Modul PKA: Protein- und KH-Analytik

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1 Protein- und KH-Analytik WS 2017/2018 Modul PKA: Protein- und KH-Analytik M. Gey: Protein-/KH-Analytik Konzept 1

2 Protein- und KH-Analytik 0. Einführung in die PKA-Vorlesung 1. Strukturen von KH, AS, von Proteinen, Polysacchariden und Glycoproteinen 2. Elektrophoresen (Elpho-4) in der Proteinanalytik (Slab gel Elektrophoresen: CAF, SDS-PAGE, IEF u.a.) 3. BioLC-2: SEC, HIC, IEC 4. BioLC-3: AC, Lektin-LC, CC, Perfusion-LC 5. Aminosäureanalytik 6. Kohlenhydratanalytik M. Gey: Protein-/KH-Analytik Gliederung der Vorlesung 2

3 Protein- und KH-Analytik 7. Massenspektrometrie 8. Hyphenated Techniques 9. Präanalytische Techniken 10. Klassische Proteinreinigung 11. Proteomics Zusammenfassung-1, Aufgaben 13. Proteomics Glycoprotein-Analytik 15. Zusammenfassung-2, Spkte für die PM M. Gey: Protein-/KH-Analytik Gliederung der Vorlesung 3

4 Protein- und KH-Analytik 2. Elektrophorese-2 (Grundlagen Wiederholungen) M. Gey: Protein-/KH-Analytik Elektrophorese-2 4

5 Entwicklungsetappen der Elektrophorese Elektrophorese : Tiselius 1937 Papier-Elektrophorese Celluloseacetat-Elektrophorese Stärkegel-Elektrophorese Molekularsieb-Elektrophorese Disk-Elektrophorese SDS-(PAGE)-Elektrophorese Immun-Elektrophorese Isoelektrische Fokussierung 2D-Elektrophorese Kapillar-Elektrophorese M. Gey: Protein-/KH-Analytik Elektrophorese-2 5

6 Elektrophorese 1937 Elektrophorese Tiselius: Nobelpreis für Chemie, 1948, "Für seine Arbeiten über die Analyse mit Hilfe von Elektrophorese und Adsorption, insbesondere für seine Entdeckungen über die komplexe Natur von Serum-Proteinen. 6

7 Elektrophorese - Wiederholungen Elektro-phorese Elektro-, Anlegen einer elektrischen Spannung. -phor, (grie) und bedeutet "tragen". Wanderung geladener Moleküle, Partikel. Zellen in einem Gleichstromfeld, wobei sich diese Probespezies in wäßriger Lösung befinden. Die elektrophoretische Trennung erfolgt innerhalb stabilisierender Medien (Gele, Folien) oder in freien Lösungen (CE) auf Grund unterschiedlicher Ladungen und Massen der Probespezies. M. Gey: Protein-/KH-Analytik Elektrophorese-2 7

8 Prinzip der trägerfreien Elektroden Elektrophorese Pufferlösungen "getrennte" Probeionen Probelösung M. Gey: Protein-/KH-Analytik Elektrophorese-2 8

9 Prinzip der Slabgel-Elektrophorese Elektrode Elektrode Gleichspannung Elektrophorese- Platte mit Gel Startzone mit Probemolekülen "Verschmierte" Substanzzone "Normale" Substanzzone "Scharfe" Substanzzone 9

10 Elektrophorese: Systematik-I Elektrophorese in freien Lösungen ("tube gel") Elektroden Elektrophorese mit "stützenden" Medien ("slab gel") Orientierung "Platte" Pufferlösungen vertikal horizontal "getrennte" Probeionen Probelösung 10

11 Elektrophorese: Systematik-II Klassische Elektrophorese(-Methoden) 2-D-Elektrophorese Kapillarelektrophorese (CE) 11

12 Elektrophorese: Systematik-III 2-D-Elektrophorese Isoelektrische Fokussierung (IEF) 1. Dimension Kapillarelektrophorese CE SDS-PAGE 2. Dimension Kopplung MALDI-MS MW-Bestimmung Massenspektrometrie (CE-MS) 12

