Molekulare und zelluläre Mechanismen synaptischer Entwicklung und Plastizität

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1 Neurobiologie Molekulare und zelluläre Mechanismen synaptischer Entwicklung und Plastizität Sigrist, Stephan Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, Göttingen Selbständige Nachwuchsgruppe - Neuroplastizität (ENI) ssigris@gwdg.de Zusammenfassung Nervenzellen "unterhalten sich" mithilfe von so genannten Synapsen, wobei Veränderungen dieser Synapsen der langfristigen Informationsspeicherung im Nervensystem zu dienen scheinen. Die Nachwuchsgruppe "Neuroplastizität" am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie beschäftigt sich mit den zellulären und molekularen Mechanismen, die der Etablierung und der plastischen Umgestaltung von Synapsen zu Grunde liegen. Als Modellsystem dienen die neuromuskulären Synapsen der Fruchtfliege Drosophila, wobei die bekannten genetischen Ansätze mit elektrophysiologischen Messungen kombiniert werden. Darüber hinaus haben die Wissenschaftler um Stephan Sigrist Protokolle entwickelt, die es erlauben, identifizierte Synapsen über mehrere Tage im intakten Tier (in vivo)zu verfolgen. Besonderes Interesse gilt hierbei den synaptischen Glutamatrezeptoren, die das von der vorgeschalteten präsynaptischen Zelle kommende Signal übertragen. Es zeigt sich, dass sich neue Glutamatrezeptor-Felder ausschließlich de novo ausbilden und dann innerhalb von etwa 24 Stunden zu ihrer endgültigen Größe heranwachsen. Die Mobilität der Glutamatrezeptoren während der Ausbildung einzelner Rezeptorfelder wurde in Bleichexperimenten und vermittels Photo-Aktivierung in vivo vermessen. Während reife Rezeptorfelder aufgrund geringen Ein- und Austritts von Rezeptoren stabil sind, kontrolliert der "Import"von Glutamatrezeptoren direkt das Wachstum der Rezeptorfelder. In Übereinstimmung hiermit finden die Wissenschaftler, dass Glutamatrezeptoren - unabhängig von ihrer Funktion als Ionenkanäle - direkt für den Aufbau der postsynaptischen Strukturen benötigt werden. Die Interaktion zwischen prä- und postsynaptischer Seite während der synaptischen Etablierung wird zurzeit durch In-vivo-Bildgebung untersucht. Überraschenderweise finden die Forscher hier, dass das "Drosophila-Grip-Homologe", potenzieller Bindungspartner von Glutmatrezeptoren, auch den Prozess der muskulären Wegfindung kontrolliert. Abstract Synapses are the places where neurons speak to each other, and changing synapses seemingly underlies information storage in the nervous system. The Max Planck group "Neuroplasticity" focuses on the cellular and molecular mechanisms of synapse assembly and plasticity, using neuromuscular synapses of Drosophila as a model system. Apart from combining genetic approaches typical for Drosophila with electrophysiological analysis we have developed protocols, which allow to follow identified synapses over extended time periods in the intact animal. The team of Stephan Sigrist particularly concentrate on the glutamate receptors which receive the acitivity signal from the presynaptic neuron. We find that new glutamate receptor fields form exclusively de novo and usually grow to their characteristic mature size within about 24 hours. The mobility of glutamate receptors at individual receptor fields was analyzed in photo-bleaching and photo-activation experiments. While mature receptor fields are stable because both glutamate receptor entry and exit are low, the entry of glutamate receptors directly controls receptor 2004 Max-Planck-Gesellschaft

