Fundamentals of Biochemistry

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1 Donald Voet Judith G. Voet Charlotte W. Pratt Fundamentals of Biochemistry Second Edition Chapter 7: Protein Function: Myoglobin and Hemoglobin Copyright 2006 by John Wiley & Sons, Inc. Proteinfunktion: Myoglobin und Hämoglobin 1. Myoglobin A. Myoglobin Struktur B. Myoglobin Funktion 2. Hämoglobin A. Hämoglobin Struktur B. Sauerstoffbindung zu Hämoglobin 3. Kooperativität A. Mechanismen der Kooperativität in Hämoglobin B. Allosterische Proteine 4. Abnormale Hämoglobine 1

2 1. Myoglobin A. Struktur von Myoglobin Strukturaufklärung des Pottwal-Myoglobins wurde 1959 von John Kendrew gemacht. Später wurde die Struktur verschiedener Spezies und auch von Hb Mutationen durchgeführt. Das Hämoglobin wurde zum besterforschten Protein überhaupt. Myoglobin aus 8 Helices (A-H). ellipsoid Helices zwischen 7 und 26 AS lang meistens α-helices Enden der Helices A, C, E und G bilden 310 -Helix Bezeichnung von Resten: B5 = 5. AS in B-Helix (N-term nach C-term) FG3= 3. AS im Interhelicalen Segment zw. F u. G NA = nicht helicales aminoterminales Segment HC= nicht helicales carboxyterminales Segment Manchmal auch kombinierte Bezeichnung Glu EF6(83)= Glu 83 im interhelicalen Segment EF 6. AS. 2

3 Die Hämgruppe B. Myoglobin Funktion Räumliche Darstellung des OxyMb distales His proximales His H-Brücke Häm in hydrophobe Tasche eingebettet. DesoxyMb -> sechste koord. Stelle von Fe(II) unbesetzt. Fe(II) rückt auch weiter aus Porphyrinebene Distales His senkt Autooxidationsrate und erhöht Sauerstoffaffinität -> nicht ersetzbar durch andere AS Fe durch O2 Bindung vor Oxidation geschützt -> paradox Oxidation von Häm-Fe in Desoxyform jedoch Säurekatalysiert. Protonen werden durch Fe reduziert und diese reduzieren O2 zu Superoxid. Das distale His wirkt als Protonenfalle und schützt somit Fe vor oxitation. Die Sauerstoffsättigung verändert die Konformation von Mb nur geringfügig. Struktur von Oxy und Desoxy Mb gleich. 3

4 Sauerstoff-Bindungskurve von Myoglobin Sättigungsgrad von Myoglobin Partialdruck Umgebung Andere Sauerstoff-Transportproteine Leghämoglobin in Leguminosen (Pflanzenz. B. Klee)Diese Pflanzen die in Symbiose sind mit Bakterien welche Stickstoff fixieren. Das Abfangen des O2 durc legämoglobin erhöht die Effizienz der Stickstoff fixierung. Hämocyanin in Invertebraten und hat keine Hämgruppe in hoher Konzentration in der Hemolymph Flüssigkeit (vergleichbar mit Blut in Vertebraten). 4

5 2. Hämoglobin A. Hämoglobin Struktur Funktion des Hämoglobins Sauerstoff wird zur Energiegewinnung gebraucht. In kleinen Organismen gelangt O2 durch Diffusion zum Gewebe. In grossen Organismen (Schichtdicke der Gewebe >1mm) aktiver Transport nötig (Löslichkeit des O2 zu niederig). Sauerstoff bindende Proteine haben sich entwickelt. Hämoglobin = Hb (Fe mit Häm), Hämocyanin (Cu haltig), Hämerythrin (Fe haltig, ohne Häm). Fische der Antarktis einzige Vertebraten ohne Hämoglobin. O2 ist bei -1.9 C ausreichend löslich, deshalb haben diese Fische farbloses Blut. Myoglobin = Mb in Muskel erleichtert O2 transport in arbeitendem Muskel und dient in Wassersäugern als O2 Speicher. Häm Häm Mb und jede der 4 Untereinheiten von Hb enthalten nicht kovalent gebundenes Häm, das auch in Cytochromen vorkommt. Oxygenierung ändert Elektonenkonfiguration von Häm-Fe(II) Farbwechsel des Blutes von dunkel purpur (venöses Blut) zu leuchtend rot (arterielles Blut). CO, NO, H2S binden besser als O2 Toxizität Oxidation von Fe(II) zu Fe(III) Methämoglobin (MetHb) Metmyoglobin (MetMb). Keine Bindung von O2, H2O sättigt Fe(III) ab braune Farbe von trockenem Blut His Rest In Erythrocyten reduziert Methämoglobinreduktase Fe(III) zu Fe(II). 5

