe etwa in der Mi\e ver[kal aufgeschni\en. Die Aufsichten zeigen die unveränderte Oberfläche der Proben. Der Maßstabsbalken entspricht 500 µm. Die Bilder wurden freundlicherweise von der T U Dresden angefer[gt. Versuch Steifigkeit Die verwendeten Scaffolds zeigten klare Unterschiede in der Steifigkeit (siehe Tabelle 13). Mit E- Modulen von ~ 3 kpa, ~ 12 kpa und ~ 40 kpa waren Steifigkeiten erreicht worden, wie sie auch in der Mikroumwelt von Fek-, Muskel- und Knochenzellen ausreten (Abb. 15). Allerdings waren die 93

103 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? Schwämmchen der Steifigkeit von 3 kpa schon 24 h nach Besiedlung so extrem geschrumps, dass eine Auswertung wegen der dadurch veränderten Porengröße hinfällig wurde. Hinzu kam, dass diese Schwämmchen in allen Analysen zu wenig Material für einen Nachweis erbrachten. Daher werden sie in den folgenden Analysen nicht mehr aufgeführt Ergebnisse der Zellkultur Versuch Morphologie Genexpression / mrna- Analyse: Die frisch isolierten Chondrozyten wiesen einen hohen absoluten Wert für mrna col II und einen sehr geringen für mrna col I auf (siehe Abb. 36). Dies entsprach einem Kollagen II Anteil von 99,8 ± 0,1 %. Bei allen Matrixtypen erschien das Muster der Expression ähnlich: Am ersten Tag sanken die Werte für mrna col II deutlich, um an Tag 7 wieder nahezu die Ausgangswerte zu erreichen. Dann sanken sie erneut von Tag 7 bis Tag 14 und von Tag 14 bis 28 gab es kaum wesentliche Änderungen in der Expression von mrna col II. Entscheidend für die Anteile von Kollagen II ist das AuSreten von mrna col I, was bei der fibrillären Variante FibLa am Tag 14 deutlich passierte und bis Tag 28 noch weiter leicht sjeg. Bei den molekularen Matrices MolSch und MolLa sjeg der absolute Wert mrna col I erst zwischen Tag 14 und 28 an, wobei er bei MolSch noch deutlich höher sjeg. Dies hake zur Folge, dass die Anteile an Kollagen II in allen Matrixtypen bis einschließlich Tag 1 noch nahezu 100 % waren, dann aber mehr oder weniger schnell sanken. Die fibrilläre Variante FibLa wies bereits an Tag 14 nur noch einen Anteil von 66 ± 18 % auf, wohingegen die molekularen Matrices noch einen Anteil von ca. 83 ± 6 % (MolSch) beziehungsweise 86 ± 3 % (MolLa) aufwiesen. Bis Tag 28 sank dann der Anteil an Kollagen II bei FibLa auf 41 ± 14 %; die von MolSch auf 52 ± 4 % und die Anteile von MolLa auf 73 ± 11 %. In den fibrillären Matrices war demnach nach 28 Tagen die Expression von mrna col II geringer als die von mrna col I. 94

104 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? FibLa 0.04 mrna col II mrna col I Anteil Typ II [%] mrna col / mrna GAPDH FibLa Zeit [d] mrna col II mrna col I Anteil Typ II [%] mrna col / mrna GAPDH Zeit [d] Anteil Typ II [%] mrna col / mrna GAPDH mrna col II mrna col I MolLa MolLa 0 20 Zeit [d] MolSch MolSch Zeit [d] Zeit [d] Zeit [d] Abbildung 36: Expression von Kollagen I und I I über 28 Tage Zellkultur auf den verschiedenen Scaffoldtypen. Linke Spalte: Absolute Expression im Verhältnis zu G APDH. Rechte Spalte: Anteil von Kollagen I I an der Summe der beiden gemessenen Kollagene I und II. Die gestrichelte Linie markiert 50 %. n=2-3 Proteinexpression: Abbildung 37 zeigt den Anteil von Kollagen II nach 14 und 28 Tagen in den unterschiedlichen Schwämmchentypen. Nach 14 Tagen hake MolLa mit 62,4 ± 9,8 % den höchsten Anteil an Kollagen Typ II und die fibrilläre Variante mit 45,0 ± 12,5 % Typ II den geringsten. Nach 28 Tagen hake sich der Anteil an Kollagen II in FibLa auf 66,8 ± 9,0 % erhöht, wodurch zu diesem Zeitpunkt FibLa und MolLa mit 64,3 ± 18,9 % in etwa gleich hohe Anteile an Kollagen II aufwiesen. Der Anteil in MolSch (51,5 ± 22,4 % nach 28 Tagen) hake sich nicht klar verändert. 95

105 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? 14 Tage 28 Tage Anteil Typ II an Gesamtkollagen [%] FibLa MolSch MolLa Abbildung 37: Densitometrische Auswertung der Proteinsynthese nach Slotblot. Darstellung des Anteils von Kollagen Typ I I am Gesamtkollagen, exprimiert nach 14 und 28 Tagen. n=2 Scaffolds, die Balken geben jeweils den Mi\elwert an. Zellproliferajon: Während der vierwöchigen Zellkultur konnte bei keiner Schwämmchenvariante eine Schrumpfung beobachtet werden. Die Besiedlung war auf den Matrices MolLa etwa 4-5 mal effekjver als in den Matrices MolSch und FibLa (siehe Abb. 38). In den fibrillären Matrices FibLa fand keine Zu- oder Abnahme der DNA- Konzentrajon stak und die DNA- Konzentrajon war am Ende des Versuchszeitraumes etwa 3 mal geringer als in den beiden molekularen Matrices. Bei MolSch schien sich die Zellzahl von T 1 bis T 7 fast zu verdreifachen, um dann bis T 14 wieder auf die Ausgangskonzentrajon zurückzugehen. Bei MolLa dagegen gab es nur einen inijajven Rückgang um das etwa 2,5 fache bis T 14. In beiden molekularen Scaffolds erfolgte von T 14 zu T 28 nochmals in etwa eine Verdopplung der DNA- Konzentrajon. MolSch FibLa ng DNA / mm 3 MolLa Zeit [d] Zeit [d] Zeit [d] Abbildung 38: D NA- Gehalt pro mm³ in den verschiedenen Scaffoldtypen im Verlauf einer vierwöchigen Zellkul[vierung. n=3 96

106 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? Histologie: In der Alcian- Färbung zeigte sich zunächst, dass FibLa sehr großporig war, weswegen die Zellen nur lokal an den Kollagenstegen siedelten. Die anderen beiden Scaffoldtypen wiesen jeweils eine sehr homogene Zellverteilung auf. Entsprechend dieser Verteilungen an Tag 1 waren an Tag 28 die neu synthejsierten GAGs in den Scaffolds FibLa nur geklumpt gestreut und somit war die Dichte eher gering. In MolSch war die Verteilung deutlich homogener, wohingegen in MolLa eine sehr regelmäßige Streuung neu synthejsierter Matrix zu erkennen war. Bei der Immunhistologie konnte zu keinem Zeitpunkt Kollagen I nachgewiesen werden. Kollagen II war in allen Proben noch nicht an Tag 1, aber an Tag 28 zu finden. Die Schwämmchentypen unterschieden sich daher in der Histologie nicht durch unterschiedliche Anteile an Kollagen I bzw. II, Abbildung 39: Alcian- Färbungen der Proben nach Tag 1 und Tag 28 in der Zellkultur. Die FibLa Scaffolds waren extrem großporig und die Zellen waren nur lokal an den Stegen angelagert (pinker Pfeil). Die Zellen in den anderen Scaffoldtypen waren homogener verteilt und entsprechend homogen verteilt war die neu synthe[sierte Matrix. Augenscheinlich wiesen nach 28 Tagen die MolLa Scaffolds am meisten G AGs auf. Maßstabsbalken = 100 µm. 97

107 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? sondern im Wesentlichen durch die Verteilung der neu synthejsierten Matrix. Abbildung 40: Immunhistologische Färbungen der Proben nach 1 bzw. 28 Tagen Zellkultur. Das Quallenkollagen wies eine gewisse Eigenfluoreszenz auf, war jedoch in der Intensität und Struktur von neu synthe[siertem Kollagen zu unterscheiden, was in Klumpen um die Zellen anzufinden war. Auch nach 28 Tagen war kein Kollagen Typ I nachweisbar, Kollagen II dagegen in allen Proben, jedoch nicht an Tag 1. Grün: FITC- Färbung des jeweiligen Kollagens, blau: DAPI- Färbung der Zelkerne. Maßstab 50 µm Versuch Steifigkeit 98

108 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? Genexpression / mrna- Analyse: Frisch isolierte Zellen wiesen an Tag 0 auch hier einen Anteil Kollagen II von etwa 100 % auf (siehe Abb. 41). Die Expression für mrna col II fiel nach der Besiedlung bis Tag 1 deutlich ab, um dann an Tag 7 wieder extrem anzusteigen und bis Tag 28 wieder leicht abzufallen. Die Expression bei den 12 kpa Schwämmchen war dabei deutlich höher als bei den 40 kpa Schwämmchen. Die Expression für mrna col I sjeg dagegen nur leicht an; hier aber noch deutlicher in den 40 kpa Schwämmchen. Der Anteil der Expression von Kollagen II veränderte sich bis zum Tag 1 nicht wesentlich. Erst an Tag 3 begann der Anteil leicht zu sinken. An Tag 7 zeigte sich der erste Unterschied zwischen den beiden Steifigkeiten mit einem Anteil von 91 ± 3 % bei den 40 kpa Schwämmchen und 94 ± 3 % bei den 12 kpa Schwämmchen. Der Anteil in den 40 kpa Schwämmchen sank bis zum Tag 28 weiter auf 69 ± 5 % und hielt sich dagegen in den 12 kpa Schwämmchen bei 91 ± 2 %. Abbildung 41: mrna- Expression über vier Wochen Zellkultur der Zellen in den Schwämmchen der Steifigkeit 12 und 40 kpa. A: Gesamtexpression von Kollagen I und II im Verhältnis zu GAPDH. B: Anteil an Kollagen II an der Summe der beiden Kollagentypen. n=5 Proteinexpression: 99