2 Tätigkeitsbericht 2004 Sigrist, Stephan Molekulare und zelluläre Mechanismen synaptischer... field growth. Consistently, we find that glutamate receptors are directly needed for postsynaptic assembly independent of their ionic conductance. The in vivo imaging is currently used to illuminate how pre- and postsynaptic site interact within synapse assembly as well as to study the interplay of glutamate receptor dynamics glutamate receptor binding partners and postsynaptic assembly. In this context, the working group find that the Drosophila glutamate receptor binding protein homologue surprisingly controls muscle cell guidance. Die Erforschung unseres "Denkorgans", des Gehirns, ist und bleibt eine dominierende Aufgabe der Biologen und Mediziner. Hierbei kommt den Orten der Kommunikation zwischen Nervenzellen, den Synapsen, eine zentrale Bedeutung zu. An Synapsen werden Signalstoffe (Neurotransmitter) von einer erregten Nervenzelle freigesetzt, um nach Diffusion durch den so genannten synaptischen Spalt "postsynaptische" Rezeptoren in der nachgeschalteten Nervenzelle zu aktivieren. Hierdurch kommt es schließlich zur Weiterleitung des elektrischen Signals. Die Aminosäure Glutamat ist der in unserem Gehirn am weitesten verbreitete erregende Neurotransmitter ("glutamaterge Synapsen"), die Glutamatrezeptoren sind demgemäß Gegenstand intensiver Forschung. Besondere Muster in der elektrischen Aktivität von Nervenzellen können die synaptische Signalübertragung zwischen Nervenzellen langfristig verändern. Diese "synaptische Plastizität" wird allgemein als zelluläre Grundlage von Lern- und Gedächtnisprozessen angesehen. Sie umfasst zum einen Veränderungen in der Funktion bereits existenter Synapsen ("funktionelle Plastizität"), welche an glutamatergen Synapsen oft durch Umstellungen in der Menge der synaptisch lokalisierten Glutamatrezeptoren vermittelt zu werden scheinen. Zum anderen kommt es aber auch zu Veränderungen der synaptischen Struktur, insbesondere zur Ausbildung neuer Synapsen innerhalb des Nervennetzwerks ("strukturelle Plastizität"). Funktionelle und strukturelle Veränderungen an Synapsen sind zeitlich dynamisch und räumlich eng verzahnt. Solche Prozesse lassen sich durch "statische Untersuchungen" (zum Beispiel biochemische Analyse oder Immunfärbungen an fixiertem Material) nicht in allen Aspekten analysieren und verstehen. Insbesondere lassen sich Übergangszustände (beispielsweise bei der Neuentstehung von Synapsen) nur schwer auffinden und die zeitliche Reihenfolge und kausale Verknüpfung von Teilprozessen so nur schwer abklären. Seit langer Zeit wurde daher der Bedarf formuliert, synaptische Ereignisse in lebenden Tieren (in vivo) direkt zu beobachten. Bisher konnten jedoch nur wenige Präparationen studiert werden, und das dann nur unter sehr großem experimentellen Aufwand. In letzter Zeit hat allerdings die Entwicklung genetisch einsetzbarer Fluoreszenz-Sonden (insbesondere das "Green Fluorescent Protein - GFP") neue Perspektiven für die In-vivo-Bildgebung aufgezeigt. Die Arbeitsgruppe von Stephan Sigrist studiert die Synapsen, die zwischen den motorischen Nervenzellen und den Muskelzellen der Fruchtfliege Drosophila gefunden werden (Abb. 1), um den Prozess der Synapsenbildung in lebenden Tieren über ausgedehnte Zeiträume (Tage!) zu verfolgen. Diese neuromuskulären Synapsen ähneln den Gehirn-Synapsen im molekularen und ultrastrukturellen Feinaufbau, ihre Analyse profitiert aber davon, dass sie experimentell sehr gut zugänglich sind und effiziente genetische