13 Elektrophorese-IV: Trennmechanismen "Gele" - Stärkegel, - Agarose, - Agar, - Polyacrylamid. Methode - Isoelektrische Fokussierung, - SDS-PAGE, - Disk-Elektrophorese, - Isotachophorese, 13

14 Srtruktureller Aufbau der Agarose Gelstruktur der Agarose 14

15 Nachteile der Agarose-Gele: Sind nicht elektroendoosmose-frei, haben niedrige Siebwirkung für Proteine < 100 kda und sind nicht ganz klar, bei hohen Nachweisemfpindlichkeiten (Silberfärbung) kommt es zur starken Hintergrundfärbung. M. Gey: Protein-/KH-Analytik Elektrophorese-2 15

16 Agarose Agarose ist ein Polysaccharid, der aus roten Meeresalgen durch Entfernen des Agropektins hergestellt wird. rel. großporig: 150 nm Porengröße bei 1% (g/ml) bis 500 nm bei 0,16%. Agarose wir durch Aufkochen in Wasser gelöst und geliert beim Abkühlen. Gelherstellung: Ausgießen der Agaroselösung auf eine horizontale Glasplatte oder Trägerfolie. Geldicke resultiert aus dem Volumen der Lösung und der Fläche, worauf sie verteilt wird. M. Gey: Protein-/KH-Analytik Elektrophorese-2 16

17 Polyacrylamid Acrylamid + Methylenbisacrylamid Polymerisation Polyacrylamid CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 C O CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH C O NH 2 C O NH C O C O C O C O NH 2 NH 2 NH NH 2 NH 2 CH 2 CH 2 NH NH C O C O CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 C O CH CH 2 CH CH 2 CH C NH O C O C O NH 2 NH 2 NH CH 2 NH C O CH 2 NH C O M. Gey: Protein-/KH-Analytik Elektrophorese-2 17

18 Prinzip der Zonen-Elektrophorese u (A) u: elektrophoretische Mobilität u (B) Startsituation : ph-wert = konstant, eine identische Pufferlösung, Substanz A : Substanz B : u (A) Trennresultat : u (B) M. Gey: Protein-/KH-Analytik Elektrophorese-2 18

19 Je kleiner das Teilchen, desto schneller ist die Wanderung 19

20 Je größer die Ladung, desto schneller ist die Wanderung 20

21 Völlig verschiedene Stoffe (Analyte) können in der Elektrophorese gleich schnell wandern. 21

22 Elektro-endoosmose 22

23 Mobilität Elektrische Mobilität µ : Wanderungsgeschwindigkeit der Probespezies. abhängig von. PK-Werten der geladenen Gruppen, Molekülgröße (Größe der Spezies). beeinflußt durch Art, Konzentration u. ph-wert des Puffers, Temperatur, Feldstärke, Qualität des Trägermaterials (Gels). 23

24 Sicherheitshinweise Elektrophoresen sollen in geschlossenen Trennkammern durchgeführt werde. Kabel u. Stecker müssen für Gleichstrom mit hohen Spannungen richtig dimensioniert u. isoliert sein. Stromversorger sollen sich bei Kurzschlüssen selbständig ausschalten. Elektrophorese-Apparatur auf trockenem Platz stehen; ggf. auslaufende Puffer dürfen nicht in Stromversorger gelangen. Beim versehentlichen Öffnen der Kammer muß der Stromkreis automatisch geschlossen werden. 24

25 Protein- und KH-Analytik PKA WS 2016/17 M. Gey: Protein-/KH-Analytik slab gel elpho 25

26 Protein- und KH-Analytik 3. Slab gel Elektrophoresen A: Serum-Eiweiß-Cellulose-Acetat-Folien- Elektrophorese M. Gey: Protein-/KH-Analytik slab gel elpho 26

27 CAF: Blut vs. Blutplasma vs. Blutserum M. Gey: Protein-/KH-Analytik CAF elpho 27

28 Serum = Blut - BZ - Fibrinogen rel. klare, gelbe Flüssigkeit des Blutes, aus der die Blutzellen (Erythrocyten, Leukozyten, Thrombozyten) und der Gerinnungsfaktor Fibrinogen entfernt worden sind. Plasma = Blut -BZ M. Gey: Protein-/KH-Analytik CAF elpho 28