109 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? Die Analyse der Proteinexpression in den Schwämmchen mit unterschiedlicher Steifigkeit ergab keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden verwendeten Schwämmchentypen (siehe Abb. 42). Auch innerhalb des Zeitraumes von T 14 bis T 28 ergab sich keine merkliche Veränderung. Der Anteil von Kollagen II war in allen Proben mit wenigstens 87 ± 1 % relajv hoch. Tatsächlich war der Anteil in den weichen Schwämmchen mit 91± 1 % (T 14) und 87 ± 1 % (T 28) leicht geringer als in den steiferen Schwämmchen mit 94 ± 4 % (T 14) und 90 ± 3 %. Die Unterschiede waren jedoch nicht signifikant. Anteil Typ II an Gesamtkollagen [%] Tage 28 Tage kpa 40 kpa Abbildung 42: Densitometrische Auswertung der Proteinsynthese nach Slotblot. Darstellung des Anteils von Kollagen Typ I I am Gesamtkollagen, exprimiert nach 14 und 28 Tagen. n=3 Scaffolds, die Balken geben jeweils den Mi\elwert an. Proliferajon: Die Schwämmchen mit den Steifigkeiten 12 und 40 kpa zeigten einen leicht unterschiedlichen Verlauf bei der Besiedlung (siehe Abb. 43). Die steiferen Schwämmchen nahmen etwa 2 bis 3 mal mehr Zellen auf als die weicheren Schwämmchen. Die relajv hohe Zellzahl reduzierte sich jedoch bis zum Tag 3 auf eine ähnliche Konzentrajon wie in den 12 kpa Schwämmchen. Bis zum Tag 14 gab es keine wesentlichen Änderungen und Unterschiede zwischen den beiden Steifigkeiten. Zum Tag 28 hin sjeg der DNA- Gehalt bei den weicheren Schwämmchen dann noch leicht bis deutlich an, was durch die Streuung der Werte zu diesem Zeitpunkt jedoch nicht genau unterschieden werden kann. 100

110 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? ng DNA / mm³ kpa 12 kpa Zeit [d] Abbildung 43: D NA- Gehalt pro mm³ der Schwämmchen der Steifigkeit 40 bzw. 12 kpa über einen Zeitraum von vier Wochen. n=5 Histologie: Die DAPI- Färbungen zeigten, dass die Zellen in beiden Schwämmchentypen sehr homogen verteilt waren, selbst nach vierwöchiger Zellkultur. Eine Zu- oder Abnahme der Zellzahl war hier nicht festzustellen, was auch die Ergebnisse der Untersuchung zu Proliferajon untermauert (siehe Abb. 43). Obwohl eine vermehrte Anhäufung von Zellen im Randbereich nicht zu erkennen war, zeigte sich ein leichter Unterschied zwischen der Matrixverteilung in den Schwämmchen (siehe Abb. 44). Die Alcian- Färbung zeigte bei beiden Scaffoldtypen eine extreme Zunahme an EZM von Tag 0 zu Tag 14. Jedoch war bei den 12 kpa Schwämmchen zu diesem Zeitpunkt wesentlich mehr EZM bereits innen zu finden, bei den 40 kpa Schwämmchen nur eher am Rande. Der immunhistologische Nachweis (Abb. 45) der Kollagene Typ I und II zeigte bereits nach sieben Tagen in beiden Scaffoldtypen deutliche Spuren von Kollagen II. Jedoch wiesen nur die steiferen Schwämmchen Zeitpunkt T 14 bereits Kollagen I auf (Daten nicht gezeigt). An Tag 28 ließen beide Scaffoldtypen eine ähnliche Menge an Typ II erkennen; nur in den 40 kpa Schwämmchen war lokal noch Kollagen I zu finden. Das Expressionsmuster mit sehr hohen Anteilen Kollagen II in beiden Sorten Schwämmchen neben einer sehr geringen Expression von Kollagen I spiegelt sehr gut das Expressionsmuster wider, was sich durch die Slotblot- Analyse offenbarte. Offensichtlich gab es in beiden Steifigkeiten keinen wesentlichen Unterschied in der Expression der Kollagene; beide wiesen einen sehr hohen Anteil Kollagen II und einen nur kaum nachweisbaren Anteil Kollagen Typ I auf. 101

111 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? Abbildung 44: Alcian- Färbung von Schni\en der Schwämmchen nach 1, 14 und 28 Tagen in Zellkultur. Die Kernechtrot- gefärbten Zellkerne sind bei dieser Vergrößerung nicht sichtbar. Neu synthe[sierte GAGs erscheinen blau. Maßstabsbalken = 100 µm 102

112 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? Abbildung 45: Immunhistologische Färbungen der Proben nach 1 bzw. 28 Tagen Zellkultur. Die Zellen waren auch nach 28 Tagen homogen verteilt (DAPI, nicht gezeigt). Das Quallenkollagen wies eine gewisse Eigenfluoreszenz auf, war jedoch in der Intensität und Struktur von neu synthe[siertem Kollagen zu unterscheiden, was in Klumpen um die Zellen anzufinden war. In den 40 kpa- Proben war nach 28 Tagen Kollagen Typ I deutlich nachweisbar, in den 12 kpa- Proben dagegen nur ganz sporadisch (nicht abgebildet). Kollagen I I war dagegen nach Tagen in allen Proben in ähnlicher Intensität und Verbreitung anzufinden, jedoch nicht an Tag 1. Grün: F ITC- Färbung des jeweiligen Kollagens. Maßstab 50 µm

113 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? Diskussion Die Versuche in diesem Kapitel sollten die Einflüsse unterschiedlicher physikalischer EigenschaSen und Morphologien auf die Zellen aufzeigen und somit die Wahl einer geeigneten Variante für eine Matrix zur Knorpelregenerajon ermöglichen. Zunächst wurden verschiedene morphologische Variajonen wie fibrilläres Kollagen gegen molekulares Kollagen und Matrices mit unterschiedlicher Porengröße untersucht. Anschließend wurde der Einfluss der Steifigkeit auf die Zellen ermikelt. Die Morphologie der Schwämmchen hake einen gewissen Einfluss auf das Ergebnis, ein möglichst hyalin- ähnliches Knorpelkonstrukt zu erhalten. Am ehesten trat dabei die Variante MolLa als geeignet hervor, da sie sich am besten zur Zellaufnahme eignete und auf mrna- und Proteinebene sehr hohe Kollagen Typ II Anteile ermöglichte. Die Variante des fibrillären Scaffolds fiel vor allem in der Histologie durch seine ungünsjge Struktur auf. Die groben Kanäle ließen eine Besiedlung mit Zellen nur an den Kollagenstegen zu, wodurch de facto eine zweidimensionale stak einer dreidimensionalen Struktur für die Zellen zur Verfügung stand. Diese lokale Verteilung, zusammen mit dem Umstand, dass diese Scaffoldtypen ohnehin am wenigsten Zellen aufnahmen, führten zu einer sehr geringen Matrixneusynthese, was sich in der Histologie und im Slotblot (Daten nicht gezeigt) widerspiegelte. Dennoch bewirkte diese Matrix zumindest auf Proteinebene einen sehr hohen Anteil von Kollagen Typ II und die fehlende Proliferajon lässt auf eine geringe Dedifferenzierung schließen. Die Variante MolSch zeigte eine ebenfalls sehr geringe Aufnahme der Zellen zu Beginn, von Tag 1 bis 7 dagegen eine deutliche Proliferajon um mehr als das Zweifache und im Vergleich zu den anderen Varianten einen geringeren Anteil Kollagen II auf Proteinebene. Aufgrund der relajv hohen Ausbeute an neu synthejsierter Matrix sowie des Potenjals, offensichtlich den chondrozytären Phänotyp gut erhalten zu können, ging aus diesem Versuch die molekulare Variante, die langsam eingefroren wurde (MolLa), als bevorzugte Variante hervor. Unklar bleibt, wie viel Einfluss die Kollagenstruktur auf die Zellen ausübt, da die Scaffolds sich nicht nur in diesem Punkt unterschieden, sondern vor allem in der Porenstruktur und der Steifigkeit (siehe Tabelle 13). Wie bereits in Kapitel beschrieben, hasen Zellen mit den Integrinen α1β1, α2β1, α10β1 und α11β1 an najve Kollagene aus der fibrillenbildenden Familie. Dabei macht es aber einen Unterschied, ob die Kollagene tatsächlich als Fibrillen oder aber als Monomere vorliegen. Bekannt ist, dass fibrilliertes Kollagen I das Wachstum diverser Zellen wie glaken Muskelzellen (Koyama 1996), Melanomzellen (Henriet 2000), glomeruläre Epithezellen (Schöcklmann 2000) und Hepatozyten (Hansen 1999, De Smet 2001) inhibiert, wobei die Adhäsion an monomeres Kollagen den Eintrik in den Zellzyklus sjmuliert. Der Auslöser ist dabei nicht die Bindung eines speziellen Integrins, sondern 104

