Aus der Strahlenklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. R. Fietkau
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1 Aus der Strahlenklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. R. Fietkau Unterschiede in der Reparatur von DNA- Doppelstrangbrüchen zwischen einer normalen menschlichen Zelllinie und einer Zelllinie mit Nijmegen Breakage Syndrom in den unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Christina Helene Kunigunde Drescher aus Bamberg
2 Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Referent: Korreferent: Prof. Dr. J. Schüttler Prof. Dr. L. Distel Prof. Dr. R. Sauer Tag der mündlichen Prüfung:
3 Für meine Familie 3
4 Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Methoden Ergebnisse und Beobachtungen Praktische Schlussfolgerungen Summary Background and objective Method Results and observations Conclusion Einleitung Nicht-homologes End Joining Homologe Rekombination Zellzyklus Nijmegen Breakage Syndrom Material und Methoden Immunostaining Prinzip Zellvorbereitung Synchronisieren mit Aphidicolin Röntgenbestrahlung Fixierung und Permeabilisierung Fluoreszenzfärbung Auswertung
5 5 Ergebnisse H2ax Atm Pml Brca pcycline pcdk Rad Nbs343 und DnaPk Diskussion Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Anhang Danksagung Lebenslauf
6 1 Zusammenfassung 1.1 Hintergrund und Ziele Ionisierende Strahlung spielt in der Medizin sowohl in der Strahlentherapie als auch in der Diagnostik und Forschung eine entscheidende Rolle. Durch den Einsatz der ionisierenden Strahlung entstehen verschiedene Arten von DNA-Schäden, u. a. DNA- Doppelstrangbrüche. Diese werden durch zwei verschiedene Methoden, die Homologe Rekombination und das nichthomologe Endjoining, repariert. Bei der Homologen Rekombination, die ausschließlich in der Synthese- sowie G 2 -Phase stattfinden soll, ist eine Fülle von Reparaturproteinen beteiligt. Ziel dieser Arbeit war es, die Unterschiede in der Effizienz der Doppelstrangbruchreparatur zwischen normalen Hautfibroblasten und NBS-defizienten Zellen in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus aufzuzeigen. 1.2 Methoden Es wurde die humane Zelllinie SBL5 eines gesunden Probanden und eine NBS -/- -Zelllinie (SBL3) untersucht. Ein Teil der Zellen wurde mit Hilfe von Aphidicolin, einem speziellen Inhibitor der DNA-Polymerase α, am Übergang von G1 zur Synthesephase arretiert und somit synchronisiert. Beide Zelllinien wurden sowohl in G 0 als auch in der frühen und späten Synthesephase mit 2Gy bestrahlt. Nach unterschiedlichen Reparaturzeiten wurden die verschiedenen Reparaturproteine durch indirekte Immunfluoreszenz sichtbar gemacht. Anschließend wurden die Ergebnisse mit einem Bildanalyseprogramm ausgewertet. 1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Bei Bestrahlung in G 0 traten sowohl bei den normalen Zelllinien als auch bei den NBS -/- -Zelllinien nach 1h die meisten H2ax-Foci auf. Bei 6
7 Bestrahlung in der frühen Synthesephase ließ sich bei den NBSdefizienten Zellen erst nach 3h eine maximale Anzahl von 33,0 H2ax- Foci nachweisen, während man bei den Kontrollzelllinien bereits nach 1h eine maximale Anzahl von 33,0 Foci beobachten konnte. Die NBS -/- - Zelllinien, die in G 0 bestrahlt wurden, zeigten nach 24h ein Minimum von 5,1 Atm-Foci, die Kontrollgruppen verhielten sich genau gegensätzlich mit einem Maximum von 10,0 Atm-Foci nach 24h. Ein deutlicher Unterschied zwischen den NBS-/- Zelllinien und den Kontrollgruppen trat bei Bestrahlung der Zellen in der frühen Synthesephase auf. So ließen sich bei den NBS-defizienten Zellen nach 1h lediglich 1,1 Atm- Foci, bei den Kontrollzelllinien hingegen 16,0 Foci beobachten. Beide Zelllinien verhielten sich auch bei Bestrahlung in der späten Synthesephase unterschiedlich. Bei Bestrahlung in G 0 ließen sich nach 1h Reparaturzeit bei den NBS -/- -Zelllinien mit 32,0 Pml-Foci mehr als doppelt so viele Pml-Foci wie bei den Kontrollgruppen nachweisen. Auch bei Bestrahlung in der frühen und späten Synthesephase konnte man bei den NBS-defizienten Zelllinien eindeutig mehr Pml-Foci als bei den Kontrollzelllinien beobachten. Während es bei den NBS -/- -Zellen zu einem starken Abfall der Brca-Foci von 7,3 Brca1-Foci nach 1h auf 2,7 Foci nach 6h kam, zeigten die Kontrollgruppen einen Anstieg von 7,7 Brca1-Foci nach 1h auf 15,9 Brca1-Foci nach 6h. Nach 24h ließen sich noch 6,5 Brca1-Foci nachweisen. Bei Bestrahlung in der frühen Synthesephase zeigten die zwei unterschiedlichen Zelllinien ein ähnliches Verhalten wie bei Bestrahlung in G Praktische Schlussfolgerungen NBS1 nimmt eine zentrale Position in der Reparatur von DNA- Doppelstrangbrüchen durch die Homologe Rekombination ein. Seine Funktion in den verschiedenen Signalkaskaden der DNA-Reparatur muss weiterhin Gegenstand der heutigen Forschung sein. Des Weiteren kann man festhalten, dass NBS-defiziente Zellen versuchen, der unzureichenden und verzögerten Reparatur von DNA- Doppelstrangbrüchen durch die Proteine der Homologen 7
8 Rekombination mit Hilfe anderer Mechanismen, beispielsweise der Hochregulation der Pml-Foci, entgegenzuwirken. Außerdem muss die Aussage überdacht werden, dass die DNA-Doppelstrangbruchreparatur vor allem in der S- und G 2 -Phase durch die Homologe Rekombination erfolgt, da die Proteine der Homologen Rekombination auch bei Bestrahlung in anderen Phasen des Zellzyklus eine wichtige Rolle zu spielen scheinen. 2 Summary 2.1 Background and objective In medicine ionizing radiation plays an important role in radiotherapy, diagnostics, and research. The use of ionizing radiation causes several types of DNA damages, such as DNA double-strand breaks. Those DNA double-strand breaks are repaired by two different methods, the homologous recombination and the non-homologous end-joining. Plenty of repair proteins are involved in homologous recombination, which is supposed to occur exclusively during synthesis and the G 2 -phase. The aim of this thesis was to analyze differences in the efficiency of doublestrand break repair between human primary dermal fibroblasts and NBS -/- -cells in different phases of the cell cycle. 2.2 Method A normal human cell line SBL5 and a NBS -/- -cell line (SBL3) of a healthy participant were under examination. A portion of cells was locked and thus synchronized with the help of Aphidicolin, a specific inhibitor of DNA polymerase α, at the transition from the G1 phase to synthesis. Both cell lines were irradiated with 2Gy in G 0 and in early and late synthesis. After several repair phases different repair proteins were 8