6 β1 α2 Nicht identische UE im Hb ausgeprägte Wechselwirkungen α1 β1 Kontakt 35 AS α1 β2 Kontakt nur 19 AS αβ-heterodimere -> hydrophobe WW Homodimere -> keine WW da durch Flüssigkeit gefüllten Kanal getrennt α1 β2 Unterschiedliche Quartärstruktur von Desoxy- und Oxy- Hämoglobin Desoxy-Form = T-Zustand β1 α2 β2 Oxy-Form = R-Zustand α2 α1 t-zustand β2 Tertiärstruktur UE Oxygenierung verengt Kanal β1 α1 r-zustand Tertiärstruktur UE DesoxyHb Kristall zerplatzt an der Luft α1 β2 Kontakt nur 19 AS dagegen α1 β1 Kontakt 35 AS -> stärkerer Kontakt unverändert d.h. Veränderung entlang α1 β2 Kontakt -> Verdrehung von α1 β1 Dimer um ca. 15 gegen α2 β2 Dimer 6

7 Blick von rechts auf vorherige Darstellung -> α1 β1 Dimer gefärbt dargestellt α2 β2 Dimer nur Umriss Durch Oxygenierung verschieben sich die 2 α β Dimere gegeneinander OxyHb ist kompakter als DesoxyHb Beachte: Lage von His FG4(97)β (schwarz) relativ zu gelb markierten AS. B. Sauerstoffbindung zu Hämoglobin Hämoglobin bindet O2 kooperativ. Die Hill-Gleichung beschreibt die sigmoidale O2Bindungskurve von Hämoglobin. [S] n Ys = K + [S] n Ys = Sättigungsgrad K = Dissoziationskonstante (p50) S = Ligandkonz., hier po2 n = Hill-Koeffizient n=1 nicht kooperative Bindung wie in Myoglobin n>1 pos. kooperativ wie in Hämoglobin n<1 neg. kooperativ 2.8 hyperbolische Bindungskurve mit demselben p50 wie Hb 7

8 Graphische Auswertung der Hill-Gleichung Hill-Auftragung log YO2 = nlogpo2 - nlogp50 1-YO2 po2 = p Torr 30 Torr viertes O2 bindet mit 100 höherer Affinität an Hämoglobin als erstes O2 3. Kooperativität A. Mechanismen der Kooperativität in Hämoglobin Einwandern von Fe(II) in PorphyrinEbene löst T-> R Transformation aus t-zustand Fe(II) 60 pm aus Porph. Ebene.-> pyramidale durchgebogen O2-Bindung ändert Elektr.konfig. von Fe -> Fe-N porph. -Bindung kontrahiert -> Fe in Phorphyrinebene und O 2 Bindung F-Helix muss Lage verändern, damit HisF8 dem Porphyrinring nicht zu nahe kommt. Dadurch wird Fe- O 2-Bindung stabilisiert. 8

9 Versetzen von 3 Seitenketten. Äquivalenter Satz von H-Brücken. Wie ein Schalter, nur 2 Zustände. Die Kooperativität der Sauerstoffbindung an Hämoglobin ergibt sich aus dem T -> R Übergang Bindung von Sauerstoff erfordert eng abgestimmte Molekülbewegungen: 1) Fe(II) gleitet nur in Porphyrinringebene wenn gleichzeitig sich die räumliche Orientierung vom proximalen His sich ändert. 2) Das proximale His ist fest mit Nachbarn verbunden -> Neuorientierung nur möglich wenn sich F-Helix über Porphyrinebene bewegt. 3) F-Helix kann sich nur dann bewegen wenn α1-β2 und α2-β1 Kontakte sich um eine Windung verschieben 4) Die Unbeweglichkeit der α1-β1 und α2-β2 Kontakte erzwingt die Konformationänderung in 3) -> Untereinheiten oder Dimere können Konformation nicht unabhängig voneinander ändern. Da nur 2 stabile α1-β2 (bzw. α2-β1) Kontakte möglich -> Quartärstruktur von Hb nur in 2 Zustandsformen Was heisst Kooperativität? 1. UE bindet O2 muss aber in t-zustand verharren da andere UE ohne O2 im t-zustand. Je mehr O2 gebunden desto höher O2 Affinität da UE im r-zustand. 9