114 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? bei Hepatozyten zumindest teilweise auf eine von der EZM- Struktur abhängigen Akjvierung eines EGF- Rezeptors zurückzuführen, was wiederum den Eintrik in den Zellzyklus verhindert (Fassek 2006). Eine weitere Möglichkeit ist die Erkennung der Kollagenstruktur über DDR- Rezeptoren. DDR2 wird ausschließlich in Zellen auf fibrillären Kollagenen exprimiert (Vogel 1997) und dieser hemmt den Eintrik von humanen Melanomzellen und Fibrosarkom- Zellen in den Zellzyklus auf fibrilliertem, jedoch nicht monomeren Kollagen (Wall 2005). Die Akjvierung von DDR2 kann jedoch auf nicht- malignen Zellen wie Fibroblasten und Sternzellen den umgekehrten Effekt haben (Ikeda 2002, Olaso 2001, Olaso 2002). Wie sich in Kapitel herausgestellt hake, war der Bindungsmechanismus der Säugejerzellen an Quallenkollagen nicht gänzlich aufzuklären, jedoch wurde die Bindung über DDR- Rezeptoren dort bereits ausgeschlossen. Hauptsächlich scheint die Bindung über Syndecane zu verlaufen, da eine Zugabe von Heparin, einem Bestandteil der Syndecane, zu einer deutlichen Redukjon der Adhäsion führt (Addad 2011). Zwar wird eine tripelhelikale Struktur des Kollagens als Notwendigkeit zur Bindung von Heparin beschrieben (Keller 1986), aber in Quallenkollagen scheint auch in der (Hitze- )denaturierten Form eine Bindestelle vorhanden zu sein (Addad 2011). Fibrilläres Kollagen mit vorhandenen Telopepjden bindet jedoch kein Heparin, da in vivo die Bindungsstellen mit Telopepjden belegt sind. In Fibrillen aus pepsinverdautem Kollagen bindet das durch die hohe Glykosilierung stark negajv geladene Heparin jedoch offensichtlich in Regionen nahe des N- und C- Terminus der Fibrillen (Stamov 2011). Von Chondrozyten wird beschrieben, dass sie ihren Phänotyp auf monomerem Kollagen I besser erhalten als auf der fibrillierten Form, ohne dass jedoch die Kollagensynthese davon beeinflusst würde (Farjanel 2001). Die Autoren konnten zeigen, dass dieser Effekt abhängig war von α2β1- Integrin, welches sowohl molekulares als auch fibrilläres Kollagen erkennt, sie schlossen aber auch die Erkennung über andere Rezeptoren wie DDR1 und 2 nicht aus. Der Einfluss der Kollagenstruktur konnte in diesem Versuch nicht geklärt werden, da sich zum einen die Scaffolds in ihren anderen Parametern wie Steifigkeit und Porengröße unterschieden und zum anderen der Bindungsmechanismus per se an Quallenkollagen nicht hinreichend geklärt war. Dennoch konnte dieser Versuch zeigen, dass die Verwendung fibrillären Kollagens aufgrund der guten Ergebnisse der molekularen Varianten keinen weiteren Vorteil zu bringen schien, sondern sogar im Gegenteil womöglich wegen der großen Poren sich sehr wenig neues Material bildete. Die Poren der molekularen, unterschiedlich schnell eingefrorenen Schwämmchen unterschieden sich weniger im Porendurchmesser als in ihrer Struktur (siehe Tabelle 13 und Abb. 35). Die langsam eingefrorenen wiesen eine wabenarjge Poren auf, die mehr oder weniger abgeschlossen waren, wohingegen die schnell eingefrorenen Scaffolds eher Kanäle aufwiesen. Womöglich sind diese Kanäle bei der Besiedlung nachteilig, denn auch die fibrillären Scaffolds mit ihren Kanälen waren in ihrer Effekjvität 105

115 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? der Besiedlung ähnlich gering, wohingegen in MolLa sich nach der Besiedlung deutlich mehr DNA fand. In der Effekjvität, den Phänotyp zu erhalten, unterschieden sich die Variante MolLa und MolSch nur unwesentlich, wobei sich MolLa besser zu eignen schien. Gerade aber wegen der besseren Zellaufnahme wurde schließlich diese Variante als die am besten geeignete für weitere Versuche erwählt. Die Untersuchungen zum Einfluss der Steifigkeit wurden mit den aus dem Versuch Morphologie als beste Variante ermikelten MolLa- Scaffolds unternommen. Durch Fixierung mit unterschiedlichen EDC- Konzentrajonen konnte ein Steifigkeitsbereich von ca. 3 bis 43 kpa erreicht werden, was bis dato in Kollagenscaffolds noch nicht in einem ähnlich breiten Spektrum erreicht wurde, ohne weitere Parameter mit entsprechenden weiteren Einflüssen zu verändern (siehe Tabelle 9). Dieser Bereich entsprach der Steifigkeit der Mikroumgebungen von Fek-, Muskel- und Knochenzellen (siehe Abb. 15), somit waren die Voraussetzungen gegeben, um die Reakjon der Zellen in realisjschen Umgebungen zu untersuchen. Die 3 kpa- Scaffolds erwiesen sich jedoch für die Zellkultur als zu weich, denn bereits nach 24 h trat eine Schrumpfung etwa um die HälSe des Durchmessers auf. Dies verhinderte eine ausschließliche Untersuchung des Effektes der Steifigkeit, weswegen diese Scaffolds nicht mehr weiter untersucht wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass die weicheren Scaffolds um 12 kpa in puncto RNA- Expression und neuer Synthese von GAGs (Alcian- Färbung) den steifen Scaffolds gegenüber leicht besser geeignet waren, den Phänotyp zu erhalten. In beiden Typen Scaffolds proliferierten die Zellen offensichtlich nicht, was gegen eine Dedifferenzierung spricht. Außerdem enthielten beide Konstrukte bereits nach 14 Tagen, aber auch noch nach 28 Tagen auf Proteinebene Kollagen- II- Anteile von ca. 87 bis 94 %, was einem hyalinen Knorpel sehr nahe kommt. Offensichtlich wurde von den Zellen die jeweilige Steifigkeit erkannt und die geringere Steifigkeit von 12 kpa war für die Zellen geeigneter. In 2D scheint eine Steifigkeit von etwa 4 kpa für Chondrozyten von Vorteil zu sein (Schuh 2010). Dies ist auch übereinsjmmend mit der Steifigkeit der Chondrozyten selber, die frisch isoliert Werte zwischen 0,7 bis 4 kpa (Jones 1999, Koay 2003, Freeman 1994) aufweisen. Hingegen erweist sich die perizelluläre Matrix der Chondrozyten mit Werten von 25 kpa (Stolz 2004) als deutlich steifer. Mit einer Steifigkeit von 12 kpa waren die hier verwendeten weicheren Schwämmchen daher im mikleren Bereich dieser beiden Steifigkeiten, was womöglich die guten Ergebnisse erklärt. Dabei müssen jedoch auch hier wieder die abweichenden Adhäsionsmechanismen der Säugejerzellen auf dem Quallenkollagen beachtet werden, die weniger über Integrine als über Syndecane oder andere, noch nicht besjmmte Mechanismen funkjonieren. Der Mechanismus, durch den die Zellen die Steifgkeit der sie umgebenden Matrix erkennen, ist noch nicht gänzlich aufgeklärt. Dennoch konnten einige daran beteiligte Komponenten besjmmt werden. 106

116 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? Die Zelle kontrahiert zunächst das Akjn- Myosin- Skelek (Engler 2006, Friedland 2009) und die zur Beprobung benöjgte KraS wird über Rezeptoren auf die EZM übertragen. Dabei spielen die Fokalen Adhäsionen (Giannone 2006) und hier speziell die Integrine eine bedeutende Rolle (Sanz- Ramos 2012, Friedland 2009). Die Streckung des Akjns wird dann durch eine Vielzahl von Tyrosinkinasen und Phosphatasen erfasst (Friedland 2009). Obwohl alle vier Syndecane der Wirbeljere mit dem Zytoskelek interagieren (Okina 2009, Yoneda 2003), ist über deren Rolle bei der Prüfung der Steifigkeit jedoch in der Literatur nichts bekannt. Allerdings werden u.a. β1- Integrine von Syndecanen akjviert, was aber für deren Funkjon nicht zwangsläufig notwendig ist (Couchman 2010). β1- Integrine sind an der Adhäsion an Quallenkollagen zu etwa % beteiligt (Addad 2011). Möglicherweise reicht auch diese geringe Bindung, um Steifigkeiten wahrzunehmen. Diese dürsen allerdings keinen Einfluss auf den Phänotyp und das Akjnskelek, sondern nur auf das Proteinexpressionsmuster der Zellen haben, was durch die relajv unveränderten Phänotypen im Spreading Assay zu erklären ist, wo die Zelle durch den Plasjkuntergrund eine sehr hohe Steifigkeit erfuhr. In diesem Kapitel kristallisierten sich die molekularen Scaffolds gegenüber den fibrillären als geeigneter heraus, den chondrozytären Phänotyp zu erhalten. Ein Einfluss der Porengröße auf die Zellen konnte bei den hier ausretenden Durchmessern von ca µm (MolSch) bzw µm (MolLa) nicht direkt festgestellt werden. Die leicht unterschiedlichen Ergebnisse dieser Proben wurde vor allem der Rolle der Porenstruktur während der Besiedlung zugeschrieben, denn die von deutlich längeren Kanälen (knapp 1 mm) durchsetzten MolSch Scaffolds nahmen deutlich weniger Zellen auf als MolLa. Obwohl sich die vorliegenden Kollagenscaffolds MolLa sehr gut eignen, durch unterschiedlich starke Quervernetzungen die Steifigkeit in einem physiologischen Rahmen zu variieren, ist dieses System aufgrund der unterschiedlichen Bindungsmechanismen von Wirbeljerzellen auf Quallenkollagen nicht geeignet, um allgemein den Einfluss der Steifigkeit in 3D ohne weiteren Nebeneffekten zu untersuchen. Die vorliegenden Daten erlauben daher keine Aussage darüber, welche Steifigkeit porcine Chondrozyten per se in 3D bevorzugen. Dennoch kann daraus geschlossen werden, dass sich bei einer Matrix aus Quallenkollagen eine Steifigkeit von ca. 12 kpa sehr gut eignet, ein hyalin- ähnliches Konstrukt zu erhalten. Ob eine geringere Steifigkeit noch vorteilhaser wäre. d.h. es auf Proteinebene zu Kollagen- II- Anteilen von nahezu 100 % käme, kann vermutet werden, wie Daten aus 2D (Schuh 2010) und 3D (Galois 2006) zeigen. Dennoch sind der Matrix diesbezüglich in der Handhabung Grenzen gesetzt, denn das Material sollte eine gewisse mechanische Stabilität 107