9 visualized by indirect immunofluorescence. The results were evaluated with an image analysis program. 2.3 Results and observations Most H2ax-Foci occurred both in normal cell lines and in NBS -/- -cell lines one hour after irradiation in G 0. In case of irradiation in the early phase of the synthesis a maximum number of 33.0 H2ax-foci could be detected among the NBS-deficient cells after 3h, whereas a maximum number of 33.0 foci could be observed in control cell lines after 1h. The NBS -/- -cell lines that were irradiated in G 0 revealed a minimum of 5.1 Atm-Foci after 24h, the control groups yielded the opposite result with a maximum of 10.0 Atm-foci after 24h. A significant difference between the NBS -/- -cell lines and the control groups occurred at the irradiation of cells in the early phase of the synthesis. Both cell lines also behaved differently when irradiated in the late synthesis. After irradiation in G 0 and 1h repair time, the NBS -/- -cell lines displayed 32.0 Pml-foci, which are more than twice as many Pml-foci as in the control groups. Even after irradiation during the early and late synthesis, a significantly greater number of Pml-foci could be observed in NBS-deficient cell lines than in the control cell lines. While there was a strong drop of 7.3 Brca1- foci after 1h to 2.7 foci after 6h among the NBS -/- -cells, the control groups showed a rise of 7.7 Brca1-Foci after 1h to 15.9 Foci after 6h. After 24h, one could still find 6.5 Brca1-Foci. During irradiation in the early synthesis the two different cell lines showed similar behavior as for irradiation in G Conclusion NBS1 takes a central position in the repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination. More research needs to be done on its function in various signaling pathways of DNA repair. This study found evidence for the fact that NBS-deficient cells attempt to counter the inadequate and delayed repair of DNA double-strand breaks due to 9
10 homologous recombination proteins with the help of other mechanisms, such as the up-regulation of Pml-foci. In addition, the statement needs to be reconsidered that the DNA double-strand break is repaired by homologous recombination especially in the S and G2 phases since the proteins of homologous recombination also seem to play an important role when irradiated in other phases of the cell cycle. 3 Einleitung Krebserkrankungen sind nach Herz-Kreislauf-Erkrankungen die zweithäufigste Todesursache in den westlichen Industrieländern. In Deutschland erkranken jedes Jahr Menschen an Krebs, wovon daran versterben. Um die Mortalität zu senken, eine Remission des Tumors zu erreichen und die Lebensqualität der Erkrankten zu verbessern, werden, in Abhängigkeit von Tumortyp, Staging und Grading, eine Vielzahl von Behandlungsmethoden kombiniert. Im Rahmen dieses multimodalen Therapiekonzeptes spielt die Strahlentherapie, neben der Operation, der Chemotherapie, der Hormontherapie und der Hyperthermiebehandlung, eine wesentliche Rolle im Kampf gegen eine große Anzahl von Tumoren. Das Ziel dabei ist, die zytotoxischen Effekte auf den Tumor zu maximieren und zugleich die Nebenwirkungen auf das umgebende gesunde Gewebe möglichst gering zu halten. Ionisierende Strahlung wird darüber hinaus auch in der Diagnostik eingesetzt. Daher ist es unerlässlich, die Wirkung ionisierender Strahlen auf gesunde Zellen und deren Reaktion darauf zu erforschen. DNA-Schäden entstehen sowohl durch direkte als auch durch indirekte Strahlenwirkung, bei welcher freie Wasserstoffradikale die DNA schädigen. Es kommt zu Basenmodifikationen, Basenverlusten, Veränderungen der Zuckermoleküle, Einzel- und Doppelstrangbrüchen, DNA-Vernetzungen, 10
11 DNA-Protein-Vernetzungen und Mehrfachereignissen, sog. Bulky Lesions. Jede Zelle besitzt eine Vielzahl von Reparaturmechanismen, welche die entstandenen Schäden an unserer Erbinformation beheben können. Nach dem heutigen Stand der Forschung stehen für die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen, welche bis in die siebziger Jahre als irreparabel und Ursache strahleninduzierter Zellaktivierung angesehen wurden, zwei verschiedene Methoden zur Verfügung, zum einen das nicht-homologe End Joining und zum anderen die Homologe Rekombination. 3.1 Nicht-homologes End Joining Das nicht-homologe End Joining findet nach den heutigen Erkenntnissen der Wissenschaft hauptsächlich in der G 0 - und G 1 - Phase des Zellzyklus statt, während die Homologe Rekombination ausschließlich in der Synthese- sowie G 2 - Phase anläuft (Fukushima et al. 2001; Jackson 2002; Lee et al. 1997; Rothkamm et al. 2003; Takata et al. 1998). Beim nicht-homologen Endjoining verbinden Ligasen die beiden freien DNA-Doppelstrangbruchenden miteinander. Da die Fusionsstelle nicht, beziehungsweise nur geringfügig nukleolytisch bearbeitet wird, ist das nicht-homologe End Joining eine potentiell mit Fehlern behaftete Reparatur und kann somit zu Deletionen und Mutationen führen (Lisby et al. 2005). In humanen Zellen sind ein Heterodimer aus KU70/KU80, die DNA-Proteinkinase (DNA- PK), die ARTEMIS Nuklease und der LigIV/XrccIV Ligasekomplex am NHEJ beteiligt. Die DNA-PK setzt sich aus drei Untereinheiten zusammen. Einer katalytischen Untereinheit (DNA-PKcs), welche mit ARTEMIS einen Komplex bildet, der für die nukleolytische Bearbeitung der Enden eine Rolle spielt und zwei DNAbindende Untereinheiten KU70 und KU80, die ein stabiles Heterodimer (KU70/KU80) bilden, welches die DNA vor Degradation schützt. Die 11
