Inhaltsverzeichnis XIII. Vorwort zur 1. Auflage. Vorwort zur 2. Auflage XVII. Autorenliste XXI. Glossar. Einführung 1
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1 O:/Wiley/Thiemann/3d/ftoc.3d from :50:09 V Vorwort zur 1. Auflage Vorwort zur 2. Auflage XIII XV Autorenliste XVII Glossar XXI Einführung 1 Teil I Allgemeine Grundlagen und Präanalytik 3 1 Grundlagen der molekularen Diagnostik 5 Frank Thiemann 1.1 Die DNA Die RNA DNA-Replikation Das Gen Genomorganisation bei Prokaryonten Genomorganisation bei Eukaryonten Die Proteinbiosynthese Die Transkription Die 5 -Cap-Struktur (Capping) Der Poly(A)-Schwanz Spleißen von RNA Die Translation Der genetische Code Transfer-RNA Die Ribosomen Der Beginn der Proteinsynthese Das Protein entsteht Das Ende der Translation Grundbegriffe in der molekularen Diagnostik 30
2 O:/Wiley/Thiemann/3d/ftoc.3d from :50:10 VI Inzidenz Prävalenz Mortalität Letalität Goldstandard Richtigkeit und Präzision Sensitivität und Spezifität Klinische Sensitivität Analytische Sensitivität Klinische Spezifität Analytische Spezifität Prädiktiver Wert 34 2 Präanalytik in der molekularen Diagnostik 37 Frank Thiemann 2.1 Administrative Maßnahmen Probengewinnung Zeitpunkt der Probengewinnung Proben- und Transportröhrchen Hinweise zu Transport und Verpackung Kategorie A UN Kategorie B UN Freigestellte medizinische Proben Präanalytische Schritte im Labor Räumliche Voraussetzungen Vollautomatische Analysesysteme 49 Teil II Methoden 51 3 Isolierung von Nukleinsäuren 53 Edgar Setzke und Hans Nitschko 3.1 Einleitung Die Probenvorbereitung Der Zellaufschluss in Abhängigkeit des Probenmaterials und der zu isolierenden Nukleinsäure Isolierung von DNA Phenol/Chloroform-Extraktion Silikamembranen oder mit Silika beschichtete Oberflächen (magnetische Partikel) Anionenaustauscher-Säulen Isolierung von RNA Isolierung von Virus-RNA Isolierung von zellulärer RNA Manuelle und automatisierte Systeme zur Nukleinsäureisolierung in der molekularen Diagnostik 65
3 O:/Wiley/Thiemann/3d/ftoc.3d from :50:10 VII Manuelle Extraktionssysteme Automatisierte Extraktionssysteme Magnetische Beads Überprüfung der Menge, Reinheit und Qualität von RNA und DNA Photometrische Bestimmung der Nukleinsäure [Menge/(Reinheit)] Abschätzung der DNA-Menge durch Gelelektrophorese und Anfärbung mit Ethidiumbromid oder anderen Farbstoffen [Menge/(Qualität)] Bioanalyzer [Menge/Qualität] Spotmethode [Menge] DNA/Zellzahlbestimmung durch PCR genomischer Sequenzen [Menge] Lagerung der isolierten RNA/DNA Lagerung von Standards 78 4 Amplifikation und Detektion von Nukleinsäuren 79 Stefan Lorkowski, Ofert Landt, Carsten Tiemann, Michael Weizenegger, Ulrich Eigner, Charlotte Sager, Frank Thiemann und Paul M. Cullen 4.1 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Geschichtlicher Hintergrund Das Prinzip der PCR Die Komponenten der PCR Die DNA-Polymerasen Die Nukleotide Der PCR-Puffer Die Primer und ihr Design Anforderungen an das Ausgangsmaterial PCR-Zusätze Weitere PCR-Methoden RT-PCR: Die Amplifikation von RNA mittels PCR Die Nested-PCR: Erhöhen der Sensitivität der PCR Touchdown-PCR: Vermeiden der Amplifikation von Nebenprodukten Entwicklung (Design) von Real time-pcr Assays: Primerauswahl und Sonden Grundsätze Primer Sonden Farbstoffe und Multiplex-PCR Kriterien der Leistungsbewertung Detektion von PCR-Produkten Agarosegelelektrophorese Chip-Elektrophorese (Lab-on-a-Chip) 109
