Quantitative Analysen. Analysentechniken/-systeme

Transkript

1 Vorlesung zum Praktikum Klinische Chemie (1. Kurstag; Analytik/Postanalytik Postanalytik) Quantitative Analysen Analysentechniken/-systeme systeme Störfaktoren Postanalytik G. Schumann, Institut für Klinische Chemie, MHH

2 Lernziele Definition der labormedizinischen Messgröße (System Analyt Messgrößenart) Beurteilung von Analysenergebnissen: longitudinal, transversal Unterschiedliche Konzentrationen (Größenordnungen) von Blutbestandteilen Störfaktoren Sensitivität und Spezifität (Analytische Sensitivität, diagnostische Sensitivität) (Analytische Spezifität, diagnostische Spezifität) Analysensysteme für Spektrofotometrie, Chromatografie, Immunotests Postanalytik - Plausibilität (biologische und pathophysiologische Validierung) Postanalytik - Befundbericht (wesentliche Bestandteile) Postanalytik - Archivierung des Untersuchungsmaterials

3 Eppendorf-Fotometer (ca. 1980) ( im Notfall-Laboratorium der MHH)

4 1980 Autoanalyzer 2008 Messzeit 10 min Kleines Probenvolumen Sehr gute Präzision Sehr gute Wiederholbarkeit Große Fortschritte bei der weltweiten Vergleichbarkeit der Messergebnisse.

5 Quantitative Analysen von Messgrößen [ System --- Analyt --- Messgrößenart ] B - C - S - P - (Voll-) Blut oder Hämolysat ggf. arteriell (AB) oder venös (VB) deklarieren Kapillarblut Serum Überstand aus geronnenem Blut; Zellen und Fibrin sind abgetrennt Plasma gerinnungshemmender Zusatz bei Blutentnahme EDTA-Plasma Citrat-Plasma Oxalat-Plasma Heparinat-Plasma ERC - Erythrozyten z.b. - Folsäure - Zinkprotoporphyrin SW - Serumwasser BW - Blutwasser U - Urin L - Liquor F - Stuhl (z.b. F-Hb) SU - Schweiss (sudor) M - Mageninhalt Y - Nicht spezifiziert Beschaffenheit des Untersuchungsmaterials ist unklar spezifiziert (z.b. Punktatflüssigkeit) (Häufig keine Referenzintervalle)

6 Quantitative Analysen von Messgrößen [ System --- Analyt --- Messgrößenart ] (Parameter, Eigenschaft) Exakte Bennung (ohne Abkürzung) wie z.b.: Gesamteiweiß Ionisiertes Calcium Anorganisches Phosphat Digoxin Digitoxin Procalcitonin (Parameter, Eigenschaft) Akzeptierte Abkürzungen: wie z.b.: PSA Prostataspezifisches Antigen Lp(a) Lipoprotein (a) AST Aspartat Aminotransferase TSH Thyeroidea Stimulierendes Hormon hcg humanes Choriongonadotropin

7 Vorsicht bei der Verwendung von Abkürzungen (Akronymen)! ( - Pacific Southwest Airlines, US-amerikanische Fluggesellschaft - Persistent Staging Area, ein Teil des Business Information Warehouse - Personal Sales Assistant - Personal-Service-Agentur - Personen-Such-Anlage Funkrufanlagen zum übermitteln von Textnachrichten - Persönliche SchutzAusrüstung - Persönlichkeits-Struktur-Analyse, ein Persönlichkeitsmodell aus der Arbeitspsychologie - PhthalSäureAnhydrid, chemische Verbindung - PostSparkassenAmt - Pressure Sensitive Adhesive (z. B. Beschichtung von Klebebändern) - Probabilistische SicherheitsAnalyse (engl. "probabilistic safety analysis", eine Methode zur Sicherheitsanalyse komplexer technischer Systeme, z. B. von Kernkraftwerken - Problem Statement Analyzer, klassischer Ansatz des Requirements Engineering - Production Sharing Agreements - Profil-Simulations-Analyse - Prostataspezifisches Antigen, ein Glykoprotein, das v.a. von der Prostata sezerniert wird - PSA International, eine Management-Trainingsagentur - PSA Peugeot Citroën, Société Anonyme des Automobiles Peugeot (kurz Peugeot S.A.), ein französischer Automobilkonzern - PSychoAnalytische Spezialabteilung in Larry Brent Romanen