12 DNA- LigaseIV ist die DSB- Reparatur-Ligase und bildet mit Xrcc4, welches Stabilität und Aktivität der Ligase beeinflusst, einen Komplex (LigIV/XrccIV) (Koike 2002; Lees-Miller et al. 2003; Lieber et al. 2003; Martin et al. 2002; Timson et al. 2000). Nach dem heutigen Stand der Wissenschaft laufen die molekularen Mechanismen des NHEJ folgendermaßen ab: zuerst binden KU70 und KU80 an den Enden der DNA, um sie für die Ligation vorzubereiten und sie vor Verdauung durch Exonucleasen zu schützten. Außerdem rekrutieren sie die DNA- PKcs zum DSB und aktivieren ihre Kinase- Funktion. Autophosphorylierung der DNA- PK bewirkt eine Konformationsänderung, welche Faktoren für die Modifikation der DNA- Enden an die DNA heranlässt. Nun kommt es mit Hilfe von ARTEMIS zum End Processing, bei dem einzelne Nukleotide herausgeschnitten werden können. Ein anderer Kandidat, der möglicherweise am End Processing beteiligt ist, ist der Mre11/Rad50/Nbs1- (MRN-) Komplex, denn er besitzt eine Exonuklease-, Endonuklease- und Helikasefunktion (Paull et al. 1999; Trujillo et al. 1998). Anschließend folgt die Ligation der DNA mit Hilfe des LigIV/XrccIV Komplex. Zum Ende kommt es durch Autophosphorylierung der DNA-PK zur Dissoziation dieser von der DNA und von KU70/80 (Meek et al. 2004). 3.2 Homologe Rekombination Im Gegensatz zum NHEJ ist es durch die Homologe Rekombination möglich, auch komplexere Schäden fehlerfrei zu reparieren. Daher wird sie vor allem bei Zellen verwendet, welche die Meiose ausführen, um eine genetische Stabilität zu garantieren (Moens et al. 2002; Plug et al. 1998). Bei der Homologen Rekombination wird das Schwesterchromosom, das während der Synthese- und G 2 -Phase als Schablone im Zellkern verfügbar ist, genutzt, um die fehlende Erbinformation über eine Synapsenbildung von der intakten Vorlage zu übernehmen (Fukushima 2001; Jackson 2002; Lee 1997; Rothkamm 2003; Takata 1998) 12
13 Der erste Schritt der Reparatur besteht in der Identifikation des DNA- Schadens. Dabei scheint der MRN- Komplex, welcher direkt an die DNA- Enden bindet, der früheste Sensor von DNA- Doppelstrangbrüchen zu sein (Carson et al. 2003). Anschließend findet eine großzügige 5 Resektion der DNA- Enden durch eine unbekannte Nuklease statt. Möglicherweise ist der MRN-Komplex beteiligt (Leuther et al. 1999), denn die Nuklease Mre11 aus dem MRN-Komplex kann die so genannten dirty ends der DNA zurechtschneiden (Liu et al. 2002; Lobachev et al. 2002). Nun folgt die Homologe Rekombination durch die Rekombinationsproteine der Rad52 Gruppe (Yuan et al. 2003). Das Rad51- Nukleoproteinfilament und seine paralogen Proteine Rad51B, C, D und Xrcc2, Xrcc3 treten mit der unbeschädigten DNA in Wechselwirkung und katalysieren, wenn sie ein Homologes Stück gefunden haben, den Strangaustausch (Petukhova et al. 1998; Wood et al. 2001). Das Replikationsprotein A (RPA) interagiert ebenfalls mit Rad51 und soll die Rad51 vermittelte DNA- Paarung stabilisieren (Eggler et al. 2002). Es wurde auch die Interaktion von BRCA1 und BRCA2 (durch sein BRC Motiv) an Rad51 gezeigt, die wahrscheinlich zur Lokalisation von Rad51 in den Kern sowie zur Bildung von Foci an beschädigter DNA führt (Chen et al. 1999; Davies et al. 2001; Scully et al. 2000). Das 3 Ende der beschädigten DNA wird nun von einer DNA- Polymerase verlängert, welche die Informationen hierfür vom unbeschädigten Schwesterchromatid bezieht. Daraufhin werden die Enden von einer Ligase verbunden (Haber 2000). Abschließend kommt es zum Zerfall des Reparaturkomplexes und zur Fortsetzung des Zellzyklus (Lisby et al. 2004). Mit der Homologen Rekombination ist ein potentiell fehlerfreies Reparatursystem vorhanden, das in der Lage ist auch schwere Schäden zu beheben. 13
14 3.3 Zellzyklus Wenn die normalen Regelkreisläufe zwischen Zellteilung und Zellinaktivierung gestört sind, besteht die Gefahr, dass sich Zellen zu Tumorzellen entwickeln. Dies kann sowohl durch eine zu häufige Zellteilung als auch durch fehlenden programmierten Zelltod, also das Fehlen der Apoptose, ausgelöst werden. Vor ihrer Teilung müssen alle Zellen den mehrphasigen Zellzyklus vollständig durchlaufen. Alle bekannten Regulationsmechanismen der Zellteilung sind mit der Zellzykluskontrolle verknüpft. Bei intakter Kontrolle des Zellzyklus ist die Tumorentwicklung erschwert, da die Zellteilung bei nicht reparierten DNA-Schäden nur eingeschränkt möglich ist. Die Phasen des Zellzyklus sind die G 0 -, G 1 -, Synthese S-, G 2 -Phase und die Mitose. Zwischen den Teilungen befinden sich die Zellen in der G 0 -Phase. Um fehlende Zellen zu ersetzen, wird die Zellteilung durch Signale von außen und von der Zelle selbst aktiviert. Daraufhin geht die Zelle in die G 1 - Phase über, in welcher zur Vorbereitung auf die S- Phase v. a. Proteine synthetisiert werden. Während der S- Phase findet die DNA- Synthese statt. In der darauf folgenden G 2 - Phase wird der Zellzustand überprüft und alle für die Zellteilung erforderlichen Proteine produziert, damit in der anschließenden Mitose-Phase die Zellteilung vollzogen werden kann. Die beiden entstandenen Zellen können dann entweder in die G 0 -Phase oder -in Abhängigkeit von ihrem Aktivierungsgrad- wieder in die G 1 - Phase eintreten. Im Zellzyklus sind mehrere Sicherungssysteme vorhanden, so kann er z.b. nur in eine Richtung durchlaufen werden. Im vorwärtsgerichteten Sicherungssystem spielen die Cyclin-abhängigen Kinasen (Cdk) die Hauptrolle. Für eine Aktivierung benötigen sie Cyclin als spezifischen Bindungspartner. Zusätzlich muss der Cdk- Cyclin-Komplex phosphoryliert werden. Danach kann die Zelle den Zellzyklus durchlaufen. Demgegenüber steht ein hemmendes System, welches eine Komplexbildung zwischen Cdks und Cyclinen verhindert. 14
15 Einen weiteren Regulationsmechanismus stellen die Kontrollpunkte, so genannte Checkpoints, dar, an welchen die Zelle angehalten, überprüft und gegebenenfalls repariert oder vernichtet wird. 3.4 Nijmegen Breakage Syndrom Das Nijmegen Breakage Syndrom ist mit etwa 100 betroffenen Familien weltweit eine sehr seltene Erkrankung. Die höchste Prävalenz findet sich in Osteuropa, insbesondere in Polen, Tschechien und der Ukraine (Varon et al. 2000). Die Erkrankung wird autosomal-rezessiv vererbt und gehört wie die Ataxia teleangiectasia, das Bloom`s Syndrom und die Fanconi Anämie zu den erblichen Chromosomenbruchsyndromen. Diese Erkrankungen sind durch spontan auftretende Chromsomenabberationen und eine Überempfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung gekennzeichnet. So kann z.b. der therapeutische Einsatz ionisierender Strahlen bei Patienten mit Nijmegen Breakage Syndrom zu schweren Komplikationen bis hin zum Tod führen (Distel et al. 2003). Die klinische Ausprägung des Nijmegen Breakage Syndrom ist sehr variabel. Charakteristisch für die Erkrankung ist ein vogelähnliches Gesicht, schwere Mikrozephalie, frühe Entwicklungsverzögerung, Immunschwäche und das gehäufte Auftreten von Malignomen (Antoccia et al. 2006). Zunächst hielt man das Nijmegen Breakage Syndrom aufgrund zahlreicher Übereinstimmungen sowohl im klinischen Erscheinungsbild als auch auf zellulärer Ebene für eine Variante der Ataxia Teleangiectasia (Jaspers et al. 1988). Jedoch konnte durch Entdeckung des NBS1-Gens auf Chromosom 8q21-24 (Kobayashi et al. 2004) nachgewiesen werden, dass es sich bei AT und NBS um zwei genetisch distinkte Erkrankungen handelt. NBS1 bildet mit MRE11/RAD50 einen multimerischen Komplex (Antoccia 2006) und ist in der Lage in der beschädigten Zelle mithilfe von H2AX Doppelstrangbrüche zu erkennen (Tauchi et al. 2002). H2AX wird bei Bestrahlung durch Atm phosphoryliert (Modesti et al. 2001; 15