4 O:/Wiley/Thiemann/3d/ftoc.3d from :50:10 VIII PCR-ELISA und partikelbasierte Detektion Reverse Hybridisierung Prinzip Anwendung Qualitätssicherung Ausblick HyBeacon-Technologie Allgemeines Verfahren Anwendungen Real time-pcr Interkalierende Farbstoffe (SYBR) TaqMan-Sonden Dark Quencher (BHQ, black hole quencher) MGB-Sonden (minor grove binder) Molecular Beacons Modifizierte Oligonukleotidbausteine Hybridisierungsproben Scorpion-Primer Schmelzpunktanalytik High Resolution Melt (HRM) Miniaturisierte Technik Quantitative PCR Absolute Quantifizierung Relative Quantifizierung Dual Target Digitale PCR (dpcr) Multiplex-PCR Mit Dual Priming -Oligonukleotiden der Multiplex-PCR auf die Sprünge helfen MLPA als Werkzeug für die Multiplex-PCR Wenn es etwas mehr sein soll: Multiplex-PCR mit Luminex Multiplex-PCR: Die Qual der Wahl Weitere Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren DNA-Sonden-Assays (Gensonden) Transcription-Mediated Amplifikation (TMA) Hybridization Protection Assay (HPA) Nucleic Acid Sequence based Amplifikation (NASBA) Strand-Displacement Amplification (SDA) Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Massenspektrometrie als neue Option Das Prinzip Massenspektrometrie im PCR-Labor Die Target-Regionen und ihre Analyse Der Einsatz im Routinelabor 169
5 O:/Wiley/Thiemann/3d/ftoc.3d from :50:11 IX 4.7 DNA-Mikroarrays DNA-Sequenzierung 173 Andre Frontzek 5.1 DNA-Sequenzierung nach Sanger Pyrosequenzierung Minisequenzierung Sequenzierung mit Mikroarrays Sequenzierung die nächste Generation Die Zukunft der Sequenzierung 191 Teil III Indikationen Indikationen für die molekulare Diagnostik 195 Holger F. Rabenau, Udo Reischl, Uwe Lang, Matthias Aymanns, Tim Hagedorn, Kim Koop, Jana Schröder und Andreas Uekötter 6.1 Erkrankungen durch Viren Erkrankungen durch Bakterien, Pilze und Parasiten Molekulare Methoden in der Krankenhaushygiene Bedeutung der Krankenhaushygiene in Deutschland Gesetzliche Rahmenbedingungen Molekularbiologische Erregersuchtests MRSA-Screening MRGN-Screening Molekulare Typisierungsmethoden in der Krankenhaushygiene Pulsfeldgelelektrophorese Spa-Typisierung Charakteristika genotypischer Typisierungsverfahren Humangenetik 235 Hanns-Georg Klein, Imma Rost, Christoph Marschall, Karin Mayer, Sebastian Eck, Ina Vogl, Christina Sofeso, Camilla Ladinig, Wolfgang Rupprecht, Paul M. Cullen, Brigitte Welling, Uwe Heinrich, Annett Wagner, Tanja Hinrichsen, Thomas Harasim und Birgit Busse 7.1 Klinische Genetik Gesetzliche Rahmenbedingungen Genetische Beratung Erbgänge Autosomal-dominanter Erbgang Autosomal-rezessiver Erbgang X-chromosomal-rezessiver Erbgang Weitere Erbgänge Molekulargenetik Monogene Erkrankungen Next Generation Sequencing in der Diagnostik 247