117 4.3 Was bewirken die physikalischen EigenschaIen? aufweisen, um in den Defekt genäht werden zu können, dort nicht zu schrumpfen oder eine Belastung durch den Pajenten nach der Operajon längerfrisjg zu überstehen. 4.4 Potential für Redifferenzierung Einleitung In der Praxis der autologen Chondrozytentransplantajon ist aufgrund der geringen Zelldichte im Knorpel ein wichjger Schrik, die zur Transplantajon entnommenen Zellen vor der Implantajon über mehrere Tage in einer Monolayer- Kultur zu vermehren. Allerdings dedifferenzieren die Zellen dabei hin zu fibroblastoiden Zellen mit einem hohen Typ I Anteil und einem ausgeprägten Akjnskelek ( von der Mark 1977, Grundmann 1980). Daher wäre eine Matrix, die sich grundsätzlich für die Knorpelregenerajon eignete und gleichzeijg eine Redifferenzierung ermöglichen würde von großem Vorteil. Die bisherigen Ergebnisse zeigten, dass das Kollagen aus der Qualle RhEsc mindestens so gut geeignet war für die Knorpelregenerajon wie Wirbeljerkollagen. Die Versuche wurden stets mit frisch isolierten Chondrozyten durchgeführt, um die Auswirkung auf den chondrozytären Phänotyp nicht durch eine durch Kuljvierung im Monolayer erfolgte Dedifferenzierung zu verfälschen Material und Methoden Für die vorliegende Untersuchung zur Redifferenzierung wurden daher frisch isolierte Chondrozyten für 7 Tage in einer Monolayerkultur vermehrt und als Kontrolle auf Schwämmchen aus RhEsc- und HPC- Kollagen kuljviert. Ein paralleler Ansatz mit frisch isolierten Zellen diente dabei als Kontrolle. Erwartet wurde, dass sich die dedifferenzierten Zellen auf den Schwämmchen aus Quallenkollagen sich den Zellen der Kontrollgruppe in puncto mrna- Expressionsmuster und Kollagensynthese annäherten. Zur Dedifferenzierung wurden frisch isolierte Zellen in einer Dichte von Zellen cm- 1 auf T 150 Plaken zwischenzeitlich ausplamert, am nächsten Tag gespliket und schließlich in einer Dichte von Zellen cm - 1 auf T 150 Plaken für 7 Tage kuljviert (Schuh 2012 a). Die Dedifferenzierung wurde immunhistologisch und auf RNA- Ebene kontrolliert. Hierzu wurden Zellen auf die selbe Weise für 7 Tage auf 2er BD Falcon Chamber- Slides Objekkrägern ( BD Biosciences) kuljviert und an Tag 1 und Tag 7 beprobt. Zur Fixierung wurden sie zunächst mit PBS gewaschen und 108

118 4.4 Poten[al für Redifferenzierung Abbildung 46: Nachweis der Dedifferenzierung von Chondrozyten nach 7 Tagen im Monolayer. A) Immunhistologischer Nachweis der Kollagen Typ I- und II- Synthese. An Tag 1 waren die Zellen noch überwiegend rund und produzierten etwas mehr Typ I I als Typ I. Nach 7 Tagen waren fast alle Zellen abgeflacht und diese wiesen eine Färbung für Typ I auf. Nur wenige runde Zellen waren Typ- II posi[v. Maßstabsbalken = 20 µm. B) RT- PCR Analyse der Genexpression. Der Anteil an Kollagen I I am Gesamtkollagen sinkt deutlich von ca. 100 % an Tag 1 auf 26 % an Tag 7. n= 3-4 dann mit 4 % Formalin fixiert. Die Immunfärbung und Mikroskopie erfolgte dann wie in Abschnik beschrieben. Zellen für die RNA- Analyse wurden ebenfalls in einer Dichte von Zellen cm - 1 auf 10 cm Petrischalen (TPP) ausgesät, an Tag 1 und 7 beprobt und wie in Kapitel beschrieben durch RT- PCR analysiert. Das Medium für die Kuljvierung war das bereits beschriebene Medium RPMI ohne Ascorbat Ergebnisse und Diskussion Dedifferenzierung Die Zellen, die zur Dedifferenzierung zunächst für eine Nacht in hoher Dichte ausgesät worden waren, wurden vor dem Spliken gezählt (90*10 6 Zellen), wobei die Anzahl der toten Zellen mit 38 % relajv hoch war. Die erneute Zählung nach der Kuljvierung über 7 Tage ergab 366*10 6 Zellen bei einem Anteil von nurmehr 9 % toter Zellen. Die Zellen proliferierten demnach von Tag 0 bis Tag 7 um das Vierfache. 109

Lineargleichungssysteme: Additions-/ Subtraktionsverfahren

Lineargleichungssysteme: Additions-/ Subtraktionsverfahren Lineargleichungssysteme: Additions-/ Subtraktionsverfahren W. Kippels 22. Februar 2014 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 2 2 Lineargleichungssysteme zweiten Grades 2 3 Lineargleichungssysteme höheren als

Mehr

Die Forschung mit embryonalen Stammzellen ist ethisch nicht akzeptabel

Die Forschung mit embryonalen Stammzellen ist ethisch nicht akzeptabel Die Forschung mit embryonalen Stammzellen ist ethisch nicht akzeptabel Das Schweizer Volk soll sich selber äussern bezüglich der Gesetzgebung zur embryonalen Stammzellenforschung. Die ethische Bedeutung

Mehr

Kreativ visualisieren

Kreativ visualisieren Kreativ visualisieren Haben Sie schon einmal etwas von sogenannten»sich selbst erfüllenden Prophezeiungen«gehört? Damit ist gemeint, dass ein Ereignis mit hoher Wahrscheinlichkeit eintritt, wenn wir uns

Mehr

Simulation LIF5000. Abbildung 1

Simulation LIF5000. Abbildung 1 Simulation LIF5000 Abbildung 1 Zur Simulation von analogen Schaltungen verwende ich Ltspice/SwitcherCAD III. Dieses Programm ist sehr leistungsfähig und wenn man weis wie, dann kann man damit fast alles

Mehr

40-Tage-Wunder- Kurs. Umarme, was Du nicht ändern kannst.

40-Tage-Wunder- Kurs. Umarme, was Du nicht ändern kannst. 40-Tage-Wunder- Kurs Umarme, was Du nicht ändern kannst. Das sagt Wikipedia: Als Wunder (griechisch thauma) gilt umgangssprachlich ein Ereignis, dessen Zustandekommen man sich nicht erklären kann, so dass

Mehr

Mehr Geld verdienen! Lesen Sie... Peter von Karst. Ihre Leseprobe. der schlüssel zum leben. So gehen Sie konkret vor!

Mehr Geld verdienen! Lesen Sie... Peter von Karst. Ihre Leseprobe. der schlüssel zum leben. So gehen Sie konkret vor! Peter von Karst Mehr Geld verdienen! So gehen Sie konkret vor! Ihre Leseprobe Lesen Sie...... wie Sie mit wenigen, aber effektiven Schritten Ihre gesteckten Ziele erreichen.... wie Sie die richtigen Entscheidungen

Mehr

Das Persönliche Budget in verständlicher Sprache

Das Persönliche Budget in verständlicher Sprache Das Persönliche Budget in verständlicher Sprache Das Persönliche Budget mehr Selbstbestimmung, mehr Selbstständigkeit, mehr Selbstbewusstsein! Dieser Text soll den behinderten Menschen in Westfalen-Lippe,

Mehr

infach Geld FBV Ihr Weg zum finanzellen Erfolg Florian Mock

infach Geld FBV Ihr Weg zum finanzellen Erfolg Florian Mock infach Ihr Weg zum finanzellen Erfolg Geld Florian Mock FBV Die Grundlagen für finanziellen Erfolg Denn Sie müssten anschließend wieder vom Gehaltskonto Rückzahlungen in Höhe der Entnahmen vornehmen, um

Mehr

Das große ElterngeldPlus 1x1. Alles über das ElterngeldPlus. Wer kann ElterngeldPlus beantragen? ElterngeldPlus verstehen ein paar einleitende Fakten

Das große ElterngeldPlus 1x1. Alles über das ElterngeldPlus. Wer kann ElterngeldPlus beantragen? ElterngeldPlus verstehen ein paar einleitende Fakten Das große x -4 Alles über das Wer kann beantragen? Generell kann jeder beantragen! Eltern (Mütter UND Väter), die schon während ihrer Elternzeit wieder in Teilzeit arbeiten möchten. Eltern, die während

Mehr

Anleitung über den Umgang mit Schildern

Anleitung über den Umgang mit Schildern Anleitung über den Umgang mit Schildern -Vorwort -Wo bekommt man Schilder? -Wo und wie speichert man die Schilder? -Wie füge ich die Schilder in meinen Track ein? -Welche Bauteile kann man noch für Schilder

Mehr

Rohstoffanalyse - COT Daten - Gold, Fleischmärkte, Orangensaft, Crude Oil, US Zinsen, S&P500 - KW 07/2009

Rohstoffanalyse - COT Daten - Gold, Fleischmärkte, Orangensaft, Crude Oil, US Zinsen, S&P500 - KW 07/2009 MikeC.Kock Rohstoffanalyse - COT Daten - Gold, Fleischmärkte, Orangensaft, Crude Oil, US Zinsen, S&P500 - KW 07/2009 Zwei Märkte stehen seit Wochen im Mittelpunkt aller Marktteilnehmer? Gold und Crude

Mehr

Meet the Germans. Lerntipp zur Schulung der Fertigkeit des Sprechens. Lerntipp und Redemittel zur Präsentation oder einen Vortrag halten

Meet the Germans. Lerntipp zur Schulung der Fertigkeit des Sprechens. Lerntipp und Redemittel zur Präsentation oder einen Vortrag halten Meet the Germans Lerntipp zur Schulung der Fertigkeit des Sprechens Lerntipp und Redemittel zur Präsentation oder einen Vortrag halten Handreichungen für die Kursleitung Seite 2, Meet the Germans 2. Lerntipp

Mehr

Stammzellentherapien

Stammzellentherapien Können mit Stammzellen Krankheiten wie Autismus, bzw. das Kanner-Syndrom und Asperger behandelt werden? Diese Vorstellung klingt auf den ersten Blick sehr verlockend, doch was verbirgt sich hinter dem

Mehr

Wie oft soll ich essen?