16 Redon et al. 2002), somit reguliert ATM die Interaktion zwischen NBS1 und H2AX. Auch ist NBS1 als Substrat von ATM in der Signaltransduktion der Zellzyklus-Checkpoints involviert. Sind diese Mechanismen fehlerhaft, kann die Zelle trotz vorhandener Doppelstrangbrüche weiterhin DNA synthetisieren. Dies wird als radioresistente DNA- Synthese (Petrini 2000) bezeichnet. 4 Material und Methoden 4.1 Immunostaining Prinzip Das Immunostaining dient dazu mit Hilfe von fluoreszierenden Antikörpern Proteine im Fluoreszenzmikroskop direkt in der Zelle sichtbar zu machen. Hier sollten vor allem Reparaturproteine im Kern der Zelle, die nach der Aktivierung durch Strahlung als so genannte Foci erkennbar sind, untersucht werden. Deren Veränderung bezüglich Anzahl, Zustand, Lumineszenz sowie Kolokalisation mit anderen Proteinen soll nach vorhergehender Behandlung dargestellt werden. Die indirekte Methode der Immunfluoreszenz, welche in dieser Arbeit angewandt wird, erfolgt in zwei Schritten. Zuerst wird ein Primärantikörper, welcher aus einer bestimmten Tierart gewonnen wird, verwendet. Dieser ist gegen ein spezielles Protein gerichtet. Der darauf folgende zweite Schritt besteht aus der Anwendung eines fluoreszierenden Sekundärantikörpers, welcher gegen den Antikörper der Tierart gerichtet ist, aus welcher der Primärantikörper stammt. Dieser markiert folglich fluoreszierend den schon am Protein gebundenen Primärantikörper. Beispiel: Ein Primärantikörper von der Maus gegen Pml wird durch einen mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Sekundärantikörper, der vom Hasen stammt und gegen Mausimmunglobulin gerichtet ist, sichtbar gemacht. 16
17 4.1.2 Zellvorbereitung Die für die Versuche verwendeten humanen Zelllinien bestehen aus den Hautfibroblasten eines gesunden Probanden (SBL5-Zellen) und eines Probanden mit Nijmegen Breakage Syndrom (SBL3-Zellen). Diese werden jeweils in einer Zellkulturflasche mit Fibroblastenmedium (s. Anhang; Anlage 1) bei 37 C im Brutschrank (5% CO 2 ) kultiviert. Für einen Versuch mit vier Objektträgern ist etwa die Zellmenge einer großen 75 cm 2 Kulturflasche nötig. Vor Beginn des Versuchs wird der Zustand bzw. die Vitalität der Zellen mithilfe eines Mikroskops überprüft. Anschließend wird das Medium aus der Kulturflasche abpipettiert, um die Zellen in 5ml 1xPBS-Waschlösung (450ml destilliertes Wasser, 50ml steriles 10x PBS) zu waschen. Nach wiederholtem Schwenken wird diese ebenfalls abpipettiert. Um die Zellen vom Boden der Kulturflasche zu lösen, werden nun 2ml Trypsin (45ml 1x PBS, 5ml 10x Trypsin) hinzugefügt. Nach einer Inkubationszeit von ca. 2-5 Minuten im Brutschrank und anschließender mikroskopischer Mobilitätsprüfung der Zellen wird die Wirkung des Trypsins durch die Zugabe von 8ml Medium gestoppt. Die Zellsuspension wird in ein Zentrifugenröhrchen überführt und für 8 Minuten bei 173g und 20 C zentrifugiert. Daraufhin wird der Überstand verworfen und das entstandene Zellpellet mit 1ml Medium resuspendiert. Nun werden die vier Fächer einer Quadripermschale mit je einem sterilen Deckgläschen versehen und jedes Gläschen mit 5ml Medium überschichtet. Dabei ist darauf zu achten, dass sich zwischen der Unterseite der Deckgläschen und dem Boden der Quadripermschale keine Luftblasen bilden. Dann wird auf jedes Deckgläschen 250 µl Zellsuspension, möglichst gleichmäßig verteilt, pipettiert. Um den Zellen ein Anwachsen auf den Deckgläschen zu ermöglichen, wird die 17
18 Quadripermschale als nächstes -in Abhängigkeit vom Versuch- für 48 bzw. 24 Stunden bei 37 C in den Brutschrank gestellt Synchronisieren mit Aphidicolin Aphidicolin ist ein spezieller Inhibitor der DNA-Polymerase α und bewirkt, dass keine DNA- Synthese mehr durchgeführt werden kann und die Zellen am Übergang von G1 zur Synthesephase arretiert und somit synchronisiert werden. Diese Methode wird bei einigen Versuchen eingesetzt. 1mg Aphidicolin (Sigma A0781) wird in 200 µl DMSO gelöst, um die Stammlösung I mit 5 µg/ µl herzustellen. Diese muss, aliquotiert zu je 20 µl, bei -80 C gelagert werden. Die Stammlösung I wird noch einmal im Verhältnis 1:10 verdünnt, d.h. zu 2 µl Aphidicolin werden 18 µl Medium hinzugefügt, um die Stammlösung II mit 0,5 µg/ µl zu erhalten. Zum Erhalt der Zielkonzentration von 1 µg/ µl werden 5 µl Stammlösung II pro 2,5 ml Medium zugegeben. Bei der Anwendung von Aphidicolin ist folgendermaßen vorzugehen: Vor dem Aussäen werden die Zellen in den Kulturflaschen durch ihr konfluentes Wachstum, welches eine Kontaktinhibition bewirkt, in G1 arretiert. Die konfluenten Zellen werden dann trypsiniert und in gewohnter Weise -nicht konfluent - in eine Quadripermschale ausgesät. Durch die Zugabe von 10 µl Aphidicolin pro Fach werden die Zellen am Übergang von G 1 zur Synthesephase arretiert. Anschließend wird die Quadripermschale für 24 Stunden bei 37 C in den Brutschrank gestellt. Nach dem dreimaligen Auswaschen des Aphidicolins mit 1xPBS- Waschlösung (450ml destilliertes Wasser, 50ml steriles 10x PBS) und der Zugabe von Medium beginnen die am G 1 /S-Phase-Übergang arretierten Zellen die frühe und die späte Synthesephase innerhalb von acht Stunden zu durchlaufen. Zellen, die sich während der Aphidicolinzugabe bereits in der Synthesephase befinden, werden an der entsprechenden Stelle arretiert. 18