Werkzeuge zur Verfügung stehen. Die neuromuskulären Synapsen von Drosophila verwenden ebenfalls den Neurotransmitter Glutamat, den sie mithilfe von postsynaptischen Glutamatrezeptoren wahrnehmen. Diese Glutamatrezeptoren sind denen des Menschen verwandt. Die spezifischen Vorteile des gewählten Modellsystems (Larven sind optisch transparent, schnelle Etablierung transgener Tiere, übersichtliche Organisation identifizierbarer Neurone und Synapsen) haben es den Göttinger Forschern in der letzten Zeit erlaubt, individuelle synaptische Glutamatrezeptor- Felder über Tage in intakten lebenden Drosophila-Larven (In-vivo-Ansatz) zu beobachten (Abb. 2) Max-Planck-Gesellschaft

3 Abb. 1 : Neuromuskuläre Synapsen von Drosophila als Modell zum Studium synaptischer Entwicklung und Plastizität: (A) Entwicklung des neuromuskulären Systems im Drosophila-Embryo. Die Muskeln bilden sich durch Fusionsprozesse aus Muskelvorläuferzellen und senden zelluläre Fortläufer aus ("Wegfindung"), die sich mit der Epidermis verbinden ("Anheftung"). Etwas später werden sie von den axonalen Ausläufern spezifischer Motorneurone kontaktiert und eine neuromuskuläre Verknüpfung ("neuromuscular junction", NMJ) entsteht. Diese NMJ wächst gemeinsam mit dem innervierten Muskel während der folgenden Larvenentwicklung stark aus. Die morphologische Größe und Übertragungsstärke der NMJ kann sich durch eine Vermehrung der elektrischen Aktivität der Motorneurone steigern ("nutzungsabhängige Plastizität"). (B) Organisationsprinzip des neuromuskulären Systems. Eine individuelle NMJ (Schema oben) besteht aus "Perlschnüren synaptischer Boutons" (bouton - Knopf, Knospe), die jeweils mehrere individuelle Synapsen ("blaue Punkte" unten links) enthalten. Gezeigt ist auch ein elektronenmikrokopischer Querschnitt (unten rechts) durch einen synaptischen Bouton, wobei mehrere individuelle Synapsen angeschnitten wurden (Ränder durch Pfeilspitzen markiert) Max-Planck-Gesellschaft

4 Tätigkeitsbericht 2004 Sigrist, Stephan Molekulare und zelluläre Mechanismen synaptischer... Abb. 2 : Markierung synaptischer Glutamatrezeptoren mit dem selbstleuchtenden GFP-Protein erlaubt die Langzeit-Darstellung synaptischer Rezeptorfelder in lebenden Drosophila-Larven. (A) Elektrophysiologische Signale von Muskelzellen aus Drosophila-Larven, in denen die Leitfähigkeit von Glutamatrezeptoren untersucht wird. Oben: die Leitfähigkeit, die an Synapsen mit normalen Glutamatrezeptoren (DGluRIIA) gefunden wird. Unten: die normalen Glutamatrezeptoren wurden auf genetischem Wege gegen die mit GFP markierten Rezeptoren (DGluRIIA GFP ) ausgetauscht. Die Leitfähigkeit ist weiterhin normal. Das Experiment beweist, dass der GFP-markierte Glutamatrezeptor seine Funktionsfähigkeit voll beibehalten hat. (B) In Grün gezeigt sind GFP-markierte Glutamatrezeptoren (DGluRIIAGFP), die die Rezeptorfelder individueller Synapsen markieren. In Rot dargestellt ist eine Aktivitätsmarkierung, die synaptische Neurotransmittervesikel auf der präsynaptischen Seite anzeigt. Die individuellen "Rezeptorfelder" sind mit präsynaptischer Neurotransmitter- Freisetzung assoziiert und daher Teil aktiver Synapsen. (C) Wachstumsprozesse an individuellen Synapsen lebender Tiere. Individuelle Rezeptorfelder wurden in lebenden Larven mithilfe GFP-markierter Glutamatrezeptoren (DGluRIIAGFP) visualisiert und während der Entwicklung verfolgt. Konfokale Laser-Scan-Mikroskopie erlaubt die Darstellung individueller Synapsen in intakten lebenden Larven, die während der Bildaufnahme für wenige Minuten