8 Quantitative Analysen von Messgrößen [ System --- Analyt --- Messgrößenart ] Stoffmengenkonzentration Massenkonzentration mol/l (mmol/l, µmol/l, nmol/l) g/l oder g/dl (g/100 ml) (mg/l, µg/l, ng/l) nicht mg%!!! Internationale Einheiten U arbiträre Einheiten (Units) bei Makromolekülen (Proteinen) Katalytische Enzymkonzentration - Substratumsatz pro Minute U/l : 60 = - Substratumsatz pro Sekunde kat/l (µkat/l)

9 ? Die Glucose ist 25

10 Quantitative Analysen [ System --- Analyt --- Meßgrößenart ] Die Glucose ist 25 Die Glucosekonzentration im Kapillarblut ist 25 mmol/l (Referenzintervall: 3,9-5,5 mmol/l) Hyperglykämie! Die Glucosekonzentration im Kapillarblut ist 25 mg/100 ml (Referenzintervall: mg/100 ml) Hypoglykämie!

11 Komponenten und ihre Konzentrationen im menschlichen Blut Aus Klinische Chemie und Labordiagnostik für die Praxis Herbert Keller, Georg Thieme Verlag 100 mmol 0, mmol = 10 picomol

12 Komponenten und ihre Konzentrationen im menschlichen Blut (I) Stoffmenge (mol/l) Ionen, Metabolite Therap. Pharm.-Konz mmol/l Natrium, Chlorid mmol/l Gesamt-CO 2, Harnstoff mmol/l Glucose, Cholesterin, Triglyceride, Ca 2+, Mg 2+,anorg.Phosphat Salicylat, Lithium µmol/l Harnsäure, Kreatinin, Pyruvat, Phenylalanin Valproat, Phenobarbital, Theophyllin µmol/l Fe, Cu, NH 3 /NH 4+, Zn, Bilirubin, Creatin Phenytoin, Primidon, Aminoglykosidantibiotika nmol/l H + (ph) Methotrexat nmol/l Digoxin

13 Komponenten und ihre Konzentrationen im menschlichen Blut (II) Stoffmenge mol/l Proteine Vitamine Hormone, Peptide µmol/l Transferrin, Met-Hb, IgG Ascorbat µmol/l Caeruloplasmin, IgA Vit. A, Carotinoide Dehydroepiandrosteron (DHEAS) nmol/l IgM Gesamt-T4, Cortisol nmol/l Folat Tyrosin-bindendes Globulin (TBG) nmol/l IgE Noradrenalin, HCG, Prolactin pmol/l Vit. B12 Insulin, Parathormon pmol/l CEA, AFP Freies T3 u. T Molekül/l DNA, RNA TSH, Angiotensin

14 Geräte und Verfahren für klinische chemische Analysen Spektrofotometrie (Endpunkt oder kinetisch) Immunchemische Verfahren Chromatografische Verfahren

15 Modulares Analysensystem

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22 Schematischer Aufbau von Spektrophotometern Polychromator (Diodenarray-System)

23 Schematischer Aufbau von Spektrophotometern Monochromator (konventionelles System)

24 Spektrofotometrische Verfahren an vollmechanisierten Analysengeräten sind so konfiguriert, dass ein Trennschritt nicht erforderlich ist. Aus 0,2-0,3 ml Serum können bis zu 40 Messgrößen bestimmt werden. Pro Messgröße wird eine Küvettenposition beansprucht. 10 Minuten nach der ersten Pipettierung ist die erste Messung beendet. (Die nächsten Ergebnisse folgen im 8-Sekunden-Takt)

25 Photometrie: Prinzipien Indikatorreaktion in diesem Zusammenhang häufig Bildung bzw. Verbrauch von NAD(P)H. Im Gegensatz zu NAD(P) + hat NADH ein Absorptionsmaximum bei 340 nm Beispiel: Bestimmung von Glucose mittels Hexokinase-Reaktion: Glucose + ATP Hexokinase Glucose-6-Phosphat + ADP Indikatorreaktion: Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Glucose-6-Phosphat + NADP + 6-Phosphogluconat + NADPH + H + Absorption bei 340 nm proportional zu gebildetem NADPH und zur Glucosekonzentration

26 Messung der Enzymaktivität Aufnahme einer Absorptions- Zeit-Kurve in einem vorgegebenen Messintervall zur Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit Beispiel: Bestimmung der Aktivität der Lactatdehydrogenase (LDH) LDH Lactat + NAD + Pyruvat + NADH + H + Messung der Absorptionszunahme (ΔA) pro Zeiteinheit bei 340 nm (Zunahme der NADH-Konzentration)