19 4.1.4 Röntgenbestrahlung Nach der entsprechenden Regenerationszeit können die Zellen -in Abhängigkeit vom Versuch- behandelt werden. Die Behandlung mit Röntgenstrahlung erfolgt an einer General Electric- Isovolt Titan 160- Röntgenröhre mit 2mm Aluminium-Filter. Nach der Behandlung werden die Zellen, entsprechend dem Versuch, für eine bestimmte Reparaturzeit wieder in den Brutschrank zurückgestellt Fixierung und Permeabilisierung Um die Zellen zu fixieren und die Membranen der Zellen für die Antikörper permeabel zu machen, werden die Deckgläschen in eine Küvette übertragen und für 15 Minuten unter dem Abzug mit einer 4%- igen Formaldehyd-Lösung (siehe Anhang; Anlage 2) versehen. Anschließend wird die Formaldehydlösung dekantiert und die Deckgläschen werden in der Küvette dreimal für jeweils fünf Minuten auf dem Orbitalshaker gewaschen. Danach wird die Küvette mit Blockierpuffer (siehe Anhang; Anlage 3) gefüllt und über Nacht oder auch länger im Kühlschrank aufbewahrt Fluoreszenzfärbung Vor Beginn des Färbevorgangs wird der Blockierpuffer abgegossen und die Deckgläschen werden erneut dreimal für je fünf Minuten auf dem Rüttler gewaschen. Die Gläschen werden nun aus der Küvette genommen und zum Trocknen aufgestellt. Mit einem Fettstift werden die Deckgläser in vier Felder unterteilt, auf welche jeweils unterschiedliche Primärantikörperkombinationen aufgetragen werden können. Pro Feld können zwei verschiedene Primärantikörper, die von unterschiedlichen Tierarten stammen müssen, verwendet werden. Nach vorheriger Austestung der Konzentrationen (siehe Tabelle 1) werden die Primärantikörper mit 1% BSA in 1xTBS-Lösung angesetzt. 19
20 Tabelle 1: Primärantikörper für Immunostaining Antikörper Hersteller Konz anti-h2ax pser139 (mouse) Upstate, New York, USA 1 : 100 anti-h2ax pser139 (mouse) Upstate, New York, USA 1 : 2000 anti-atm p1981 (rabbit) Cell Signaling, Boston, USA 1: 200 anti-atm p1981 (rabbit) Cell Signaling, Boston, USA 1: 300 anti-pml (PG-M3): sc-966 (mouse) Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA 1: 50 anti-phospho-brca1 (Ser1524) Cell Signaling, Boston, USA 1: 50 (rabbit) anti-rad52 (rabbit) Cell Signaling, Boston, USA 1: 50 anti-phospho-cycline (Thr62) Cell Signaling, Boston, USA 1: 50 (rabbit) anti-phospho-cdk2 (Thr160) Cell Signaling, Boston, USA 1: 50 (rabbit) anti-dna-pk p2609 (mouse) Biozol, Eching, Germany 1: 250 anti-nbs p343 (rabbit) 1: 500 Je Feld werden 25 µl der Primärantikörperlösung aufgetragen und mit einem Coverslip bedeckt. Die Inkubation der Primärantikörper erfolgt über Nacht in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur. Nach dem Entfernen der Coverslips sind erneut drei Waschvorgänge mit 1xTBS- Lösung für je 5 Minuten in einer Küvette auf dem Orbitalshaker erforderlich. Tabelle 2: Fluoreszierende Sekundärantikörper für Immunostaining Antikörper Hersteller Konz Alexa Fluor 594 donkey / Molecular Probes, 1: 50 anti-mouse (rot) Göttingen, Deutschland Alexa Fluor 488 chicken / anti-rabbit (grün) Molecular Probes, Göttingen, Deutschland 1 :
21 Nun wird der jeweils passende, mit Fluoreszenz- Farbstoff- gekoppelte Sekundärantikörper, dessen Konzentration ebenfalls bereits ausgetestet wurde, mit 1% BSA in 1xTBS- Lösung angesetzt (siehe Tabelle 2). Nach kurzem Trocknen der Deckgläser wird 25 µl der Sekundärantikörperlösung pro Feld aufgetragen. Wenn zwei verschiedene Primärantikörper auf einem Feld aufgetragen werden, muss ein Sekundärantikörper mit rotem Fluoreszenzfarbstoff gegen den einen, und einer mit grünem Farbstoff gegen den anderen verwendet werden. Anschließend werden die Deckgläschen abermals mit Coverslips bedeckt und zur Inkubation für fünf Stunden bei Raumtemperatur in die Feuchtkammer gelegt. Es folgen wiederum drei fünfminütige Waschvorgänge mit 1xTBS-Lösung. Jetzt wird die Gegenfärbung mit DAPI (0,1 µl DAPI, 1ml 4xSSC/ Tween), welches die DNA im gesamten Zellkern anfärbt, wodurch dieser unter dem Fluoreszenzmikroskop blau erscheint, durchgeführt. Pro Deckglas werden 50 µl DAPI aufgetragen und mit Coverslips bedeckt. Nach einer einminütigen Einwirkzeit im Dunkeln werden die Coverslips wieder abgezogen, die Deckgläschen kurz in destilliertes Wasser getaucht und zum Trocknen aufgestellt. Auf die Deckgläschen wird jeweils 20 µl Eindeckmedium (Vectashield) aufgetragen und die zuvor beschrifteten Objektträger werden darüber gelegt Auswertung Für die Beurteilung der Versuche wurde eine automatisierte Auswertung entwickelt, die das routinemäßige bildanalytische Auszählen von mehreren hundert Zellen in kurzer Zeit ermöglicht. Mit Hilfe eines vollautomatisierten Mikroskops (Leica 6000B) wird je nach Zelldichte eine Matrix von 5x5 bis 10x10 Bildern aufgenommen und zu einem Gesamtbild zusammengesetzt. Zuvor wird in den vier Ecken der Matrix auf die Mittelebene der Dapi-Färbung scharf gestellt und diese Z-Werte in den prädiktiven Autofokus eingelesen. Durch diesen Autofokus wird dann über den gesamten Bereich auf die Mittelebene der Zellen scharf 21
22 gestellt. Es wird je ein Bild der Zellen mit der DAPI-Färbung, eines beispielsweise mit der pcdk2- und eines z.b. mit der γ-h2ax-färbung aufgenommen. Durch das Bildanalyseprogramm SortCells erfolgt dann die automatische Selektion der Zellen in der DAPI-Färbung und die Einordnung in eine Matrix. Entsprechend der Koordinaten der DAPI- Färbung werden die Zellen mit der pcdk2- und der H2ax-Färbung ebenfalls in eine entsprechende Matrix sortiert. Anschließemd werden diese sortierten und markierten Zellen von dem Programm CountFoci aufgerufen und nach einem inversen Watershed-Verfahren automatisch erkannt und markiert. Nicht korrekt markierte bzw. fehlende Foci können vom Auswerter entfernt bzw. hinzugefügt werden. Anschließend werden folgende Daten jeweils für beide Proteine in eine Exceldatei übertragen: -Anzahl der Foci -Kolokalisation der Proteine -Fläche der Foci (µm 2 ) -Durchschnittliche Helligkeit der Foci (Luminance in Graustufen) -Maximale Helligkeit (Luminance in Graustufen) -Fläche der Kerne (µm 2 ) -Helligkeit der Kerne (Luminance in Graustufen) -Helligkeit außerhalb der Kerne (Luminance in Graustufen) In der Datenbank können dann entsprechende Auswertungen vorgenommen werden, wie z.b. die Berechnung der Durchschnittswerte und der zugehörigen Statistik. Weiter ist auch die Kategorisierung in Gruppen möglich oder die Ausgabe der Verteilungen der Werte. 22
23 5 Ergebnisse Wie bereits erwähnt, wird zurzeit angenommen, dass für die DNA- Doppelstrangbruchreparatur mindestens zwei unabhängige Reparatursysteme existieren. Dabei soll das Nicht-homologe Endjoining vor allem in der G 0 -/G 1 -Phase, die Homologe Rekombination in der Synthesephase die DSBs reparieren. Es wurde untersucht, zu welchen Zeitpunkten der G 0 -, G 1 - und Synthesephase die Zellen wie effizient die Doppelstrangbrüche reparieren. Dafür wurden eine reparaturkompetente und eine NBS-defiziente Zelllinie verwendet, die Zellen mit Hilfe von Aphidicolin synchronisiert und zu verschiedenen Zeitpunkten im Zellzyklus bestrahlt und die anschließende Reparatur der DNA-Doppelstrangbrüche überprüft. 23