29 Zusammensetzung des Blutes Blut Zentrifugation a Plasma b Blutkörperchen Hämatokrit = b/a 29

30 Serum-Eiweiß-CelluloseAcetat-Folien-Elektrophorese 2.1 Serum Erythrozyten? Rote Blutkörperchen, -zellen; erythros (gr.): rot; kytos (gr): Zelle. Leukozyten? Weiße Blutkörperchen, -zellen; leukos (gr.): weiß; kytos (gr): Zelle. Erythrozyten = Granulozyten: granularis (lat.): körnig Neutrophile, Eosinophile, Basophile Granulozyten, Lymphozyten, Monozyten. Thrombozyten: Blutblättchen (thrombos(gr.): Klumben 30

31 Serum-Eiweiß-CelluloseAcetat-Folien-Elektrophorese 2.2 Eiweiße/Proteine Hochmolekulare, vorwiegend amorphe, optisch aktive Naturstoffe, Primär-, Sekundär-, Tertär-, Quarternärstruktur, Carboxyl-Gruppen, Amino-Gruppen, hydrophobe AS, AS-S. 31

32 Serum-Eiweiß-CelluloseAcetat-Folien-Elektrophorese 2.2 Serumeiweiße Albumin-Fraktion: Serumalbumin der Lymphe Globuline: α 1 -, α 2 -, ß-, γ - 32

33 Serum-Eiweiß-CelluloseAceta-Folien-Elektrophorese 2.3 Cellulose Polysaccharid: aus Glucosemoleküle, die ß-1,4-glycosidisch verknüpft sind. C.: Gerüstsubstanz u. Hauptbestandteil pflanzlicher Zellen Pflanzenfasern wie Baumwolle, Jute, Flachs, Hanf sind mehr oder weniger reine C. 2.3a CelluloseAcetat-(Folien; s. Praktikum) Zelluloseester; anstatt OH -, CH 3 COO -, 33

34 Serum-Eiweiß-CelluloseAcetat-Folien-Elektrophorese 2.4 Elektrophorese 1.) Wanderung von Teilchen (Molekülen Zellen) im elektrischen Feld. 2.) Elektroosmose 3.) Besonderheiten der Serumeiweißelektrophorese 34

35 Serum-Eiweiß-Cellulose-Acetat-Folien(CAF)-Elektrophorese Aufgabe der Serum-Eiweiße Celluloseacetatfolie Kapillarfluss Kathode Proteinwanderung Anode Elektroosmose Puffer Puffer 35

36 Elektrophorese-Apparatur (horizontal); mit Celluose-Acetat-Folie (weiß!). 36

37 Kammer für Trennpuffer (Folie taucht in die Lösung ein, Stromkreis geschlossen!) Horizontal- Kammer Elektroden Cellulose-Acetat- Folie Kammmer für Trennpuffer (andere Seite) 37

38 Serum-Eiweiß-CelluloseAcetat-Folien-Elektrophorese 2.4 Elektrophorese 3.) Besonderheiten der Serumeiweißelektrophorese Trennmechanismus (Puffer: ph = 8,4...8,8; pk-werte der Proteine: Ladung der Proteine negativ Wanderung zum Pluspol! 38

39 Serum-Eiweiß-CelluloseAcetat-Folien-Elektrophorese 2.4 Elektrophorese 3.) Besonderheiten der Serumeiweißelektrophorese Anfärben der Proteine, Ponceau R, E 124 OH N N SO 3 Na SO 3 Na NaO 3 S 39

40 Anode [+] Albumin Serum 40 Globuline Kathode [-] α 1 α 2 β γ Migrationszeit [min]

41 41

42 Serum-Eiweiß-Cellulose-Acetat-Folien(CAF)-Elektrophorese Albumin α 1 -Globulin α 2 β γ Serum (Normalbereiche) , Serum - gesund 63,9 3,3 8,3 9,5 15,0 Serum - pathologisch 41,3 3,6 8,5 5,6 41,0 42