Wie oft soll ich essen? Wie oft soll ich essen? Wie sollen Sie sich als Diabetiker am besten ernähren? Gesunde Ernährung für Menschen mit Diabetes unterscheidet sich nicht von gesunder Ernährung für andere Menschen. Es gibt nichts,

Mehr

Michael Geisler Magnesium Sulfuricum - Epsomit Bittersalz

Michael Geisler Magnesium Sulfuricum - Epsomit Bittersalz Michael Geisler Magnesium Sulfuricum - Epsomit Bittersalz Leseprobe Magnesium Sulfuricum - Epsomit Bittersalz von Michael Geisler Herausgeber: IHHF Verlag http://www.narayana-verlag.de/b3175 Im Narayana

Mehr

Professionelle Seminare im Bereich MS-Office

Professionelle Seminare im Bereich MS-Office Der Name BEREICH.VERSCHIEBEN() ist etwas unglücklich gewählt. Man kann mit der Funktion Bereiche zwar verschieben, man kann Bereiche aber auch verkleinern oder vergrößern. Besser wäre es, die Funktion

Mehr

6 Schulungsmodul: Probenahme im Betrieb

6 Schulungsmodul: Probenahme im Betrieb 6 Schulungsmodul: Probenahme im Betrieb WIEDNER Wie schon im Kapitel VI erwähnt, ist die Probenahme in Betrieben, die Produkte nach dem Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch herstellen oder in den Verkehr

Mehr

Pädagogik. Melanie Schewtschenko. Eingewöhnung und Übergang in die Kinderkrippe. Warum ist die Beteiligung der Eltern so wichtig?

Pädagogik. Melanie Schewtschenko. Eingewöhnung und Übergang in die Kinderkrippe. Warum ist die Beteiligung der Eltern so wichtig? Pädagogik Melanie Schewtschenko Eingewöhnung und Übergang in die Kinderkrippe Warum ist die Beteiligung der Eltern so wichtig? Studienarbeit Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung.2 2. Warum ist Eingewöhnung

Mehr

Anatomie - Histologie. Bindegewebe

Anatomie - Histologie. Bindegewebe Bindegewebe 1 Binde- und Stützgewebe Lockeres Bindegew., Fettgewebe, Knorpel, Knochen 2 Binde- und Stützgewebe Zusammengesetzt aus Bindegewebszellen und größerer Mengen geformter, bzw. ungeformter Interzellularsubstanzen

Mehr

APP-GFP/Fluoreszenzmikroskop. Aufnahmen neuronaler Zellen, mit freund. Genehmigung von Prof. Stefan Kins, TU Kaiserslautern

APP-GFP/Fluoreszenzmikroskop. Aufnahmen neuronaler Zellen, mit freund. Genehmigung von Prof. Stefan Kins, TU Kaiserslautern Über die Herkunft von Aβ42 und Amyloid-Plaques Heute ist sicher belegt, dass sich die amyloiden Plaques aus einer Vielzahl an Abbaufragmenten des Amyloid-Vorläufer-Proteins (amyloid-precursor-protein,

Mehr

Die Theorie der Praxis. Die Welt ist so komplex, dass man sie mittels bloßer Wahrnehmung nicht erfassen kann.

Die Theorie der Praxis. Die Welt ist so komplex, dass man sie mittels bloßer Wahrnehmung nicht erfassen kann. Die Theorie der Praxis Die Welt ist so komplex, dass man sie mittels bloßer Wahrnehmung nicht erfassen kann. Beispiel: Am Rücken liegen Tausende von Nervenzellen und sagen dauernd: Da ist eine Stuhllehne.

Mehr

Verband der TÜV e. V. STUDIE ZUM IMAGE DER MPU

Verband der TÜV e. V. STUDIE ZUM IMAGE DER MPU Verband der TÜV e. V. STUDIE ZUM IMAGE DER MPU 2 DIE MEDIZINISCH-PSYCHOLOGISCHE UNTERSUCHUNG (MPU) IST HOCH ANGESEHEN Das Image der Medizinisch-Psychologischen Untersuchung (MPU) ist zwiespältig: Das ist

Mehr

Leseprobe. Bruno Augustoni. Professionell präsentieren. ISBN (Buch): 978-3-446-44285-6. ISBN (E-Book): 978-3-446-44335-8

Leseprobe. Bruno Augustoni. Professionell präsentieren. ISBN (Buch): 978-3-446-44285-6. ISBN (E-Book): 978-3-446-44335-8 Leseprobe Bruno Augustoni Professionell präsentieren ISBN (Buch): 978-3-446-44285-6 ISBN (E-Book): 978-3-446-44335-8 Weitere Informationen oder Bestellungen unter http://wwwhanser-fachbuchde/978-3-446-44285-6

Mehr

Foliensatz; Arbeitsblatt; Internet. Je nach chemischem Wissen können die Proteine noch detaillierter besprochen werden.

Foliensatz; Arbeitsblatt; Internet. Je nach chemischem Wissen können die Proteine noch detaillierter besprochen werden. 03 Arbeitsauftrag Arbeitsauftrag Ziel: Anhand des Foliensatzes soll die Bildung und der Aufbau des Proteinhormons Insulin erklärt werden. Danach soll kurz erklärt werden, wie man künstlich Insulin herstellt.

Mehr

Motivation im Betrieb

Motivation im Betrieb LUTZ VON ROSENSTIEL Motivation im Betrieb Mit Fallstudien aus der Praxis ROSENBERGER FACHVERLAG LEONBERG IX Vorbemerkung zur 11. Auflage Vorbemerkung zur 10. Auflage Empfehlungen für den Leser Zielsetzung

Mehr

Unterrichtsmaterialien in digitaler und in gedruckter Form. Auszug aus: Lernwerkstatt: Woher kommt der Strom? Das komplette Material finden Sie hier:

Unterrichtsmaterialien in digitaler und in gedruckter Form. Auszug aus: Lernwerkstatt: Woher kommt der Strom? Das komplette Material finden Sie hier: Unterrichtsmaterialien in digitaler und in gedruckter Form Auszug aus: : Woher kommt der Strom? Das komplette Material finden Sie hier: School-Scout.de Inhaltsverzeichnis: Einleitung Seite 4 Kapitel I:

Mehr

Evangelisieren warum eigentlich?

Evangelisieren warum eigentlich? Predigtreihe zum Jahresthema 1/12 Evangelisieren warum eigentlich? Ich evangelisiere aus Überzeugung Gründe, warum wir nicht evangelisieren - Festes Bild von Evangelisation - Negative Erfahrungen von und

Mehr

2.1 Präsentieren wozu eigentlich?

2.1 Präsentieren wozu eigentlich? 2.1 Präsentieren wozu eigentlich? Gute Ideen verkaufen sich in den seltensten Fällen von allein. Es ist heute mehr denn je notwendig, sich und seine Leistungen, Produkte etc. gut zu präsentieren, d. h.

Mehr

Info zum Zusammenhang von Auflösung und Genauigkeit

Info zum Zusammenhang von Auflösung und Genauigkeit Da es oft Nachfragen und Verständnisprobleme mit den oben genannten Begriffen gibt, möchten wir hier versuchen etwas Licht ins Dunkel zu bringen. Nehmen wir mal an, Sie haben ein Stück Wasserrohr mit der

Mehr

Umgang mit Schaubildern am Beispiel Deutschland surft

Umgang mit Schaubildern am Beispiel Deutschland surft -1- Umgang mit Schaubildern am Beispiel Deutschland surft Im Folgenden wird am Beispiel des Schaubildes Deutschland surft eine Lesestrategie vorgestellt. Die Checkliste zur Vorgehensweise kann im Unterricht

Mehr

Was meinen die Leute eigentlich mit: Grexit?

Was meinen die Leute eigentlich mit: Grexit? Was meinen die Leute eigentlich mit: Grexit? Grexit sind eigentlich 2 Wörter. 1. Griechenland 2. Exit Exit ist ein englisches Wort. Es bedeutet: Ausgang. Aber was haben diese 2 Sachen mit-einander zu tun?

Mehr

Die große Wertestudie 2011

Die große Wertestudie 2011 Die große Wertestudie Projektleiter: Studien-Nr.: ppa. Dr. David Pfarrhofer Prof. Dr. Werner Beutelmeyer ZR..P.F/T Diese Studie wurde für die Vinzenz Gruppe durchgeführt Dokumentation der Umfrage ZR..P.F/T:

Mehr

Was ist clevere Altersvorsorge?