27 Bedingungen für enzymatische Tests Damit enzymatische Bestimmungen auch von Labor zu Labor verglichen werden können (Standardisierung), sind u.a. die Einhaltung folgender Rahmenbedingungen unbedingt erforderlich Optimale Substratkonzentration Optimaler ph Optimale Coenzymkonzentration Optimale Konzentration von Aktivatoren Definierte Temperatur (37 C) Veränderung der Temperatur um 1 C verändert das Ergebnis eines enzymatischen Tests um ca. 10 %

28 Trennmethoden in der Klinischen Chemie Beispiel Prinzip Ausfällung Ausfällen von Proteinen Erzeugung von unlöslichen durch Trichloressigsäure Niederschlägen Sedimentation Abtrennung der Blutkörperchen Höhere rel. Dichte der suspendierten vom Plasma Teilchen Zentrifugation Abtrennung der Blutkörperchen Beschleunigung der vom Plasma Sedimentationsgeschwindigkeit (2000g) UltrazentrifugationTrennung von Zellkomponenten hohe Beschleunigung der Sed.geschw. (z.b g) Filtration Klären von trübem Urin Abtrennung von festen Partikeln durch Filter Ultrafiltration Proteinanreicherung im Urin, Liquor Abtrennung gelöster makromolekul. Stoffe von niedermolekularen Elektrophorese (Gruppen-)Trennung von Proteinen Unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit im elektr. Feld Chromatographie Auftrennung von Proteinen, Pharmaka, Drogen... Auftrennung von Stoffgemischen durch unterschiedliche Verteilung in mobiler und stationärer Phase Extraktion Abtrennung hydrophober von Löslichkeit in organ. Lösungsmitteln hydrophilen Substanzen

29 Chromatographie Unterschiedliche Verteilung von Stoffen in zwei verschiedenen Phasen, genauer gesagt an den Phasengrenzflächen der a) stationären (unbeweglichen) Phase, b) mobilen (beweglichen) Phase (Voraussetzung: Beide Phasen sind nicht mischbar) Man unterscheidet zwischen: Dünnschichtchromatographie, Papierchromatographie Säulenchromatographie Trennprinzipien: Adsorptionschromatographie Ionenaustauschchromatographie Gelchromatographie Affinitätschromatographie

30 Chromatographie Eine Automatisierung chromatographischer Methoden führt generell auch zu einer Ankopplung an ein analytisches Nachweisverfahren hierbei in Form eines entsprechenden Detektors solche chromatographischen Systeme können folgendermaßen benannt sein: HPLC LC GC High Performance Liquid Chromatography Liquid Chromatography Gas Chromatography Bei der Vielzahl möglicher Detektionstechniken spielt vor allem die Massenspektroskopie (MS) ein besondere Rolle. Kombination: GC-MS, LC-MS, LC-MS/MS Durch Elektronenstoß entstehen bei der MS positiv geladene Fragmente einer Substanz, die in charakteristische Größe und Anzahl auftreten (molekularer Fingerabdruck)

31 Kombination: Gaschromatograf / Massenspektrometer

32 Glaskapillarsäule (25 m)

33 Elektrophorese: Serumelektrophorese Wanderung in Lösung befindlicher Teilchen beim Anlegen einer Gleichspannung Geschwindigkeit der Moleküle ist proportional der Feldstärke und der Molekülladung und umgekehrt proportional der Molekülgröße Serumelektrophorese auf Celluloseacetatfolie als Trägermaterial Elektrophoresetechniken = Trennung von Stoffgruppen

34 Immunchemische Verfahren Nephelometrie/ Turbidimetrie Bei diesen immunchemischen Verfahren wird durch Antikörper-Antigen-Aggregate das Licht gestreut. Anwendung beim Nachweis vieler Serumproteine (Albumin, Immunglobuline, Akute-Phase-Proteine, Speicher- und Transportproteine) und Urinproteine (Albumin, α 1 -Mikroglobulin). Immuno-Nephelometrie: Messung eines Anteils des gestreuten Lichtes (A) Immuno-Turbidimetrie: Messung der Abschwächung der Lichtintensität (B) (A) (B)

35 Immunchemische Verfahren Heidelberger-Kurve als Grundlage bei Trübungs- und Streulichtmessungen Antikörper(AK-)überschuss: Jede Steigerung der AG-Menge führt zu weiter Vernetzung, die im Äquivalenzbereich am stärksten ist. Antigen(AG-)überschuss: Aggregate werden wieder kleiner und somit besser löslich. Zahl der AK reicht nicht aus, alle AG zu verküpfen.