10 T-Zustand durch Ionenbindungen stabilisiert, brechen auf bei Übergang zu R-Zustand R-Zustand durch Bindung von Sauerstoff stabilisiert. Warum T-Zustand aber stabiler als R-Zustand? C-terminale AS sind im R-Zustand flexibel im TZustand aber nicht, sie sind über Ionenbrücken stabilisiert. Netzwerk von ionischen WW und H-Brücken am Carboxyende der α und β Untereinheiten. deprotoniert bei Bohr effekt Alle diese Bindungen werden beim T-> R Übergang geöffnet Kohlendioxidtransport und Bohr-Effekt Hb transportiert neben O2 auch CO2 im Blut. O2 Bindung (physiolog. ph) Konformationsänderung von Hb (nicht aber Mb). Acidität von Hb erhöht sich und Protonen werden freigesetzt. Wenn diese Protonen durch erhöhen des ph abgefangen werden Erhöhung der O2 Bindungskapazität. = Bohr-Effekt Der Bohr-Effekt erleichtert den O2 Transport Aus O2 wird CO 2 (gelöst). CO 2 wird zu Hydrogencarbonat (langsame Reaktion). Wird in Erythrocyten beschleunigt von Carboanhydrase). CO2 wird im Blut als Hydrogencarbonat transportiert (kein ausperlen von CO 2 möglich). Gewebe po2 niedrig Lunge po2 hoch Einfluss des ph auf die O 2-Bindungskurve des Hb arbeitender Muskel ph tiefer mehr O2 wird abgegeben. 10

11 Rolle von Hb beim Transport von O2 von Lunge zu Gewebe Bedeutung von BPG für die O2 - Bindung Gereinigtes Hb hat höhere Affinität zu O2 als Vollblut. Unter anderem ist dafür D-2,3-Bisphosphoglycerat (BPG= 2,3 DPG) verantwortlich. BPG bindet stärker an DesoxyHb als an OxyHb. Es stabilisiert DesoxyHb. Selbe Funktion hat bei Vögeln Inositol hexakisphosphat (IHP) und bei Fischen und Amphibien Adenosintriphosphat (ATP). Modulation O2 Affinität von Hb in Säugern: 1) H + 2) CO2 3) Cl 4) BPG 11

12 Ohne BPG wird nur wenig O2 freigesetzt BPG erhöht p50 Wert Einfluss von BPG und CO2 von isoliertem Hb im Vergleich zu Vollblut 12

13 Regulation des Sauerstofftransportes Glykolyse Bindung von BPG an Desoxyhämoglobin BPG senkt Sauerstoffaffinität des Hb verbindet β UE über Salzbrücken und stabilisiert somit T-Form Bei Übergang in R-Form wird BPG herausgedrückt da sich Kanal verengt. Fötales Hb (HbF) hat anstelle von HisH143 ein ungeladenes Serin. BPG kann DesoxyHb nicht stabilisieren im Fötus -> höhere Sauerstoffaffinität. Salz- und H-Brücken 13

14 Bei Höhenanpassung steigt die BPG-Konzentration an Anpassung an Höhe führt zur Vermehrung von Erythrocyten. Nach einem Tag ist bereits der Anstieg von BPG zu beobachten, welches die Erythrocyten nicht verlassen kann. Verminderung der O 2 Bindungsaffinintät. Anstieg von BPG auch in Patienten mit Hypoxie, z.b. Anämien, kardiopulmonare Insuffizienz Fötales Hämoglobin (HbF) hat eine niedrige BPG-Affinität und bindet O2 besser als mütterliches Hämoglobin (HbA) O2 Versorgung des Fetus wird dadurch erst effizient. Höhenadaption gewährleistet dass Sauerstoffversorgung sich nicht vermindert. 14