Was ist clevere Altersvorsorge? Was ist clevere Altersvorsorge? Um eine gute Altersvorsorge zu erreichen, ist es clever einen unabhängigen Berater auszuwählen Angestellte bzw. Berater von Banken, Versicherungen, Fondsgesellschaften und

Mehr

L10N-Manager 3. Netzwerktreffen der Hochschulübersetzer/i nnen Mannheim 10. Mai 2016

L10N-Manager 3. Netzwerktreffen der Hochschulübersetzer/i nnen Mannheim 10. Mai 2016 L10N-Manager 3. Netzwerktreffen der Hochschulübersetzer/i nnen Mannheim 10. Mai 2016 Referentin: Dr. Kelly Neudorfer Universität Hohenheim Was wir jetzt besprechen werden ist eine Frage, mit denen viele

Mehr

Studieren- Erklärungen und Tipps

Studieren- Erklärungen und Tipps Studieren- Erklärungen und Tipps Es gibt Berufe, die man nicht lernen kann, sondern für die man ein Studium machen muss. Das ist zum Beispiel so wenn man Arzt oder Lehrer werden möchte. Hat ihr Kind das

Mehr

Copyright Sophie Streit / Filzweiber /www.filzweiber.at. Fertigung eines Filzringes mit Perlen!

Copyright Sophie Streit / Filzweiber /www.filzweiber.at. Fertigung eines Filzringes mit Perlen! Fertigung eines Filzringes mit Perlen! Material und Bezugsquellen: Ich arbeite ausschließlich mit Wolle im Kardenband. Alle Lieferanten die ich hier aufliste haben nat. auch Filzzubehör. Zu Beginn möchtest

Mehr

Barrierefreie Webseiten erstellen mit TYPO3

Barrierefreie Webseiten erstellen mit TYPO3 Barrierefreie Webseiten erstellen mit TYPO3 Alternativtexte Für jedes Nicht-Text-Element ist ein äquivalenter Text bereitzustellen. Dies gilt insbesondere für Bilder. In der Liste der HTML 4-Attribute

Mehr

Chemotherapie -ein Bilderbuch für Kinder

Chemotherapie -ein Bilderbuch für Kinder Chemotherapie -ein Bilderbuch für Kinder Unser Körper besteht aus verschiedenen Zellen, die ganz unterschiedlich aussehen. Jede Art erfüllt eine besondere Aufgabe. Da gibt es zum Beispiel Gehirnzellen,

Mehr

Information zum Projekt. Mitwirkung von Menschen mit Demenz in ihrem Stadtteil oder Quartier

Information zum Projekt. Mitwirkung von Menschen mit Demenz in ihrem Stadtteil oder Quartier Information zum Projekt Mitwirkung von Menschen mit Demenz in ihrem Stadtteil oder Quartier Sehr geehrte Dame, sehr geehrter Herr Wir führen ein Projekt durch zur Mitwirkung von Menschen mit Demenz in

Mehr

Eva Douma: Die Vorteile und Nachteile der Ökonomisierung in der Sozialen Arbeit

Eva Douma: Die Vorteile und Nachteile der Ökonomisierung in der Sozialen Arbeit Eva Douma: Die Vorteile und Nachteile der Ökonomisierung in der Sozialen Arbeit Frau Dr. Eva Douma ist Organisations-Beraterin in Frankfurt am Main Das ist eine Zusammen-Fassung des Vortrages: Busines

Mehr

ONLINE-AKADEMIE. "Diplomierter NLP Anwender für Schule und Unterricht" Ziele

ONLINE-AKADEMIE. Diplomierter NLP Anwender für Schule und Unterricht Ziele ONLINE-AKADEMIE Ziele Wenn man von Menschen hört, die etwas Großartiges in ihrem Leben geleistet haben, erfahren wir oft, dass diese ihr Ziel über Jahre verfolgt haben oder diesen Wunsch schon bereits

Mehr

Was kann ich jetzt? von P. G.

Was kann ich jetzt? von P. G. Was kann ich jetzt? von P. G. Ich bin zwar kein anderer Mensch geworden, was ich auch nicht wollte. Aber ich habe mehr Selbstbewusstsein bekommen, bin mutiger in vielen Lebenssituationen geworden und bin

Mehr

Es gilt das gesprochene Wort. Anrede

Es gilt das gesprochene Wort. Anrede Sperrfrist: 28. November 2007, 13.00 Uhr Es gilt das gesprochene Wort Statement des Staatssekretärs im Bayerischen Staatsministerium für Unterricht und Kultus, Karl Freller, anlässlich des Pressegesprächs

Mehr

Kurzanleitung. MEYTON Aufbau einer Internetverbindung. 1 Von 11

Kurzanleitung. MEYTON Aufbau einer Internetverbindung. 1 Von 11 Kurzanleitung MEYTON Aufbau einer Internetverbindung 1 Von 11 Inhaltsverzeichnis Installation eines Internetzugangs...3 Ist mein Router bereits im MEYTON Netzwerk?...3 Start des YAST Programms...4 Auswahl

Mehr

Kurzeinweisung. WinFoto Plus

Kurzeinweisung. WinFoto Plus Kurzeinweisung WinFoto Plus Codex GmbH Stand 2012 Inhaltsverzeichnis Einleitung... 3 Allgemeines... 4 Vorbereitungen... 4 Drucken des Baustellenblatts im Projekt... 4 Drucken des Barcodes auf dem Arbeitsauftrag

Mehr

Lernerfolge sichern - Ein wichtiger Beitrag zu mehr Motivation

Lernerfolge sichern - Ein wichtiger Beitrag zu mehr Motivation Lernerfolge sichern - Ein wichtiger Beitrag zu mehr Motivation Einführung Mit welchen Erwartungen gehen Jugendliche eigentlich in ihre Ausbildung? Wir haben zu dieser Frage einmal die Meinungen von Auszubildenden

Mehr

FAQ Spielvorbereitung Startspieler: Wer ist Startspieler?

FAQ Spielvorbereitung Startspieler: Wer ist Startspieler? FAQ Spielvorbereitung Startspieler: Wer ist Startspieler? In der gedruckten Version der Spielregeln steht: der Startspieler ist der Spieler, dessen Arena unmittelbar links neben dem Kaiser steht [im Uhrzeigersinn].

Mehr

DAS PARETO PRINZIP DER SCHLÜSSEL ZUM ERFOLG

DAS PARETO PRINZIP DER SCHLÜSSEL ZUM ERFOLG DAS PARETO PRINZIP DER SCHLÜSSEL ZUM ERFOLG von Urs Schaffer Copyright by Urs Schaffer Schaffer Consulting GmbH Basel www.schaffer-consulting.ch Info@schaffer-consulting.ch Haben Sie gewusst dass... >

Mehr

Was ich als Bürgermeister für Lübbecke tun möchte

Was ich als Bürgermeister für Lübbecke tun möchte Wahlprogramm in leichter Sprache Was ich als Bürgermeister für Lübbecke tun möchte Hallo, ich bin Dirk Raddy! Ich bin 47 Jahre alt. Ich wohne in Hüllhorst. Ich mache gerne Sport. Ich fahre gerne Ski. Ich

Mehr

IT-Governance und Social, Mobile und Cloud Computing: Ein Management Framework... Bachelorarbeit

IT-Governance und Social, Mobile und Cloud Computing: Ein Management Framework... Bachelorarbeit IT-Governance und Social, Mobile und Cloud Computing: Ein Management Framework... Bachelorarbeit zur Erlangung des akademischen Grades Bachelor of Science (B.Sc.) im Studiengang Wirtschaftswissenschaft

Mehr

Adobe Photoshop. Lightroom 5 für Einsteiger Bilder verwalten und entwickeln. Sam Jost

Adobe Photoshop. Lightroom 5 für Einsteiger Bilder verwalten und entwickeln. Sam Jost Adobe Photoshop Lightroom 5 für Einsteiger Bilder verwalten und entwickeln Sam Jost Kapitel 2 Der erste Start 2.1 Mitmachen beim Lesen....................... 22 2.2 Für Apple-Anwender.........................

Mehr

Dow Jones am 13.06.08 im 1-min Chat

Dow Jones am 13.06.08 im 1-min Chat Dow Jones am 13.06.08 im 1-min Chat Dieser Ausschnitt ist eine Formation: Wechselstäbe am unteren Bollinger Band mit Punkt d über dem 20-er GD nach 3 tieferen Hoch s. Wenn ich einen Ausbruch aus Wechselstäben

Mehr

SUPERABSORBER. Eine Präsentation von Johannes Schlüter und Thomas Luckert

SUPERABSORBER. Eine Präsentation von Johannes Schlüter und Thomas Luckert SUPERABSORBER Eine Präsentation von Johannes Schlüter und Thomas Luckert Inhalt: Die Windel Die Technik des Superabsorbers Anwendungsgebiete des Superabsorbers Ein kurzer Abriss aus der Geschichte der

Mehr

geben. Die Wahrscheinlichkeit von 100% ist hier demnach nur der Gehen wir einmal davon aus, dass die von uns angenommenen

geben. Die Wahrscheinlichkeit von 100% ist hier demnach nur der Gehen wir einmal davon aus, dass die von uns angenommenen geben. Die Wahrscheinlichkeit von 100% ist hier demnach nur der Vollständigkeit halber aufgeführt. Gehen wir einmal davon aus, dass die von uns angenommenen 70% im Beispiel exakt berechnet sind. Was würde

Mehr

WEGWEISER ZUR EINLAGERUNG VON NABELSCHNURBLUT UND -GEWEBE

WEGWEISER ZUR EINLAGERUNG VON NABELSCHNURBLUT UND -GEWEBE WEGWEISER ZUR EINLAGERUNG VON NABELSCHNURBLUT UND -GEWEBE Nabelschnurblut ist wertvoll! Wenn sich Eltern dafür entscheiden, das Nabelschnurblut ihres Kindes aufzubewahren, können sie damit dem Kind selbst,

Mehr

Arbeiten Sie gerne für die Ablage?

