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1 V8 Immunodisplacement Kit REF HL P (3) [Multi Language V8 Immunodisplacement Kit].indd 1 11/10/11 10:24:53

2 de Deutsch ANWENDUNGSBEREICH Der V8 Immunodisplacement Kit dient zur Auftrennung und Identifizierung monoklonaler Gammopathien mittels Kapillarzonenelektrophorese. Diese Technik trennt Proteine in einer alkalischen Pufferlösung auf Basis ihrer Nettoladung auf zusammen mit ihrer unterschiedlichen Wechselwirkung mit der Wand der Quarzkapillare. Die Immuntypisierung von Gammaglobulinen wird durch Testen von Probenaliquots mit einem Panel mo-nospezifischer Antiseren durchgeführt. Der durch die Antiseren des Tests gebildete Komplex und sein Ziel-protein haben ein modifiziertes Migrationsprofil und ist daher zum normalen Serumproteinelektrophero-gramm versetzt. Durch den Vergleich der Ergebnisse des Testpanels mit einem Referenztest kann der vor-liegende Immunglobulintyp durch die spezifische Entfernung oder Reduzierung der abnormalen Zacke be-stimmt werden. Der größte Bedarf für eine Immunodisplacement-Analyse liegt im klinischen Laborbereich, hier vor allem in der Diagnose monoklonaler Gammopathien. Bei einer monoklonalen Gammopathie handelt es sich um eine Primärerkrankung, in der ein einzelner Plasmazellklon vermehrt erhöhte Mengen von Immunglobulin einer einzelnen Klasse und eines einzelnen Typs produziert. Solche Immunglobuline werden als monoklonale Proteine, M-Proteine oder Paraproteine bezeichnet. Ihre Anwesenheit kann harmlos oder von unspezifischer Bedeutung sein. In manchen Fällen ist ihr Nachweis ein Hinweis auf das Vorliegen einer malignen Erkrankung wie dem multiplen Myelom oder Morbus Waldenström. Man muss zwischen polyklonalen und monoklonalen Gammopathien unterscheiden. Polyklonale Gammopathien sind sekundäre Erkrankungszustände, die durch chronische Lebererkrankungen, Kollagenosen, rheumatoide Arthritis und chronische Infektionen hervorgerufen werden. Proteine im Urin stammen hauptsächlich von durch die Niere gefilterten Plasmaproteinen ab. Das Vorkommen abnormaler Plasmaproteine im Urin ist bei der Beurteilung der Nierenfunktion von großer Bedeutung. Die richtige Untersuchung der Proteinurie sollte quantitative und qualitative Bewertungen von Typ und Menge der ausgeschiedenen Proteine umfassen 1-5. Die Kombination der elektrophoretischen Auftrennung der Urinproteine und Bestimmung bestimmter Proteintypen durch Immunpräzipitation erlaubt eine Unterteilung mehrerer Proteinurieformen: physiologische, glomeruläre (selektiv und nicht-selektiv), tubuläre sowie Proteinurie, die mit Dysglobulinämie im Zusammenhang steht HL P (3) [Multi Language V8 Immunodisplacement Kit].indd 19 11/10/11 10:24:54

3 V8 Immunodisplacement Kit WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN Die Reagenzien dieses Kits sind nur zur In-vitro-Diagnostik bestimmt. Nicht einnehmen oder mit dem Mund pipettieren. Beim Umgang mit den Kitkomponenten Handschuhe tragen. Siehe Sicherheitsdatenblatt bezüglich der R- und S-Sätze sowie Informationen zur Entsorgung. INHALT 1. Anti-human IgG antisera. REF HL SA (1 x 50 Tests) Jede Flasche enthält ausreichend Antiserum für 50 Tests. Das Antiserum ist gebrauchsfertig und muss, wie im Bedienungshandbuch angegeben, auf dem V8-Gerät von Helena in die entsprechende Position eingesetzt werden. 2. Anti-human IgA antisera. REF HL SA (1 x 50 Tests) Jede Flasche enthält ausreichend Antiserum für 50 Tests. Das Antiserum ist gebrauchsfertig und muss, wie im Bedienungshandbuch angegeben, auf dem V8-Gerät von Helena in die entsprechende Position eingesetzt werden. 3. Anti-human IgM antisera. REF HL SA (1 x 50 Tests) Jede Flasche enthält ausreichend Antiserum für 50 Tests. Das Antiserum ist gebrauchsfertig und muss, wie im Bedienungshandbuch angegeben, auf dem V8-Gerät von Helena in die entsprechende Position eingesetzt werden. 4. Anti-human kappa antisera. REF HL SA (1 x 50 Tests) Jede Flasche enthält ausreichend Antiserum für 50 Tests. Das Antiserum ist gebrauchsfertig und muss, wie im Bedienungshandbuch angegeben, auf dem V8-Gerät von Helena in die entsprechende Position eingesetzt werden. 5. Anti-human lambda antisera. REF HL SA (1 x 50 Tests) Jede Flasche enthält ausreichend Antiserum für 50 Tests. Die Antiseren sind gebrauchsfertig und müssen, wie in der Gebrauchsanleitung im Bedienungshandbuch angegeben, in die entsprechende Position auf dem V8-Gerät von Helena eingesetzt werden. 6. Gebrauchsanweisungen. Jedes Kit enthält eine Gebrauchsanweisung. LAGERUNG UND STABILITÄT 1. Anti-human IgG antisera. 2. Anti-human IgA antisera. 3. Anti-human IgM antisera. 4. Anti-human kappa antisera. Anti-human lambda antisera. Die Antiseren sollten bei 2 bis 8 gelagert werden und sind bis zum aufgedruckten Verfallsdatum sta-bil.geöffnete Fläschchen sind bei 2 bis 8 C 4 Wochen stabil. Achten Sie darauf, dass die Fläschchen mit Antiseren nach Gebrauch wieder verschlossen werden, um den Verdunstungsverlust so gering wie möglich zu halten. 20 HL P (3) [Multi Language V8 Immunodisplacement Kit].indd 20 11/10/11 10:24:54