15 B. Allosterische Proteine Organismen müssen auf Veränderungen in der Umgebung reagieren. Dies erfordert einen hohen Grad von Kontrolle biochemischer Mechanismen. Regulation ist auf jedem Niveau des Organismus möglich: -molekulare Ebene (Reaktionsgeschwindigkeiten, Genexpression) -zelluläre Ebene (Signaltransduktion) -organismische Ebene (Verhalten) Die meisten Erkrankungen können auf eine Störung der Kontrollmechanismen zurückgeführt werden. Liganden-Bindung kann durch allosterische Wechselwirkungen kontrolliert werden. Hämoglobin ist ein gutes Beispiel für eine solche Regulation die auf kooperativen Wechselwirkungen beruht. Die Bindung eines Liganden an eine spezifische Koordinationsstelle wird durch das Binden eines anderen Liganden (Effektor oder Modulator) an eine andere Stelle des Proteins beeinflusst. Sind Liganden identisch=homtroper Effekt, unterschiedlich=heterotroper Effekt. Diese Effekte können sowohl positiv als auch negativ sein. Hämoglobin zeigt positiv homotrope (O2 Bindung) und negativ heterotrope (BPG, CO2, H+, Cl-) Effekte. Allosterische Effekte ergeben sich aus Wechselwirkungen zwischen Untereinheiten oligomerer Proteine. Diese Effekte sind schwer zu beschreiben -> Modelle Im Folgenden Modelle für die allosterische Regulation der Sauerstoffaffinität in Hb. Symmetriemodell allosterischer Regulation Annahmen: 1. Allosterisches Protein = Oligomer aus gleichen symmetrisch angeordneten Untereinheiten (Protomeren). 2. Jedes Protomer kann in mindestens 2 Zuständen vorliegen die miteinander im Gleichgewicht sind (Hb in R- oder T- Zustand) unabhängig davon ob Ligand gebunden oder nicht. 3. Ligand kann jeden Konformationszustand binden.konformattionsänderungen können nur Affinität des Liganden beeinflussen. 4. Molekulare Symmetrie bleibt während Konformationswechsel erhalten. Also keine Oligomere von Hb die gleichzeitig r- und t-protomere enthalten. 15

16 C. Sequentielles Modell Symmetrie Modell geht von Lock and Key Mechanismus aus Sequentielles Modell geht von Induced fit aus -> verschiedene Dissoziationskonstanten vrgl. Adair-Gleichung Induced fit -> flexible Wechselwirkung zwischen Ligand und Protein -> Konformationsänderung -> Erhöhen der Affinität. Mit Röntgenstrukturanalyse einige Konformationsänderungen beobachtet -> stützen Induced fit Modell. Ligandenbindung -> Konformationsänderung in der UE -> kooperative WW beeinflussen benachbarte UE durch diese Konformationsänderung -> Affinität für Ligand wird verändert. Dieser Mechanismus ist abhängig von der Stärke der Kopplung der einzelnen UE. Starke Kopplung -> konzertierte Kopplung (-> Symmetrie Modell), schwache Kopplung -> sequentielle Konformationsänderung der einzelnen UE. 16

17 Sequentielles Modell der Allosterie Die Kopplung zwischen den Untereinheiten ist gering -> die Symmetrie der Oligomeren wird nicht aufrecht gehalten. Hb besteht nicht aus identischen Untereinheiten wie es das Symmetrie-Modell verlangt, sie sind jedoch genug ähnlich, dass in erster Näherung die Voraussagen des Symmetrie-Modelles zutreffen. Die Ligandenbindung im T-Zustand bewirkt ein kleine Konformationsänderung wie es das induced fit Modell vorhersagt. Dieses Phänomen wurde auch durch Röntgenstrukturanalyse bestätigt. Das partiell belegte Hb bleibt zunächst im T-Zustand. Die Fe-Atome der α-ue sind jedoch gegenüber dem DesoxyHb um 15pm zum Porphyrinring hin verschoben. -> Solche Veränderungen in der Tertiärstruktur erzeugen die für den T->R Übergang erforderliche Spannung 17

18 4. Abnormale Hämoglobine Über 400 Hämoglobin mutanten bekannt. Bei 95% nur eine einzige AS ausgetauscht. Solche Mutationen werden Hämoglobinopathien genannt. Dagegen werden Störungen in der Hämoglobinsynthese als Thalassämien bezeichent. A. Molekulare Pathologie des Hämoglobins 1. Austausch von AS an der Oberfläche Änderungen von oberflächlich gelegenen AS sind oft unauffällig, da Oberflächen AS keine spezielle Funktion haben. Ausnahme: Sichelzellenanämie (HbS, siehe später). HbE ist die häufigste Mutante nach HbS. Glu B8(26)ß -> Lys, d.h. saure AS wird durch basische ersetzt. Da aber an Oberfläche und keine spezifische Funktion -> keine Folgen 2. Austausch intern gelegener AS Austausch interner AS führt meist zu Destabilisierung von Hämoglobin -> Abbauprodukte, speziell zerfallenes Häm kleben an Zellmembran der Erythrocyten -> vorzeitige Lyse. Träger instabiler Hämoglobine haben hämolytische Anämie 18