6 O:/Wiley/Thiemann/3d/ftoc.3d from :50:11 X 7.3 Prädispositionsdiagnostik Prädispositionsdiagnostik für polygene Erkrankungen Faktor V-Leiden Die G20120A-Mutation in Faktor II (Prothrombin)-Gen C677T-Polymorphismus im Gen für Methylentetrahydrofolatreduktase (MTHFR) G/5G-Polymorphismus im Promoter des Plasminogen Aktivator Inhibitor 1-Gens Hämochromatosediagnostik Polymorphismusdiagnostik bei arteriosklerotischen Erkrankungen Laktoseintoleranz C/T-Polymorphismus im Laktasegen Hereditäre Fruktoseintoleranz Klassische und molekulare Zytogenetik Postnataldiagnostik Pränataldiagnostik Tumorzytogenetik Molekulare Zytogenetik Fluoreszenz in situ-hybridisierung (FISH) Molekulare Karyotypisierung (chromosomale Mikroarray- Analysen, CMA) Nicht invasiver Pränataltest (NIPT) Reproduktionsgenetik Polkörperdiagnostik Präimplantationsdiagnostik Eizellbefruchtung und frühe Embryonalentwicklung Indikationen für die Polkörperdiagnostik (PKD) Indikationen für die Präimplantationsdiagnostik (PID) Herausforderungen bei Durchführung einer PKD oder PID Pharmakogenetik Verstoffwechselung von Arzneimitteln Transportproteine Pharmakogenetik in der Routinediagnostik Abstammungsanalysen Gesetzliche Grundlagen Weitere Anwendungen von Mikrosatellitenanalysen Immungenetik und Transfusionsmedizin 291 Hannah Rabenstein, Kristin Kipper, Barbara Bangol und Kaimo Hirv 8.1 MHC-Komplex und HLA-System Klinische Bedeutung der HLA-Typisierung Methodische Aspekte der HLA-Typisierung SSP-Methode SSO-Methode DNA-Sequenzanalyse nach Sanger 297
7 O:/Wiley/Thiemann/3d/ftoc.3d from :50:11 XI Next Generation Sequencing (NGS) Primäre Immundefekterkrankungen Hereditäre periodische Fiebersyndrome Molekulare Onkologie und Pathologie 301 Tanja Hinrichsen, Stefanie Kühner, Oliver Wachter und Barbara Dockhorn-Dworniczak 9.1 Leukämien Ablauf einer genetischen Diagnostik am Beispiel der chronischen myeloischen Leukämie (CML) Solide Tumore Kolorektales Karzinom (KRK) Hereditäres nicht polypöses Kolonkarzinom-Syndrom (HNPCC) Indikation HNPCC 309 Teil IV Qualität Qualitätssicherung in der molekularen Diagnostik 315 Holger F. Rabenau und Udo Reischl 10.1 Präanalytik Labortechnische und -organistorische Voraussetzungen Kontrollen Validierungen von molekularbiologischen Verfahren NAT-spezifische Aspekte der Qualitätssicherung RiLiBÄK Gesetze und Normen zur Regelung der molekularen Labordiagnostik im deutschsprachigen Raum 323 Paul M. Cullen und Michael Neumaier EU-Richtlinie 98/79/EG über In vitro-diagnostik 323 Besondere Bedeutung der EU-Richtlinie für die Molekulardiagnostik 325 Regelung von Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT) bei der Diagnose von Infektionskrankheiten 325 Das deutsche Gendiagnostikgesetz 325 Aufbau und Inhalt des Gendiagnostikgesetzes 326 Was vom Gendiagnostikgesetz nicht geregelt wird 326 Was vom Gendiagnostikgesetz geregelt wird 326 Anwendung des Gendiagnostikgesetzes was in der täglichen Praxis beachtet werden muss 327 Gendiagnostikgesetz: Kritik, Interpretation und Modifikationen 333 Weiterführende Literatur 337 Index 341
8 O:/Wiley/Thiemann/3d/ftoc.3d from :50:11
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