Arbeiten Sie gerne für die Ablage? University of Applied Sciences Arbeiten Sie gerne für die Ablage? Ihr Studium kommt nun in die Schlussphase, denn Sie haben sich gerade zur Abschlussarbeit angemeldet. Auch wenn das Ende Ihres Studiums

Mehr

Grünes Wahlprogramm in leichter Sprache

Grünes Wahlprogramm in leichter Sprache Grünes Wahlprogramm in leichter Sprache Liebe Mitbürgerinnen und Mitbürger, Baden-Württemberg ist heute besser als früher. Baden-Württemberg ist modern. Und lebendig. Tragen wir Grünen die Verantwortung?

Mehr

Kulturelle Evolution 12

Kulturelle Evolution 12 3.3 Kulturelle Evolution Kulturelle Evolution Kulturelle Evolution 12 Seit die Menschen Erfindungen machen wie z.b. das Rad oder den Pflug, haben sie sich im Körperbau kaum mehr verändert. Dafür war einfach

Mehr

Diagnostisches Interview zur Bruchrechnung

Diagnostisches Interview zur Bruchrechnung Diagnostisches Interview zur Bruchrechnung (1) Tortendiagramm Zeigen Sie der Schülerin/dem Schüler das Tortendiagramm. a) Wie groß ist der Teil B des Kreises? b) Wie groß ist der Teil D des Kreises? (2)

Mehr

WIE WIRKLICH IST DIE WIRKLICHKEIT WIE SCHNELL WERDEN SMART GRIDS WIRKLICH BENÖTIGT? DI Dr.techn. Thomas Karl Schuster Wien Energie Stromnetz GmbH

WIE WIRKLICH IST DIE WIRKLICHKEIT WIE SCHNELL WERDEN SMART GRIDS WIRKLICH BENÖTIGT? DI Dr.techn. Thomas Karl Schuster Wien Energie Stromnetz GmbH WIE WIRKLICH IST DIE WIRKLICHKEIT WIE SCHNELL WERDEN SMART GRIDS WIRKLICH BENÖTIGT? DI Dr.techn. Thomas Karl Schuster Wien Energie Stromnetz GmbH Agenda Einleitung Historisches zum Thema Smart Definitionen

Mehr

Datensicherung. Beschreibung der Datensicherung

Datensicherung. Beschreibung der Datensicherung Datensicherung Mit dem Datensicherungsprogramm können Sie Ihre persönlichen Daten problemlos Sichern. Es ist möglich eine komplette Datensicherung durchzuführen, aber auch nur die neuen und geänderten

Mehr

Dritte Generation Ostdeutschland Perspektiven zu Arbeit und Leben Zukunft Heimat Traumpalast Mittelherwigsdorf am 28.

Dritte Generation Ostdeutschland Perspektiven zu Arbeit und Leben Zukunft Heimat Traumpalast Mittelherwigsdorf am 28. Dritte Generation Ostdeutschland Perspektiven zu Arbeit und Leben Zukunft Heimat Traumpalast Mittelherwigsdorf am 28. Dezember 2013 4. Zukunftswinternacht Leben Lieben Arbeiten Lebenswelten im Wandel vor

Mehr

Die Notare. Reform des Zugewinnausgleichsrechts

Die Notare. Reform des Zugewinnausgleichsrechts Die Notare informieren Reform des Zugewinnausgleichsrechts Dr. Martin Kretzer & Dr. Matthias Raffel Großer Markt 28 66740 Saarlouis Telefon 06831/ 94 98 06 und 42042 Telefax 06831/ 4 31 80 2 Info-Brief

Mehr

TSG Gesundheitsmanagement - auch die längste Reise beginnt mit dem ersten Schritt. Thomas Zimmermann 22. März 2011

TSG Gesundheitsmanagement - auch die längste Reise beginnt mit dem ersten Schritt. Thomas Zimmermann 22. März 2011 TSG Gesundheitsmanagement - auch die längste Reise beginnt mit dem ersten Schritt Thomas Zimmermann 22. März 2011 Agenda Das sind wir die Tankstellen Support GmbH So fing alles an Wie viel Veränderung

Mehr

1 topologisches Sortieren

1 topologisches Sortieren Wolfgang Hönig / Andreas Ecke WS 09/0 topologisches Sortieren. Überblick. Solange noch Knoten vorhanden: a) Suche Knoten v, zu dem keine Kante führt (Falls nicht vorhanden keine topologische Sortierung

Mehr

Freuen Sie sich auf ein. Plus an Lebensqualität. Nie wieder eine lockere Zahnprothese!

Freuen Sie sich auf ein. Plus an Lebensqualität. Nie wieder eine lockere Zahnprothese! Freuen Sie sich auf ein Plus an Lebensqualität. Nie wieder eine lockere Zahnprothese! Sitzt Ihre Zahnprothese absolut fest und sicher? Oder leiden Sie vielleicht darunter, dass Ihre Dritten wackeln Fühlen

Mehr

Alles, was Sie über unsere Augenbehandlungen wissen sollten

Alles, was Sie über unsere Augenbehandlungen wissen sollten Alles, was Sie über unsere Augenbehandlungen wissen sollten Korbinian Kofler hat sich bei Memira behandeln lassen. Jetzt beginnt mein neues Leben ohne Brille und Kontaktlinsen! Der sichere Weg zu einem

Mehr

Sowohl die Malstreifen als auch die Neperschen Streifen können auch in anderen Stellenwertsystemen verwendet werden.

Sowohl die Malstreifen als auch die Neperschen Streifen können auch in anderen Stellenwertsystemen verwendet werden. Multiplikation Die schriftliche Multiplikation ist etwas schwieriger als die Addition. Zum einen setzt sie das kleine Einmaleins voraus, zum anderen sind die Überträge, die zu merken sind und häufig in

Mehr

Übungsaufgaben Prozentrechnung und / oder Dreisatz

Übungsaufgaben Prozentrechnung und / oder Dreisatz Übungsaufgaben Prozentrechnung und / oder Dreisatz 1. Bei der Wahl des Universitätssprechers wurden 800 gültige Stimmen abgegeben. Die Stimmen verteilten sich so auf die drei Kandidat/innen: A bekam 300,

Mehr

Hilfedatei der Oden$-Börse Stand Juni 2014

Hilfedatei der Oden$-Börse Stand Juni 2014 Hilfedatei der Oden$-Börse Stand Juni 2014 Inhalt 1. Einleitung... 2 2. Die Anmeldung... 2 2.1 Die Erstregistrierung... 3 2.2 Die Mitgliedsnummer anfordern... 4 3. Die Funktionen für Nutzer... 5 3.1 Arbeiten

Mehr

Welchen Weg nimmt Ihr Vermögen. Unsere Leistung zu Ihrer Privaten Vermögensplanung. Wir machen aus Zahlen Werte

Welchen Weg nimmt Ihr Vermögen. Unsere Leistung zu Ihrer Privaten Vermögensplanung. Wir machen aus Zahlen Werte Welchen Weg nimmt Ihr Vermögen Unsere Leistung zu Ihrer Privaten Vermögensplanung Wir machen aus Zahlen Werte Ihre Fragen Ich schwimme irgendwie in meinen Finanzen, ich weiß nicht so genau wo ich stehe

Mehr

Persönliche Zukunftsplanung mit Menschen, denen nicht zugetraut wird, dass sie für sich selbst sprechen können Von Susanne Göbel und Josef Ströbl

Persönliche Zukunftsplanung mit Menschen, denen nicht zugetraut wird, dass sie für sich selbst sprechen können Von Susanne Göbel und Josef Ströbl Persönliche Zukunftsplanung mit Menschen, denen nicht zugetraut Von Susanne Göbel und Josef Ströbl Die Ideen der Persönlichen Zukunftsplanung stammen aus Nordamerika. Dort werden Zukunftsplanungen schon

Mehr

Gutes Leben was ist das?

Gutes Leben was ist das? Lukas Bayer Jahrgangsstufe 12 Im Hirschgarten 1 67435 Neustadt Kurfürst-Ruprecht-Gymnasium Landwehrstraße22 67433 Neustadt a. d. Weinstraße Gutes Leben was ist das? Gutes Leben für alle was genau ist das

Mehr

Alle Schlüssel-Karten (blaue Rückseite) werden den Schlüssel-Farben nach sortiert und in vier getrennte Stapel mit der Bildseite nach oben gelegt.

Alle Schlüssel-Karten (blaue Rückseite) werden den Schlüssel-Farben nach sortiert und in vier getrennte Stapel mit der Bildseite nach oben gelegt. Gentlemen", bitte zur Kasse! Ravensburger Spiele Nr. 01 264 0 Autoren: Wolfgang Kramer und Jürgen P. K. Grunau Grafik: Erhard Dietl Ein Gaunerspiel für 3-6 Gentlemen" ab 10 Jahren Inhalt: 35 Tresor-Karten

Mehr

WAS finde ich WO im Beipackzettel

WAS finde ich WO im Beipackzettel WAS finde ich WO im Beipackzettel Sie haben eine Frage zu Ihrem? Meist finden Sie die Antwort im Beipackzettel (offiziell "Gebrauchsinformation" genannt). Der Aufbau der Beipackzettel ist von den Behörden

Mehr

Insiderwissen 2013. Hintergrund

Insiderwissen 2013. Hintergrund Insiderwissen 213 XING EVENTS mit der Eventmanagement-Software für Online Eventregistrierung &Ticketing amiando, hat es sich erneut zur Aufgabe gemacht zu analysieren, wie Eventveranstalter ihre Veranstaltungen

Mehr

Projektmanagement in der Spieleentwicklung

Projektmanagement in der Spieleentwicklung Projektmanagement in der Spieleentwicklung Inhalt 1. Warum brauche ich ein Projekt-Management? 2. Die Charaktere des Projektmanagement - Mastermind - Producer - Projektleiter 3. Schnittstellen definieren

Mehr

Platinen mit dem HP CLJ 1600 direkt bedrucken ohne Tonertransferverfahren

Platinen mit dem HP CLJ 1600 direkt bedrucken ohne Tonertransferverfahren Platinen mit dem HP CLJ 1600 direkt bedrucken ohne Tonertransferverfahren Um die Platinen zu bedrucken, muß der Drucker als allererstes ein wenig zerlegt werden. Obere und seitliche Abdeckungen entfernen:

Mehr

Offen für Neues. Glas im Innenbereich.