24 5.1 H2ax Bei Bestrahlung in G 0 (Abbildung 1) wurden bei beiden Zelllinien nach 1h die meisten H2ax-Foci beobachtet. Es ließ sich eine steile Abnahme der H2ax-Foci in den ersten Stunden bis auf 7 Foci nach 24h aufzeigen Foci pro Zelle Kontrolle NBS-/ Zeit (Stunden) Abbildung 1: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von H2ax bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in G 0 mit 2Gy. Im Gegensatz dazu zeigte sich nach Bestrahlung in der frühen Synthesephase (Abbildung 2) bei den NBS -/- -Zelllinien erst nach 3h eine maximale Anzahl von 33 H2ax-Foci, während bei den Kontrollzelllinien bereits nach 1h eine maximale Anzahl von 33 Foci auftrat. Auffällig war außerdem die stärkere und schnellere Abnahme der Foci-Anzahl in der Kontrollzelllinie. 24
25 Foci pro Zelle Kontrolle NBS-/ Zeit (Stunden) Abbildung 2: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von H2ax bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in der frühen Synthesephase mit 2Gy. Bei Bestrahlung in der späten Synthesephase (Abbildung 3) zeigten sich nach 1h bei den NBS-defizienten Zellen 7 Foci mehr als in der Kontrollgruppe. Nach 3h war bei den Kontrollzelllinien das Maximum mit 15 Foci erreicht, die NBS -/- -Zellen wiesen erst nach 6h eine maximale Foci-Zahl von 16 auf. Nach 24h konnte man bei der NBS -/- -Zelllinie 12,5 gegenüber 8,5 Foci bei der Kontrollgruppe beobachten. 25
26 Foci pro Zelle Kontrolle NBS-/ Zeit (Stunden) Abbildung 3: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von H2ax bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in der späten Synthesephase mit 2Gy. 5.2 Atm Bei Bestrahlung von Zellen in G 0 (Abbildung 4) zeigten sich bei den Kontrollzelllinien nach 1h 8,0 Atm-Foci. Nach einem initialen Abfall trat ein kontinuierlicher Anstieg der Foci-Zahl auf. Nach 24h konnte man 10,0 Foci bei der Kontrollgruppe finden. Die NBS-defizienten Zelllinien verhielten sich annähernd spiegelbildlich zu den Kontrollgruppen. Zu Beginn zeigten sich 7,3 Atm-Foci, allerdings kam es nach kurzem Anstieg der Foci zu einem stetigen Abfall auf 5,1 Foci nach 24h. 26
27 20 Foci pro Zelle Kontrolle NBS-/ Zeit (Stunden) Abbildung 4: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von Atm bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in G 0 mit 2Gy. Ein besonders großer Unterschied zwischen den NBS -/- -Zelllinien und den Kontrollgruppen zeigte sich bei der Bestrahlung der Zellen in der frühen Synthesephase (Abbildung 5). Bei den NBS-defizienten Zellen ließen sich nach 1h lediglich 1,1 Atm-Foci beobachten, während bei den Kontrollzelllinien 16,0 Foci auftraten. Des Weiteren ließ sich ein starker Anstieg bei den NBS -/- -Zellen mit 7,4 Atm-Foci nach 6h und 8,2 Foci nach 24h nachweisen, während es bei den Kontrollzelllinien zu einem raschen Abfall der Foci auf 4,8 Atm-Foci nach 12h und 6,3 Foci nach 24h kam. 27
28 20 15 Kontrolle NBS-/- Foci pro Zelle Zeit (Stunden) Abbildung 5: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von Atm bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in der frühen Synthesephase mit 2Gy. Auch bei Bestrahlung in der späten Synthesephase verhielten sich die NBS-defizienten und die Kontrollzelllinien divergent (Abbildung 6). Bei den NBS -/- -Zellen konnte man 9,8 nach 1h mit einem Abfall auf 7,7 Atm- Foci nach 24h aufzeigen. Im Gegensatz dazu zeigten die Kontrollgruppen mit initial 8,8 Foci nach 3h einen starken Anstieg auf 16,0 Atm-Foci, welche nach 24h auf lediglich 9,8 Foci, den 1h-Wert der NBS -/- -Zellen, zurückgingen. 28
29 20 15 Kontrolle NBS-/- Foci pro Zelle Zeit (Stunden) Abbildung 6: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von Atm bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in der späten Synthesephase mit 2Gy. 5.3 Pml Bei Bestrahlung von Zellen in G 0 (Abbildung 7) zeigten sich nach 1h Reparaturzeit in den NBS-defizienten Zelllinien über doppelt so viele Pml-Foci (32,0 Foci) wie bei den Kontrollgruppen (14,3 Foci). Nach 24h konnte man einen Anstieg der Pml-Foci auf 38,2 Foci bei den NBS -/- -Zellen und auf 24,5 Foci bei den Kontrollzelllinien feststellen. 29
30 Kontrolle NBS-/- Foci pro Zelle Zeit (Stunden) Abbildung 7: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von Pml bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in G 0 mit 2Gy. Auch bei Bestrahlung der Zellen in der frühen Sythesephase (Abbildung 8) traten nach Reparaturzeiten von 30 min bis 24h in den NBS -/- -Zellen generell mehr Pml-Foci als in den Kontrollgruppen auf. Während bei den Kontrollzelllinien die Foci-Zahl mit 16,2 Pml-Foci annähernd konstant blieb, kam es bei den NBS-defizienten Zellen nach einem 30min-Wert von 24,0 Foci und leichtem Abfall mit einem 6h-Wert von 22,2 Foci zu einem Anstieg auf 29,3 Foci nach 24h. 30
31 Foci pro Zelle Kontrolle NBS-/ Zeit (Stunden) Abbildung 8: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von Pml bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in der frühen Synthesephase mit 2Gy. Bei den in der späten Synthesephase bestrahlten NBS -/- -Zellen (Abbildung 9) ließen sich nach den unterschiedlichen Reparaturzeiten durchschnittlich 4 7 Pml-Foci mehr als bei den Kontrollzelllinien nachweisen. Allerdings traten bei den NBS-defizienten Zellen bei Bestrahlung in dieser Phase des Zellzyklus deutlich weniger Pml-Foci als bei Bestrahlung in G 0 bzw. in der frühen Synthesephase auf. 31
32 Foci pro Zelle Kontrolle NBS-/ Zeit (Stunden) Abbildung 9: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von Pml bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in der späten Synthesephase mit 2Gy. 5.4 Brca1 Sowohl bei den NBS -/- -Zelllinien als auch bei den Kontrollzelllinien (Abbildung 10) trat bei Bestrahlung der Zellen in G 0 nach 1h eine ungefähr gleiche Brca1-Foci-Anzahl (NBS-defiziente Zellen 7,3 Brca1- Foci, Kontrollgruppen 7,7 Brca1-Foci) auf. Während es bei den NBSdefizienten Zelllinien anschließend zu einem starken Abfall der BRCA- Foci auf 2,7 Foci kam, zeigten die Kontrollzelllinien einen Maximalwert von 15,9 Brca1-Foci nach 6h. Nach 24h ließen sich 6,5 Brca1-Foci nachweisen. 32