betäubt werden. Die Zeitangaben (zum Beispiel 12 h) stehen für Stunden nach Beginn des Experiments. Die meisten Synapsen können aufgrund ihrer individuellen Lage und Form über Tage hin verfolgt werden (weiße Pfeilspitzen). Viele neue Synapsen bilden sich durch das Auswachsen kleiner Vorstufen (weiße Pfeile). Etablierte Synapsen können entweder wachsen (gelbe Pfeilspitze) oder auch schrumpfen (blaue Pfeilspitze). Die Kreise markieren Bereiche, in denen Synapsen entweder zu Beginn des Experiments hohe Dichte aufweisen (weißer Kreis) beziehungsweise hohe Dichte (blauer Kreis) entwickeln. Auch in diesen Bereichen tritt keine Teilung von Synapsen auf. Der Maßstabsbalken entspricht 2 Mikrometer. Die Versuche zeigen, dass sich zusätzliche Synapsen in diesem System stets neu ausbilden und nicht wie zuvor vermutet aus der Teilung bereits existenter Synapsen hervorgehen. Diese synaptischen Rezeptorfelder wachsen innerhalb von etwa einem Tag zu "reifen" Rezeptorfeldern heran, wobei ihre finale Größe eine spezifische Eigenschaft der jeweiligen Synapse darstellt. Dieser experimentelle Ansatz hat es den Wissenschaftlern um Stephan Sigrist erlaubt, die In-vivo-Mobilität von Glutamatrezeptoren Max-Planck-Gesellschaft

5 direkt auf der Ebene einzelner Synapsen zu untersuchen (Abb. 3). Sie konnten zeigen, dass das Wachstum von Rezeptorfeldern direkt durch den "Import" neuer Rezeptoren kontrolliert wird. Die endgültige Stabilisierung von Rezeptorfeldern erklärt sich durch ein Abfallen des Imports bei sehr schwachem "Export" von Glutamatrezeptoren. Abb. 3 : Molekulare Dynamik während der Entwicklung individueller Synapsen: Die beiden vorgestellten Experimente zeigen, dass spezifischer Import von Glutamatrezeptoren postsynaptische Rezeptorfelder wachsen lässt, bevor diese stabil werden und eine fixierte Population von Glutamatrezeptoren besitzen. (A) Grün- (DGluRIIAGFP, links) und rot- (DGluRIIAmRFP, Mitte) fluoreszierende Glutamatrezeptoren wurden gemeinsam in denselben Synapsen exprimiert, das rechte Bild zeigt beide Kanäle überlagert. 24 Stunden vor Beginn des Experiments wurde das rote Fluoreszenzsignal vermittels Laserlichts gebleicht, weshalb der rote Kanal spezifisch die seitdem in die Synapsen hineintransportierten Rezeptoren anzeigt ("fluorescence recovery after photobleaching"). Während des Experiments neu entstandene Synapsen (Pfeile) zeigen einen hohen Anteil neu importierter Rezeptoren, während stabile Synapsen (Pfeilspitzen) durch schwachen Rezeptorexport charakterisiert sind. (B) Die postsynaptischen Glutamatrezeptoren wurden vermittels Photoaktivierung zu Beginn des Experiments in lebenden Larven (t= 0 Stunden) markiert. Einen Tag später (t= 24 h) ist weiterhin ein starkes Signal in den Rezeptorfeldern zu beobachten, was anzeigt, dass der Export der Rezeptoren aus den Rezeptorfeldern allenfalls schwach sein kann. Nach einer weiteren Runde von Photoaktivierung (rechtes Bild) hingegen werden die neu in die Synapsen eingetretenen Rezeptoren sichtbar, die sich an neu entstandenen (weiße Pfeile) beziehungsweise stark ausgewachsenen Synapsen (gelbe Pfeile) befinden. Für die Funktion der neuromuskulären Synapsen sind die Glutamatrezeptoren unverzichtbar. Es war allerdings unklar, ob die Rezeptoren auch am Aufbau der eigentlichen synaptischen Struktur teilnehmen Max-Planck-Gesellschaft