43 Serum-Eiweiß-Cellulose-Acetat-Folien(CAF)-Elektrophorese Albumin α 1 -Globulin α 2 β γ Serum (Normalbereiche) , Serum - gesund 63,9 3,3 8,3 9,5 15,0 Serum - pathologisch 41,3 3,6 8,5 5,6 41,0 43

44 Immunglobuline Antiköper- Häufigkeit Wirkungsweise klasse IgG 80% bei Sekundärinfektionen, Spät-Antikörper, IgM 6% 1. Abwehr bei Infektion, Sofort-Antikörper, IgA 13% Abwehr von Viren und Bakterien in Schleimhäuten, 44

45 Immunglobuline Antiköper- Häufigkeit Wirkungsweise klasse IgD 1% unbekannt, evtl. Verstärkung der AK-Bildung, IgE 0,002% Bekämpfung vielzelliger Parasiten (z.b. Würmer); Allergie-Reaktionen. 45

46 Serum-Eiweiß-Elektrophorese Antikörpertrennung, Serum Serum 46

47 Serum-Eiweiß-Cellulose-Acetat-Folien(CAF)-Elektrophorese Albumin α 1 -Lipoprotein (HDL) α 1 -saures Glycoprotein α 1 -Antitrypsin α 2 -Makroglobulin Hauptoglobulin Prä-ß-Lipoprotein Transferrin ß-Lipoprotein Komplement IgA IgM Präalbumin IgG α 1 α 2 β γ Migration im elektrischen Feld 47

48 Zusammensetzung des Blutes 48

49 Serum Eiweiß Elektrophorese: Applikationen Herzinffarkt Erhöhung der α-glubuline erst später (nach Tagen) Ist wahrscheinlich ein Zeichen der Resorptionsvorgänge im Bereich der Nekrose (Absterben von Zellen). Albumin Globuline α 1 α 2 β γ 49

50 Serum Eiweiß Elektrophorese: Applikationen Verbrennungen bei >10% d. Körperoberfläche: Anstieg α-glubuline, nach 2-3 Wochen: Anstieg γ-glubuline, Albumin ist aufgrund des Proteinverlustes vermindert. Albumin Globuline α 1 α 2 β γ 50

51 Serum Eiweiß Elektrophorese: Applikationen Maligne Tumore - Karzinome (Krebserkrankungen), Sarkome (Geschwulst, bösartiger Tumor) Als frühes Zeichen kann eine Dysproteinämie (Störung des Eiweißhaltes im Blut) auftreten, Die α-glubuline-erhöhung läuft schubweise und ist die Folge nekrotisierender Prozesse im Tumor. Erhöhung de γ-glubuline. Albumin Globuline α 1 α 2 β γ 51

52 Serum Eiweiß Elektrophorese: Applikationen Leberzirrhose γ-typ 52

53 Serum Eiweiß Elektrophorese: Applikationen Nephrotisches Syndrom Das nephrotische Syndrom entsteht durch eine vermehrte Durchlässigkeit des Glomerulums für Proteine (Eiweiße), es werden Eiweißmoleküle >60 kda filtriert. Den größten Anteil an den Eiweißverlusten hat das Albumin, das eine Masse von ca. 65 kd hat und ca. 60% des im Blutplasma gelösten Eiweiß' ausmacht. α 2 β-typ 53

54 Serum Eiweiß Elektrophorese: Applikationen Antikörpermangel-Syndrom 54

55 Serum Eiweiß Elektrophorese: Applikationen Akute Entzündung α-typ 55

56 Serum Eiweiß Elektrophorese: Applikationen Chronische Entzündung γ-typ 56

57 Serum Eiweiß Elektrophorese: Applikationen Paraproteinämie: Monoklonale Gammopathie 57

58 Serum Eiweiß Elektrophorese: Applikationen Dysproteinämie: Störung des Eiweißhaushaltes im Blut Multiples Myelom Krebserkrankung des blutbildenden Systems Myelom- Protein Myelom- Patien Normal 58