36 Immunchemische Verfahren Sandwich-Assay (2 Antikörper) Einsatz eines Capture -Antikörpers und eines markierten Zweitantikörpers Art der Markierung legt Detektionsprinzip fest (ELISA, RIA, LIA, ECLIA...)

37 Immunchemische Verfahren kompetitiver ELISA Ein Indikator (Tracer, Label, Konjugat) konkurriert mit der Probe um Bindungsstellen Art der Markierung gibt Detektionsprinzip vor

38 Analytische Verfahren in der Klinischen Chemie Beispiel Prinzip Potentiometrie ph-messung Potentialmessung Coulometrie Coulometrische Chlorid-Bestimmung Messung der Strommenge Kryoskopie Osmolalität von Serum/Urin Gefrierpunktserniedrigung Optische Messmethoden Photometrie Protein-Bestimmung mit Messung der Absorbance (Spektrometrie) Biuretreagenz Flammenphotom. Natrium im Serum/Urin Atomabsorptions- Kupfer im Urin spektrometrie Messung der Lichtemission Messung der atomaren Absorption Densitometrie Elektrophoreseauswertung Messung der Lichtdurchlässigkeit Turbidimetrie Immunglobulin-Bestimmung Trübungsmessung Nephelometrie Streulichtmessung Fluorimetrie DNA/RNA-Bestimmung Fluoreszenzmessung Proteinbindung Tumormarker-Bestimmung Enzymimmunoassay

39 Qualitätskontrolle im Überblick Ziele: Kontrolle der zufälligen Messabweichung (Fehler). Kontrolle der systematischen Messabweichung über den gesamten klinisch-relevanten Messbereich. Kontrolle jeder Analysenserie (umfasst längstens acht Stunden). Anwendbarkeit in allen Laboratorien. Vorschriften zur Durchführung der Qualitätskontrolle in med. Laboratorien und Anforderungen bzgl. Güte der Messungen für 87 Messgrößen festgelegt in Richtlinien der Bundesärztekammer (RILIBÄK): Maximal zulässige Unpräzision (Anlage 1, Spalte 5), Maximal zulässige Unrichtigkeit (Anlage 1, Spalte 6), Maximal zulässige Abweichung des Einzelwertes (Anlage 1, Spalte 7)

40 Patient bekommt Cholesterin-reduzierte Diät und Statine. Die initiale Cholesterinkonzentration ist 300 mg/100 ml Bei der Folgeuntersuchung 4 Wochen später wird eine Cholesterinkonzentration von 285 mg/100 ml befundet Die Frage an den Arzt für Laboratoriumsmedizin: Ist die Abnahme der Cholesterinkonzentration um 5 % (mit großer Wahrscheinlichkeit) als therapeutischer Effekt zu betrachten? 5 % [mg/100 ml] Cholesterin

41 Zwei Messergebnisse sind hier signifikant (95 %) unterschiedlich, wenn die Relative Unpräzision (Tag / Tag): CV = 1,25 % 5 % = 4 σ 2σ 2σ [mg/100 ml] Cholesterin

42 Beurteilung klinisch-chemischer Analysenergebnisse Longitudinalbeurteilung (Kumulativer Laborbericht/-Befund) Betrachtung einer zeitlichen Folge (Zeitreihe) von Ergebnissen desselben Individuums. (Stabiles analytisches System) Transversalbeurteilung (an Hand eines Referenzintervalls o. ä.) Vergleich eines Analysenergebnisses mit Beurteilungskriterien, die durch die Untersuchung einer geeigneten Referenz- Stichprobe gewonnen wurden. (Messung in der Patientenprobe muss rückführbar sein)

43 Hämolyse: Einflussgröße und Störfaktor? Einflussgröße in vivo Veränderung (Beeinflussung) des zu bestimmenden Analyten Veränderliche (z.b. P-Glucosekonzentration postprandial) Unveränderliche (z.b. Geschlecht) Störfaktor in vitro Veränderung (Beeinflussung) des zu bestimmenden Analyten bzw. der Analytik

44 Einflussgrößen Veränderliche: Unveränderliche: Ernährung Fasten Körpergewicht, Muskelmasse Körperliche Aktivität Körperlage Venenstauung Schwangerschaft Tagesrhythmus Klima Höhenlage Pharmaka Alkohol Geschlecht Rasse Erbfaktoren Alter Alle Makromoleküle: (Gesamtprotein, Enzyme) Elektrolyte, Chol., TG: (Flüssigkeitsverschiebung) Laktat: (Anaerobe Glykolyse unter Belastung)

45 Freies Hämoglobin im Plasma Das medizinische Laboratorium erhält eine Blutprobe und den Untersuchungsauftrag zur Bestimmung verschiedener Serumbestandteilen (z.b. S-Kalium, S S-LDH, S S-CK). S Die Blutprobe wird zentrifugiert. Das Serum ist durch freies Hb sichtbar rot gefärbt. (deutlich mehr als 200 mg/l freies Hb!) deutlich mehr als 200 mg/l freies Hb!) Handelt es sich hier um einen Störfaktor oder um eine Einflussgröße?