Offen für Neues. Glas im Innenbereich. Offen für Neues. Glas im Innenbereich. Leichtigkeit durch Transparenz. Innovative Glasanwendungen im Innenbereich Glas ist einzigartig. Denn kein anderes Material ist in der Lage, Räume mit Licht zu gestalten

Mehr

Letzte Krankenkassen streichen Zusatzbeiträge

Letzte Krankenkassen streichen Zusatzbeiträge Zusatzbeiträge - Gesundheitsfonds Foto: D. Claus Einige n verlangten 2010 Zusatzbeiträge von ihren Versicherten. Die positive wirtschaftliche Entwicklung im Jahr 2011 ermöglichte den n die Rücknahme der

Mehr

WAS TUN BEI ANGST & DEPRESSION? von. Hans Kottke

WAS TUN BEI ANGST & DEPRESSION? von. Hans Kottke Hans Kottke Blasiusstr.10 38114, Braunschweig mail@hanskottke.de ca. 701 Wörter WAS TUN BEI ANGST & DEPRESSION? von Hans Kottke Mai 2012 Die Ausgangslage Kottke / Was tun bei Angst & Depression / 2 Es

Mehr

Ziel- und Qualitätsorientierung. Fortbildung für die Begutachtung in Verbindung mit dem Gesamtplanverfahren nach 58 SGB XII

Ziel- und Qualitätsorientierung. Fortbildung für die Begutachtung in Verbindung mit dem Gesamtplanverfahren nach 58 SGB XII Ziel- und Qualitätsorientierung Fortbildung für die Begutachtung in Verbindung mit dem Gesamtplanverfahren nach 58 SGB XII Qualität? In der Alltagssprache ist Qualität oft ein Ausdruck für die Güte einer

Mehr

Leichte-Sprache-Bilder

Leichte-Sprache-Bilder Leichte-Sprache-Bilder Reinhild Kassing Information - So geht es 1. Bilder gucken 2. anmelden für Probe-Bilder 3. Bilder bestellen 4. Rechnung bezahlen 5. Bilder runterladen 6. neue Bilder vorschlagen

Mehr

Psychologie im Arbeitsschutz

Psychologie im Arbeitsschutz Fachvortrag zur Arbeitsschutztagung 2014 zum Thema: Psychologie im Arbeitsschutz von Dipl. Ing. Mirco Pretzel 23. Januar 2014 Quelle: Dt. Kaltwalzmuseum Hagen-Hohenlimburg 1. Einleitung Was hat mit moderner

Mehr

Mehr Transparenz für optimalen Durchblick. Mit dem TÜV Rheinland Prüfzeichen.

Mehr Transparenz für optimalen Durchblick. Mit dem TÜV Rheinland Prüfzeichen. Mehr Transparenz für optimalen Durchblick. Mit dem TÜV Rheinland Prüfzeichen. Immer schon ein gutes Zeichen. Das TÜV Rheinland Prüfzeichen. Es steht für Sicherheit und Qualität. Bei Herstellern, Handel

Mehr

Neugier und Weiterbildung

Neugier und Weiterbildung 67 Nichts kommt ohne Interesse zustande. Georg Friedrich Wilhelm Hegel 69 wissen Warum braucht ein Unternehmen neugierige Mitarbeiter? Neugier birgt vor allem einen großen Antriebseffekt. Und: Sie hört

Mehr

Nina. bei der Hörgeräte-Akustikerin. Musterexemplar

Nina. bei der Hörgeräte-Akustikerin. Musterexemplar Nina bei der Hörgeräte-Akustikerin Nina bei der Hörgeräte-Akustikerin Herausgeber: uphoff pr-consulting Alfred-Wegener-Str. 6 35039 Marburg Tel.: 0 64 21 / 4 07 95-0 info@uphoff-pr.de www.uphoff-pr.de

Mehr

Erst Lesen dann Kaufen

Erst Lesen dann Kaufen Erst Lesen dann Kaufen ebook Das Geheimnis des Geld verdienens Wenn am Ende des Geldes noch viel Monat übrig ist - so geht s den meisten Leuten. Sind Sie in Ihrem Job zufrieden - oder würden Sie lieber

Mehr

Albert HAYR Linux, IT and Open Source Expert and Solution Architect. Open Source professionell einsetzen

Albert HAYR Linux, IT and Open Source Expert and Solution Architect. Open Source professionell einsetzen Open Source professionell einsetzen 1 Mein Background Ich bin überzeugt von Open Source. Ich verwende fast nur Open Source privat und beruflich. Ich arbeite seit mehr als 10 Jahren mit Linux und Open Source.

Mehr

1: 9. Hamburger Gründerpreis - Kategorie Existenzgründer - 08.09.2010 19:00 Uhr

1: 9. Hamburger Gründerpreis - Kategorie Existenzgründer - 08.09.2010 19:00 Uhr 1: 9. Hamburger Gründerpreis - Kategorie Existenzgründer - Sehr geehrter Herr Bürgermeister, sehr geehrter Herr Dr. Vogelsang, sehr geehrter Herr Strunz, und meine sehr geehrte Damen und Herren, meine

Mehr

Der ohne sachlichen Grund befristete Arbeitsvertrag

Der ohne sachlichen Grund befristete Arbeitsvertrag Der ohne sachlichen Grund befristete Arbeitsvertrag 1. Allgemeines Die Befristung von Arbeitsverträgen ist im Teilzeit- und Befristungsgesetz (TzBfG) geregelt. Zu unterscheiden sind Befristungen des Arbeitsverhältnisses

Mehr

Berechnung der Erhöhung der Durchschnittsprämien

Berechnung der Erhöhung der Durchschnittsprämien Wolfram Fischer Berechnung der Erhöhung der Durchschnittsprämien Oktober 2004 1 Zusammenfassung Zur Berechnung der Durchschnittsprämien wird das gesamte gemeldete Prämienvolumen Zusammenfassung durch die

Mehr

in vivo -- Das Magazin der Deutschen Krebshilfe vom 09.11.2010

in vivo -- Das Magazin der Deutschen Krebshilfe vom 09.11.2010 Seite 1/5 in vivo -- Das Magazin der Deutschen Krebshilfe vom 09.11.2010 Expertengespräch zum Thema Retinoblastom Und zu diesem Thema begrüße ich jetzt Professor Norbert Bornfeld, Direktor des Zentrums

Mehr

Informationsblatt Induktionsbeweis

Informationsblatt Induktionsbeweis Sommer 015 Informationsblatt Induktionsbeweis 31. März 015 Motivation Die vollständige Induktion ist ein wichtiges Beweisverfahren in der Informatik. Sie wird häufig dazu gebraucht, um mathematische Formeln

Mehr

- mit denen Sie Ihren Konfliktgegner in einen Lösungspartner verwandeln

- mit denen Sie Ihren Konfliktgegner in einen Lösungspartner verwandeln 3 magische Fragen - mit denen Sie Ihren Konfliktgegner in einen Lösungspartner verwandeln Dipl.-Psych. Linda Schroeter Manchmal ist es wirklich zum Verzweifeln! Der Mensch, mit dem wir viel zu Regeln,

Mehr

Wilfried Ströver - Entspannungstechniken, Meditation und Qigong was ist gleich, was unterscheidet sie? - 2012

Wilfried Ströver - Entspannungstechniken, Meditation und Qigong was ist gleich, was unterscheidet sie? - 2012 1 Inhaltsverzeichnis Die Fragestellung Seite 1 Entspannungstechniken Seite 1 Meditation Seite 2 Qigong Seite 3 Tabellarische Zusammenfassung Seite 4 Schlusswort Seite 4 Literaturhinweise Seite 4 Die Fragestellung

Mehr

Lernwerkstatt 9 privat- Freischaltung

Lernwerkstatt 9 privat- Freischaltung Was tun, wenn mein Rechner immer wieder die Freischaltung der Lernwerkstatt 9 privat verliert und ich die Ursache dafür nicht finden kann? Normalerweise genügt es, genau eine einzige online-freischaltung

Mehr

FAQ 04/2015. Auswirkung der ISO 14119 auf 3SE53/3SF13 Positionsschalter. https://support.industry.siemens.com/cs/ww/de/view/109475921

FAQ 04/2015. Auswirkung der ISO 14119 auf 3SE53/3SF13 Positionsschalter. https://support.industry.siemens.com/cs/ww/de/view/109475921 FAQ 04/2015 Auswirkung der ISO 14119 auf 3SE53/3SF13 Positionsschalter mit https://support.industry.siemens.com/cs/ww/de/view/109475921 Dieser Beitrag stammt aus dem Siemens Industry Online Support. Es

Mehr

Unterrichtsmaterialien in digitaler und in gedruckter Form. Auszug aus: Lernwerkstatt: Chemie um uns herum. Das komplette Material finden Sie hier:

Unterrichtsmaterialien in digitaler und in gedruckter Form. Auszug aus: Lernwerkstatt: Chemie um uns herum. Das komplette Material finden Sie hier: Unterrichtsmaterialien in digitaler und in gedruckter Form Auszug aus: : Chemie um uns herum Das komplette Material finden Sie hier: Download bei School-Scout.de Inhaltsverzeichnis: Dieter Schütz / pixelio.de

Mehr