33 Foci pro Zelle Kontrolle NBS-/ Zeit (Stunden) Abbildung 10: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von Brca1 bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in G 0 mit 2Gy. Ein großer Unterschied zwischen den Kontroll- und NBS -/- -Zelllinien ließ sich auch bei Bestrahlung der Zellen in der frühen Synthesephase erkennen (Abbildung 11). Bei den NBS-defizienten Zellen konnte man 8,0 Brca1-Foci nach 30min und einen kontinuierlichen Abfall auf 2,0 Brca1-Foci nach 24h beobachten. Die Kontrollgruppen zeigten nach 30min 7,3 BRCA1 Foci. Im Gegensatz zu den NBS -/- -Zelllinien kam es dann zu einem steilen Anstieg der Foci bis zu 12,7 Foci nach 3h, daraufhin folgte ein Abfall auf 6,2 Foci nach 12h und 5,9 Foci nach 24h. 33
34 Foci pro Zelle Kontrolle NBS-/ Zeit (Stunden) Abbildung 11: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von Brca1 bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in der frühen Synthesephase mit 2Gy. Bei Bestrahlung der Zellen in der späten Synthesephase (Abbildung 12) zeigten die NBS-defizienten Zellen einen Maximalwert von 16,1 Brca1- Foci nach 3h. Nach 24h konnte man noch 14,0 Foci beobachten. Bei den Kontrollzelllinien trat nach 6h ein Höchstwert von 15,1 Brca1-Foci auf, nach 24h waren noch 14,3 Foci nachweisbar. 34
35 Foci pro Zelle Kontrolle NBS-/ Zeit (Stunden) Abbildung 12: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von Brca1 bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in der späten Synthesephase mit 2Gy. 5.5 pcycline Bei Bestrahlung in G 0 traten bei den NBS-defizienten Zelllinien nach 3h die meisten pcycline-foci auf (Abbildung 13). Nach 24h konnte man eine Abnahme der Foci auf 5,1 aufzeigen. Bei den Kontrollgruppen ließ sich hingegen ein kontinuierlicher Anstieg der pcycline-foci von 7,0 nach 1h auf 9,9 nach 24h beobachten. 35
36 15 Kontrolle NBS-/- Foci pro Zelle Zeit (Stunden) Abbildung 13: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von pcycline bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in G 0 mit 2Gy. Auch bei Bestrahlung in der frühen Synthesephase zeigte sich bei den NBS -/- -Zellen nach 3h eine maximale Anzahl der pcycline-foci (Abbildung 14). Der 24h-Wert lag bei 5,1. In dieser Phase des Zellzyklus zeigte sich bei den Kontrollzelllinien ebenfalls ein Anstieg der pcycline-foci von 4,8 nach 1h auf 7,7 nach 24h. 36
37 15 Kontrolle NBS-/- Foci pro Zelle Zeit (Stunden) Abbildung 14: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von pcycline bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in der frühen Synthesephase mit 2Gy. Die in der späten Synthesephase bestrahlten NBS-defizienten Zellen und die Kontrollzelllinien zeigen einen annähernd gleichen Verlauf (Abbildung 15), wobei die Zahl der pcycline-foci in den Kontrollgruppen deutlich über der der NBS -/- -Zellen liegt. So ließen sich bei den Kontrollzelllinien nach 3h 10,0 pcycine-foci und nach 24h 9,2 Foci nachweisen, bei den NBS-defizienten Zelllinien traten nach 3h lediglich 3,4 pcycline-foci und nach 24h 7,1Foci auf. 37
38 15 Kontrolle NBS-/- Foci pro Zelle Zeit (Stunden) Abbildung 15: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von pcycline bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in der späten Synthesephase mit 2Gy. 5.6 pcdk2 Bei Bestrahlung in G 0 trat bei den Kontrollzelllinien zunächst ein Anstieg der pcdk2-foci von 4,0 nach 1h auf 6,8 nach 6h auf (Abbildung 16). Nach 24h ließ sich ein Abfall der Foci-Zahl auf 5,0 beobachten. Im Gegensatz dazu kam es bei den NBS-defizienten Zelllinien nach einem 1h-Wert von 1,9 pcdk2-foci zu einem Abfall der Foci-Zahl auf 0,5 nach 6h. Daraufhin folgte ein Anstieg auf 2,4 pcdk2-foci nach 24h. 38
39 10 Kontrolle NBS-/- 8 Foci pro Zelle Zeit (Stunden) Abbildung 16: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von pcdk2 bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in G 0 mit 2Gy. Bei NBS -/- -Zellen, die in der frühen Synthesephase bestrahlt wurden, kam es nach 6h zu einer maximalen pcdk2-foci-zahl von 2,9, nach 24h lagen noch 2,0 pcdk2-foci vor (Abbildung 17). Die Kontrollgruppen zeigten nach 6h 0,4 und nach 24h 0,7 pcdk2-foci. 39
40 10 8 Kontrolle NBS-/- Foci pro Zelle Zeit (Stunden) Abbildung 17: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von pcdk2 bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in der frühen Synthesephase mit 2Gy. Bei Bestrahlung in der späten Synthesephase kam es bei den NBSdefizienten Zelllinien zu einem stetigen Anstieg der pcdk2-foci von 2,9 nach 1h auf 8,8 nach 24h (Abbildung 18). Nach 3h trat bei den Kontrollgruppen der Höchstwert von 5,0 pcdk2-foci auf. Dann folgte ein Anfall der Foci-Zahl auf 2,9 nach 24h. 40
41 10 8 Kontrolle NBS-/- Foci pro Zelle Zeit (Stunden) Abbildung 18: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von pcdk2 bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in der späten Synthesephase mit 2Gy. 5.7 Rad52 Bei Bestrahlung in G 0 zeigten die Kontrollgruppen nach 6h eine maximale Rad52-Foci-Anzahl von 4,5, nach 24h waren noch 4,1 Rad52-Foci nachweisbar (Abbildung 19). Bei den NBS-defizienten Zelllinien traten nach 1h 1,8 Rad52-Foci auf. Nach 24 konnten man einen Höchstwert von 5,0 Foci beobachten. 41
42 25 Foci pro Zelle Kontrolle NBS-/ Zeit (Stunden) Abbildung 19: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von Rad52 bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in G 0 mit 2Gy. Bei Bestrahlung in der frühen Synthesephase zeigten die Kontrollzelllinien deutlich höhere Foci-Zahlen als die NBS -/- -Zelllinien (Abbildung 20). So traten bei den Kontrollgruppen nach 30min 10,8 Rad52-Foci und nach 12h eine maximale Anzahl von 22,8 Foci auf. Nach 24h kam es zu einem starken Abfall auf 2,3 Rad52-Foci. Bei den NBS-defizienten Zellen ließ sich bereits nach 3h ein Höchstwert von 5,9 Rad52-Foci aufzeigen. Nur nach 24h lag die Foci-Zahl mit 5,0 Rad52- Foci etwas höher als bei den Kontrollzelllinien. 42
43 25 20 Kontrolle NBS-/- Foci pro Zelle Zeit (Stunden) Abbildung 20: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von Rad52 bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in der frühen Synthesephase mit 2Gy. Auch bei Bestrahlung in der späten Synthesephase verhielten sich Kontroll- und NBS -/- -Zelllinien unterschiedlich (Abbildung 21). So konnte man bei den Kontrollgruppen nach 6h eine maximale Foci-Zahl von 8,4 beobachten, die nach 24h auf 6,6 Foci abfiel. Die NBS-defizienten Zellen zeigten einen 1h-Wert von 2,3 Rad52-Foci und einen starken Anstieg auf 8,1 Foci nach 24h. 43