4 de Die Antiserumlösungen sind klar und farblos. Die Antiseren verwerfen, wenn Veränderungen im Aussehen bemerkt werden. Verfärbung oder Trübung weist zum Beispiel auf eine Verunreinigung hin. ANTISEREN NICHT EINFRIEREN. NICHT MITGELIEFERTES, ABER BENÖTIGTES MATERIAL REF V8 Storage Buffer REF V8 Maintenance Buffer REF V8 Serum Protein 6-band Kit (Bei Durchführung einer 6-Banden- Analyse) REF V8 Serum Protein SPE Kit (Bei Durchführung einer 6-Banden- Analyse) REF V8 Serum Protein 6-band Zoom Kit (Bei Durchführung einer 6-Banden- Analyse) REF V8 Clinical Waste Drawer Pack OPTIONAL ZU VERWENDENDE PRODUKTE REF V8 Urine Preparation Buffer SP6 REF V8 Urine Preparation Buffer SP6 Zoom REF V8 Urine Preparation Buffer SPE REF VS2002 Sartorius VivaSpin 20 Centrifugal Concentrators REF GEHE GE Healthcare NAP-5 Desalting Columns - Bei Durchführung von Immunodisplacement im Urin REF V8 Free kappa / Free lambda Kit REF V8 Anti-IgD / Anti-IgE Kit PROBENENTNAHME UND VORBEREITUNG Für Serumproteinanalysen ist frisch entnommenes Serum das Untersuchungsmaterial der Wahl, da Plasma-proben zwischen der Beta- und Gammafraktion eine große Fibrinogenbande enthalten. Proben können bei 2 bis 8 bis zu 7 Tagen und bei -20 C bis zu 1 Monat gelagert werden. Wenn Proben eingefroren werden sollen, müssen sie sofort gekühlt und innerhalb von 8 Stunden nach Ent-nahme eingefroren werden. Aufbewahren der Proben bei 2 bis 8 kann zu einem Proteinabbau, insbesondere der Komplementfrak-tionen, führen. Folglich kann bei einer Lagerung bei 2 bis 8 nach 7 Tagen der Nachweis einer eindeutigen Beta-2-Region nicht mehr möglich sein. Proben NICHT bei Raumtemperatur lagern - die Probe wird schnell abgebaut. Proben mit Kryoglobulinen können nach Kühlen oder Einfrieren viskös oder trübe werden. Es ist anzuraten, diese Proben vor dem Testen auf Raumtemperatur zu bringen. 21 HL P (3) [Multi Language V8 Immunodisplacement Kit].indd 21 11/10/11 10:24:54