6 Tätigkeitsbericht 2004 Sigrist, Stephan Molekulare und zelluläre Mechanismen synaptischer... Die genetische Analyse zeigt, dass die Ausbildung präsynaptischer Strukturen und die präsynaptische Neurotransmitterfreisetzung vom Vorhandensein der postsynaptischen Glutamatrezeptoren weitgehend unabhängig sind. Die elektronenmikroskopische Analyse zeigt hingegen, dass der Aufbau der postsynaptischen Struktur von der Anwesenheit der Glutamatrezeptoren zwingend abhängig ist. So kommt es in Abwesenheit der Rezeptoren nur zu einem sehr lockeren Kontakt der prä- und postsynaptischen Membran. Besonderes Interesse gilt auch den molekularen Mechanismen, die die zelluläre Dynamik von Glutamatrezeptoren steuern und die Ausbildung von Synapsen in die Entwicklung des neuromuskulären Systems zeitlich-räumlich integrieren. Wir haben das Drosophila-Homologe des Glutamatrezeptor- Bindeproteins (Grip) als potenziellen Bindungspartner eines neuromuskulären Glutamatrezeptors identifiziert. Grip verfügt über sieben so genannte PDZ-Domänen, " strukturelle Module" für die spezifische Protein-Protein-Erkennung. Diesen wird eine zentrale Rolle für die Etablierung zellulärer Signalkomplexe zugeschrieben. Die mechanistische Basis der Funktion solcher Proteine ist allerdings bisher kaum verstanden. Die genetische Analyse im Labor von Stephan Sigrist hat ergeben, dass Grip unerwarteterweise für die frühe (das heißt noch vor der Ausbildung der Synapsen!) Wegfindung der Muskelzellen im Drosophila-Embryo (Abb. 1) wichtig ist (Abb. 4, A und B). Die Arbeitsgruppe prüft zurzeit eine Hypothese, nach der das Grip- Molekül als "intelligenter Transporter" für Signal-gebende Proteine fungiert und somit verschiedene Teilschritte während der neuromuskulären Entwicklung verzahnt. In diesem Zusammenhang könnte Grip auch an der Regulation der präsynaptischen Freisetzung der Neurotransmittervesikel beteiligt sein, wie die elektronenmikroskopische (Abb. 4, C) und die elektrophysiologische Analyse neuromuskulärer Endigungen andeuten. In weiteren Arbeiten wollen die Forscher die In- vivo-mikroskopie weiter nutzen, um ein "integriertes Bild" synaptischer Entwicklung und Plastizität zu gewinnen. Insbesondere interessiert Stephan Sigrist, inwiefern neuronale Aktivität die Ausbildung von Synapsen auch lokal beeinflussen kann. Die spezifischen Vorteile des beschriebenen synaptischen Modells sollten hierbei zum Tragen kommen Max-Planck-Gesellschaft

7 Abb. 4 : "Drosophila Grip" steuert die Wegfindung embryonaler Muskelzellen: (A) Die Anheftung embryonaler Muskelzellen an die Epidermis im Wildtyp (+/+) und in Embryonen ohne Grip- Expression (grip). Im Wildtyp senden die Muskelzellen Fortsätze aus (obere Reihe, Pfeil), die sich nach anterior (links) bewegen (mittlere Reihe, +/+,Pfeil) und schließlich stabilen Kontakt zur kopfständigen ("anterioren") Segmentgrenze etablieren (untere Reihe, +/+, Pfeil). Muskelfasern, die kein Grip besitzen (grip), bilden Fortsätze, die in falsche Richtung auswachsen (obere und mittlere Reihe, grip, Pfeilspitzen) und mehrheitlich keinen Kontakt zur anterioren Segmentgrenze ausbilden (untere Reihe, grip, Pfeilspitze). (B) Als Konsequenz ihrer defekten Wegfindung runden sich die ventro-longitudinalen Muskeln von Grip-mutanten Embryonen ab (grip, Pfeil), statt sich wie im Wildtyp (+/+) stabil an beiden Segmentgrenzen zu verankern. Die embryonale Muskulatur ist durch eine Färbung gegen muskuläres Myosin dargestellt. (C) Elektronenmikrokopische Aufnahme von neuromuskulären Synapsen in grip-mutanter Larve. Die Pfeile markieren untypische Vesikel von etwa 200 Nanometer Größe, die auf Störungen im endozytotischen Membranhaushalt der präsynaptischen Motorneuron-Endigungen hinweisen könnten Max-Planck-Gesellschaft