19 kleinste Konformationsänderung im Zentrum kann zum Verlust der Bindung von Häm führen -> Funktionslosigkeit Hb Hammersmith Phe CD1(42)ß -> Ser Häm wird herausgelöst Hb Bristol Val E11(67)ß -> Asp Häm wird herausgelöst Hb Bibba Leu H19(136)α -> Pro Helix wird gebrochen -> instabil Hb Savanna Gly B6(24)ß -> Val Überkreuzung B und E Helix gestört Hb Philly Tyr C1(35) α >Phe α1 ß1 Kontakt gestört Molekularer Hintergrund der Sichelzell-Anämie Erythrocyten haben Sichelähnliche Form -> weniger Flexibel -> führt zu fatalen Blockaden des Blutflusses. Durchblutung in Peripherie verschlechtert -> gestörte Blutzirkulation. Mutation führt zur Verklumpung der deformierten Erythrocyten -> Homozygote Träger leiden an hämolytischer Anämie. In Afrika 25% der Bevölkerung heterozygote Träger von HbS GluA3(6)ß -> Val. Bietet Schutz gegen Malaria. Grund: Malaria Parasit benötigt eine bestimmte Kalium-Ionen Konzentration für seine Entwicklung die in normalen EC vorhanden ist. Die HbS Mutation senkt die Kalium-Ionen Konzentration in den SichelZellen und der Parasit kann nicht überleben. Normale EC HbS HbA Sichelförmige EC 19

20 Die HbS-Fasern werden durch intermolekulare Kontakte stabilisiert Anordnung der DesoxyHb Kontakte zwischen Asp73 und Glu 23 auch in HbA -> genügt alleine nicht um Fasern zu Bilden. Jedoch ist auch dieser Kontakt wichtig. Weitere Kontakte -> mischen von Hb verschiedener Mutanten Hb Harlem Glu3 -> Val,Asp73 -> Asn -> höhere Konz. von HbH/S nötig für Polymerisation als für HbA/S Hb Kole-Bu Asp 73 -> Asn Polymerisation auch verzögert. Asp73 wichtig für intermolekulare Kontakte von HbS. Hb Memphis Glu23 -> Gln α UE von HbMemphis und ß-UE von HbS gelieren langsamer. HbS GluA3(6)ß -> Val Glu macht keinen Kontakt OxyHb keine hydrophobe Tasche HbS bildet Fasern die verantwortlich sind für die Sichelfrom der EC. Die EC können platzen und die Fasern treten aus. Fasern des HbS die aus einem Erythrocyten austreten. 20

21 Der Beginn der HbS - Gelbildung ist ein komplexer Prozess Zeitverlauf der Gelbildung von HbS Initiation der Gelbildung durch Temperatursprung von 0 auf 20 C Konz. Abhängigkeit der Gelbildung von DesoxyHb bei 30 C Faserbildung tritt mit einer Zeitlichen Verzögerung auf. Abhängig von: Sauerstoffpartialdruch (T->R Übergang) HbS Konzentration Temperatur n 1 / td = k (ct / cs ) td = Verzögerungszeit ct = total HbS Konzentration cs = Löslichkeit von HbS k,n = Konstanten Zweistufenprozess: 1. Bildung eines Nucleus von HbS Molekülen homogener Nukleationsprozess hohe Konzentrationsabhängigkeit 2. Gebildete Fasern = Nukleationskeime heterogener Nukleationsprozess rasche Beendigung der Gelierung = kinetische Hypothese episodenhaftes Auftreten von Krisen -> Stocken Blutstrom Oxygenierung -> Fasern aufgelöst -> keine Fasern in arteriellem Blut -> Kapillargebiet in 0.5-2s durchströmt -> HbS kann ausfallen wenn aber td > Transitzeit keine Unterbrechung des Blutstroms. td kann verkürzt werden bei Fieber, O2 Mangel oder Dehydratisierung -> Krisen. erhöht Anteil an HbF (wie ist unbekannt) -> andere dynamik in der Faserbildung dauert länger als Aufenthaltsdauer im peripheren Gewebe. 21

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