5 V8 Immunodisplacement Kit Das Untersuchungsmaterial der Wahl für die Urinanalyse ist frisch gesammelter Urin (24-Stunden- Samme-lurin). Proben können bei 2 bis 6 bis zu 7 Tagen gelagert werden. Für längere Lagerzeiten können die Proben bis zu einem Monat bei -70 C aufbewahrt werden. Proben NICHT bei -20 C aufbewahren. Urinproben sind vor dem Testen auf dem V8-System mit einem der oben aufgeführten optionalen Urinvor-bereitungspuffer (Urine Preparation Buffer) und Gerätekombinationen zu entsalzen. SCHRITT-FÜR-SCHRITT METHODE 1. Vergewissern Sie sich, dass sich der Einschub für den Abfallbehälter im Gerät befindet. 2. Vergewissern Sie sich vor Einschalten des V8, dass sich Lager- und Wartungspuffer sowie Einweggefäße auf dem Gerät und in den richtigen Positionen befinden. Im Bedienungshandbuch ist beschrieben, wie das Verbrauchsmaterial richtig eingesetzt wird. 3. Starten Sie die Platinum 4V-Software und legen eine neue CE-Sitzung an. Wählen Sie in Platinum 4V aus dem Dropdown-Menü CE SYSTEM (CE-System) und klicken auf DEFAULT METHOD (Standardmethode). Achten Sie darauf, dass das richtige Immunodisplacement Assay ausgewählt ist (siehe Bedienungshandbuch). Für Reflex-Testing oder Einzeltestanforderungen siehe Bedienungshandbuch. 4. Schalten Sie das V8-Gerät von Helena wie im Bedienungshandbuch beschrieben ein. 5. Setzen Sie für die Durchführung eines Immunodisplacement-Tests ggf. die entsprechende Serumproteinpufferflasche und das Diluent ein. Für das korrekte Einsetzen aller Serumproteinpuffer- und Diluentflaschen (siehe Bedienungshandbuch). 6. Überprüfen Sie, ob der Barcode des Immunodisplacementreagenz in die Platinum 4V geladen wurde, indem Sie aus dem Dropdown-Menü CE SYSTEM (CE- System) wählen. Klicken Sie auf DEFINE REAGENTS (Reagenzien festlegen) und vergewissern Sie sich, dass für jedes Antiserum der Barcode eingegeben wurde und die Position der Reagenzieninformationen mit den vorgese-henen Positionen der Fläschchen auf dem V8 übereinstimmen. 7. Die Verschlusskappen der Antiseren abnehmen und sie in das Reagenzienfach des V8 setzen. 8. Wenn das V8-Gerät für die Probenaufnahme betriebsbereit ist, blinkt es rot. 9. Für Proben, die für ein Reflex-Testing angefordert wurden und sich NICHT bereits auf dem V8-Gerät befinden, das jeweilige Primärprobenröhrchen in das Probenrack stellen. Dabei darauf achten, dass durch das Rackfenster der Barcode deutlich zu erkennen ist (siehe Bedienungshandbuch). 22 HL P (3) [Multi Language V8 Immunodisplacement Kit].indd 22 11/10/11 10:24:54

6 de 10. Die Probenracks links in den V8-Probentransportbereich stellen und wie im Bedienungshandbuch beschrieben den Deckel schließen. 11. Das V8-Gerät beginnt automatisch mit der Analyse aller geladenen Proben. Die Ergebnisse werden an die Platinum 4V-Software übertragen. 12. Bei Bedarf nach Testende das Gerät herunterfahren, indem es wie im Bedienungshandbuch beschrieben ausgeschaltet wird. 13. Am Ende eines Arbeitstags muss das V8 unbedingt wieder richtig aufbereitet werden. Siehe Bedienungshandbuch. AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE Die Mehrzahl der monoklonalen Proteine wandern in den katodischen Gammabereich des Proteinmusters, können aber aufgrund ihrer pathologischen Beschaffenheit bei der Kapillarelektrophorese innerhalb des Globulinbereichs überall hinwandern. Immunodisplacement ist eine subtraktive Analysetechnik. Das abnormal Protein wird identifiziert, indem getestet wird, mit welchem Antiserum es reagiert. Daraufhin wird der ursprünglich identifizierte Peak in den Test-CE-Elektropherogrammen vermindert oder entfernt. Bei der Analyse der Ergebnisse muss berücksichtigt werden, dass normale polyklone Immunglobuline sowie abnormale Paraproteine ebenfalls aus der Spur entfernt werden. Es muss deshalb die Form des Testelek-tropherogramms sowie ihre relativen Kurvenabschnitte beachtet werden. QUALITÄTSKONTROLLE Helena Biosciences Abnormal CEtrol Serum Control (REF ) von Helena Biosciences kann zur Identifizierung aller Phasen des Immunodisplacement-Verfahrens eingesetzt werden. EINSCHRÄNKUNGEN 1. Reaktion mit Kappa- oder Lambda-Leichtketten-Antiseren, aber keine Reaktion mit IgG-, IgA- oder IgM-Schwerketten-Antiseren. Proben, die dieses Verhalten aufzeigen, haben entweder eine monoklonale freie Leichtketten- Gammopathie oder eventuell ein monoklonales IgD- oder IgE-Protein. Unter diesen Umständen sollte die ID unter Austauschen von IgD- und IgE-Antiseren gegen zwei der anderen Schwerkettenantiseren wiederholt werden. Falls es nicht zur Reaktion mit IgD- oder IgE-Antiseren kommt, kann dies ein Hinweis auf eine Leichtketten- Gammopathie sein. 2. Die Bande in der Gamma-Region zeigt keine Reaktion mit den ID-Antiseren. C-reaktives Protein (CRP) kann bei Patienten mit akuter Entzündungsantwort nachgewiesen werden 6-7. Erhöhtes Alpha-1-Antitrypsin und Haptoglobin bestärkt die Anwesenheit von CRP. 23 HL P (3) [Multi Language V8 Immunodisplacement Kit].indd 23 11/10/11 10:24:54