46 Freies Hämoglobin im Plasma (3) Von sichtbar hämolytischen Proben, die im Labor bearbeitet werden, ist in weniger als 5% der Fälle die Ursache eine in vivo-hämolyse. 95% Fehler: Falsche Blutentnahme, langer Transport, Erschütterungen beim Transport, Fehler bei der Gewinnung des Serums bzw. Plasmas im Labor ( Blut gefroren, etc.) Einflussgröße für die Hb-Konz. bei in vivo-(intravasaler)-hämolyse Beispiel (Sport): Ein Marathon (Marsch-Hämoglobinurie) Hämolyse als Einflussgröße: S-Creatinkinase (CK), S-Eisen, S-Gesamtprotein, S-Kalium, S-LDH S-Eiweiß-Elektrophorese, Hämolyse in der präanalytischen Phase = Störfaktor Hämolyse als Störfaktor: Bei diversen fotometrischen Verfahren

47 Andere Störfaktoren als Hämoglobin Lipide (Trübung bei fotometrischen Analysen) Bilirubin (Störung von Indikatorreaktionen) Paraproteine (Trübung bei fotometrischen Analysen) (monoclonale Komponenten, M-Gradient) Kreuzreagierende Komponenten bei immunchemischen Verfahren (z.b. Arzneimittel-Metabolite) Humane anti-maus-antikörper (Störung von IA) Antikoagulanzien (Serum-Elektrophorese, S-K, S-Fe) Infusionslösungen (Verdünntes Serum) Bakterien, Hefen Pharmaka (z.b. Benzoylpenicilline bei Proteinbestimmung)

48 Analytische Spezifität Die Eigenschaft eines analytischen Verfahrens, nur die Messgröße (die Komponente, den Analyten) zu messen, der zu erfassen beabsichtigt ist (aber nichts anderes!). Analytische Sensitivität (Empfindlichkeit) (a) Die Eigenschaft eines analytischen Verfahrens, die kleinste Konzentrationsdifferenz innerhalb des Messbereiches sicher unterscheiden zu können. (b) Bei Vorhandensein der Messgröße ein Messsignal zu erhalten, dass sicher von Null unterschieden werden kann.

49 Postanalytik: Gründe für eine Wiederholungsanalysen Bei unplausibler Konstellation der Transversalbeurteilung (z.b. S-Harnsäure und S-Harnstoff, aber S-Kreatinin ) Bei unplausibler Konstellation der Longitudinalbeurteilung (z.b. Abnahme der Enzymaktivität schneller als mit Halbwertszeit erklärbar) Bei Verdacht, dass technische Probleme nicht vor Freigabe der Ergebnisse erkannt worden sind. Wenn der Einsender eine Bestätigungsanalyse verlangt.

50 Postanalytik: Prüfung der Plausibilität Beurteilung von CK und Isoenzym CK-MB bei Verdacht auf einen Myokardinfarkt Datum S-CK U/l S-CK MB U/l Quotient % Serum Hämolytisch Die Hämolyse stört das Verfahren zur Bestimmung der CK-MB doppelt so intensiv wie das Verfahren zur Bestimmung der (Gesamt)-CK.

51 Befundbericht für laboratoriumsmedizinische Untersuchungen Wesentliche Bestandteile des Berichts: Zuständiges Laboratorium Befundempfänger Datum/Uhrzeit des Befunddruckes Befundblatt (z.b. Blut) Entnahmedatum/-uhrzeit Eindeutige Bezeichn. d. Messgrößen Referenzintervall, Entscheidungsgrenze Abgeleitete Messgrößen (z.b. GFR) Warnhinweise Kommentare

52 Befundbericht für laboratoriumsmedizinische Untersuchungen Referenzintervall oderentscheidungsgrenze?

53 Asservierung von Untersuchungsmaterial Aufbewahrung von Serum, Urin Liquor im Kühlschrank, 5-7 Tage (für Wiederholungsanalysen, Nachforderungen) Aufbewahrung von Serum, Urin, Liquor, tiefgefroren über lange Zeiträume (für Vergleichsanalysen bei Methodenwechsel, bei toxikologischen Untersuchungen)

54 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit G. Schumann