7 V8 Immunodisplacement Kit 3. Keine Reaktivität mit Kappa- und Lambda-Antiserum. Gelegentlich reagiert eine Probe mit einem Schwerketten-Antiserum, ohne dass eine Reaktion mit einem Leichtketten-Antiserum ersichtlich ist. Unter diesen Umständen muss Folgendes ausgeschlossen werden: a. Schwerkettenkrankheit b. Sehr hohe Leichtkettenkonzentrationen, die zu Antigenüberschuss führen c. Niedrige Konzentrationen von Leichtketten d. Atypische, nicht mit dem Antiserum reagierende Leichtketten-Moleküle e. Leichtketten mit versteckten Leichtkettendeterminanten (wird manchmal bei IgA und IgD beobachtet). 4. Kreuzreaktivität der Antiseren. Aufgrund der veränderten Beschaffenheit der Antikörpermoleküle für Immunodisplacement können die in der Kapillare durchgeführten Antikörper-Antigen-Reaktionen mit einigen Antiseren in einer Kreuzreaktivität mit den monoklonalen Komponenten einer Probe resultieren. Diese selten auftretende Kreuzreaktivität kann zu der klinischen Schlussfolgerung einer biklonalen Gammopathie führen. Falls eine Kreuzreaktivität der Antiseren vermutet wird, können weitere Tests mit einer Gel-Immunfixation erforderlich sein, um die Ergebnisse zu bestätigen. Es besteht kein Risiko, als Folge einer Kreuzreaktivität falsch negative Ergebnisse zu erhalten. Die Antiseren für das Immunodisplacement sind in der Lage, monoklonale Peaks von <30 g/l aus Serum-proben und <0,6 g/l aus Urinproben vollständig zu entfernen. Gammaglobuline, die diese Konzentrationen wesentlich überschreiten, können möglicherweise nicht voll-ständig aus der Spur entfernt werden, was eine Interpretation der Ergebnisse erschwert. In diesen Fällen ist es ratsam, die Originalpatientenprobe entweder mit isotonischer Kochsalzlösung oder dem entsprechenden V8 Urine Preparation Buffer zu verdünnen, um die Proteinkonzentration auf einen Wert zu reduzieren, bei dem es zu einer kompletten Verdrängung kommen kann, und dann den Immunodisplacement-Test zu wie-derholen. Alternativ kann die Funktion Verdünnung ausschalten verwendet werden, um die Proteinkon-zentration auf ein Maß zu reduzieren, an dem eine vollständige Verdrängung stattfinden kann. Für weitere Informationen siehe Bedienungshandbuch. EMPFINDLICHKEIT Die Immuntypisierung mit dem V8 Immunodisplacement Kit kann monoklonale Gammopathien mit Serum-konzentrationen von 0,208 g/l oder Urinproteinkonzentrationen von 0,02 g/l oder höher nachweisen. LEISTUNGSEIGENSCHAFTEN Eine Anzahl Proben wurden mit dieser Methode und einem anderen, kommerziell erhältlichen Testkit analysiert und die erhaltenen Messwerte verglichen. Beide Methoden liefern übereinstimmende Resultate. 24 HL P (3) [Multi Language V8 Immunodisplacement Kit].indd 24 11/10/11 10:24:55

8 de LITERATUR 1. Fauchier, P. and Catalan, F. Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis Alfred Fournier Institute, Paris, France, Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. Finding Clues to Disease in Urine Diagnostic Medicine, 1980 ; May/June : Umbreit, A. and Wiedemann, G. Determination of Urinary Protein Fractions. A Comparison With Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : Wiedemann, G. and Umbreit, A. Determination of Urinary Protein Fractions by Different Electrophoretic Methods, Clin. Lab.; 1999, 45 : Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and Lockhart, S. A Comparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria Ann. Clin. Biochem., 1997, 34 : Jeppsson, J.O., Laurell, C.B. and Franzen, B., Agarose Gel Electrophoresis, Clin. Chem., 1979; 25(4) : Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M., Protein Analysis, Diagnostic Medicine, 1980; Jan/Feb : HL P (3) [Multi Language V8 Immunodisplacement Kit].indd 25 11/10/11 10:24:55

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