44 25 20 Kontrolle NBS-/- Foci pro Zelle Zeit (Stunden) Abbildung 21: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von Rad52 bei Kontroll- und NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in der späten Synthesephase mit 2Gy. 5.8 Nbs343 und DnaPk26 Kontrollzelllinien, die in der frühen Synthesephase bestrahlt wurden, zeigten eine relativ konstante Nbs-Foci-Zahl mit einem minimalen Wert von 8,4 nach 1h und einem maximalen Wert von 10,7 Foci nach 4h (Abbildung 22). Im Gegensatz dazu kam es bei den Kontrollgruppen zu einem kontinuierlichen Abfall der DnaPk-Foci von 18,9 nach 30min auf 3,1 nach 24h (Abbildung 23). 44
45 12 10 Foci pro Zelle Kontrolle Zeit (Stunden) Abbildung 22: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von Nbs343 bei Kontrollzelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in der frühen Synthesephase mit 2Gy. Foci pro Zelle 20 Kontrolle Zeit (Stunden) 45
46 Abbildung 23: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von DnaPk26 bei Kontrollzelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in der frühen Synthesephase mit 2Gy. Tab.3: Bestrahlung der Kontrollzelllinien in G 0 H2ax Atm Pml Brca1 pcycline pcdk2 Rad52 1h 24,0 8,0 14,3 7,7 7,0 4,0 3,2 3h 10,8 6,4 14,0 7,4 7,4 4,7 4,0 6h 10,7 6,7 15,6 15,9 8,6 6,8 4,5 24h 9,0 10,0 24,5 6,5 9,9 5,0 4,1 Tab.4: Bestrahlung der Nbs-defizienten Zelllinien in G 0 H2ax Atm Pml Brca1 pcycline pcdk2 Rad52 1h 23,8 7,3 32,0 7,3 4,7 1,9 1,8 3h 12,2 8,6 31,2 4,4 7,9 0,9 2,9 6h 10,0 7,2 27,4 2,7 6,1 0,5 2,7 24h 7,4 5,1 38,2 2,7 5,1 2,4 5,0 Tab.5: Bestrahlung der Kontrollzelllinien in der frühen Synthesephase H2ax Atm Pml Brca1 pcycline pcdk2 Rad52 Nbs DnaPk 0,5h 32,1 18,0 17,3 7, ,8 9,4 18,9 1h 28,6 16,0 15,9 9,5 4,8-13,0 8,4 14,3 2h 20,6 14,0 13,8 10, ,0 8,5 12,0 3h 18,5 12,7 17,6 12,7 5,1-19, h 17,0 11,3 14,3 11, ,3 10,7 10,0 6h 16,0 10,0 19,4 10,1 6,7 0,4 17,2 10,0 8,1 12h 11,8 4,8 15,5 6, ,8 10,0 5,8 24h 7,1 6,3 15,6 5,9 7,7 0,7 2,3 9,9 3,1 46
47 Tab.6: Bestrahlung der Nbs-defizienten Zellen in der frühen Synthesephase H2ax Atm Pml Brca1 pcycline pcdk2 Rad52 0,5h 18,0 1,0 24,0 8, ,8 1h 24,8 1,1 24,4 7,3 3,3 2,1 1,8 2h 30,0 3,0 24,0 6, ,0 3h 33,5 5,8 23,7 4,4 6,8 0,5 5,9 4h 30,0 6,2 23,0 3, ,0 6h 25,1 7,4 22,2 2,7 4,4 2,9 2,1 12h 20,0 7,8 25,0 2, ,0 24h 16,1 8,2 29,3 2,0 5,1 2,0 5,0 Tab.7: Bestrahlung der Kontrollzelllinien in der späten Synthesephase H2ax Atm Pml Brca1 pcycline pcdk2 Rad52 1h 7,9 8,8 12,7 13,1 11,7 3,6 6,2 3h 14,9 16,0 14,8 12,7 10,0 5,0 6,1 6h 13,4 12,7 14,4 15,1 13,0 3,9 8,4 24h 8,9 9,8 12,7 14,3 9,2 2,9 6,6 Tab.8: Bestrahlung der Nbs-defizienten Zellen in der späten Synthesephase H2ax Atm Pml Brca1 pcycline pcdk2 Rad52 1h 13,9 9,8 19,4 11,8 4,3 2,9 2,3 3h 15,7 9,4 18,8 16,1 3,4 3,1 3,2 6h 16,1 10,3 18,6 14,7 6,6 4,4 2,8 24h 12,2 7,7 21,6 14,0 7,1 8,8 8,1 47
48 6 Diskussion DNA-Doppelstrangbrüche gehören zu den schwerwiegendsten Formen der DNA-Schädigung, die im Genom vorkommen können (Yuan et al.). Sie werden durch das Nicht-homologe Endjoining und die Homologe Rekombination repariert. Fehler innerhalb dieser Signalwege führen zu genetischer Instabilität und fördern die Tumorentstehung (Shrivastav et al. 2008). Das Nijmegen Breakage Syndrom ist durch Genom- Instabiltät und eine Prädisposition für Tumorerkrankungen charakterisiert. Die Patienten mit Nijmegen Breakage Syndrom haben eine Mutation im NBS1-Gen, welches für den für die DNA-Doppelstrangbrüche verantwortlichen Bestandteil des MRE11/RAD50/NBS1- Komplexes kodiert (Brugmans et al. 2009). Ziel dieser Arbeit war es daher, die Unterschiede in der Effizienz der Doppelstrangbruchreparatur zwischen normalen Hautfibroblasten und NBS-defizienten Zellen in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus (Abbildung 24) aufzuzeigen. 48
49 Abbildung 24: Der Zellzyklus Bei Bestrahlung in der frühen Synthesephase mit 2Gy ließ sich bei normalen Hautfibroblasten (Abbildung 25) nach 30min Reparaturzeit ein Maximum von 32,1 H2ax-Foci und im weiteren Verlauf eine kontinuierliche Abnahme der Foci auf 7,1 nach 24h nachweisen. Im Gegensatz dazu zeigten die NBS-defizienten Zellen (Abbildung 26) erst nach 3h einen Höchstwert von 33,5 H2ax-Foci, der nach 24h auf lediglich 16,1 Foci abnahm. Die Bestrahlung von Zellen führt zur Phosphorylierung von H2ax. Diese so genannten γh2ax-foci gelten als Biomarker für DNA-Doppelstrangbrüche (Redon Ce, et al. 2009). So konnte gezeigt werden, dass bei normalen Hautfibroblasten bereits kurz nach der Bestrahlung die meisten DNA-Doppelstrangbrüche auftraten und innerhalb von 24h konstant repariert wurden, während die DNA- 49
50 Doppelstrangbrüche bei NBS-defizienten Zellen mit Verzögerung erschienen und nur unzureichend repariert werden konnten. Bei Bestrahlung in der späten Synthesephase fiel auf, dass sowohl bei normalen Hautfibroblasten als auch bei NBS -/- -Zellen weniger γh2ax- Foci und somit weniger DNA-Doppelstrangbrüche als in der frühen Synthesephase und in G 0 vorkamen. Dies wies, wie bereits in der Literatur beschrieben, auf eine verminderte Strahlenempfindlichkeit der Zellen in der späten Synthesephase hin. 35 Foci pro Zelle Ko frühe Syn. Ko späte Syn Ko G Zeit (Stunden) Abbildung 25: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von H2ax bei Kontrollzelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in G 0 und in der frühen und späten Synthesephase mit 2Gy.. 50
51 Foci pro Zelle NBS-/- frühe Syn NBS-/- späte Syn NBS-/- G Zeit (Stunden) Abbildung 26: Graphische Darstellung der indirekten Immunfluoreszenz von H2ax bei NBS-defizienten Zelllinien. Bestrahlt wurden Hautfibroblasten in G 0 und in der frühen und späten Synthesephase mit 2Gy. Das Ataxia-teleangiectasia mutated protein gehört zu den Phosphoinositol-3-Kinasen und stellt ein initiales Schlüsselprotein bei der DNA-Reparatur dar. So wirkt es beispielsweise als Hauptvermittler bei der Phosphorylierung von H2ax als Antwort auf DNA- Doppelstrangbrüche (Podhorecka 2009), mit dem Ziel diese zu reparieren. Falls eine Reparatur des DNA-Schadens nicht möglich ist, triggert es die Apoptose der Zelle (Czornak et al. 2008). Bei Bestrahlung in der frühen Synthesephase zeigten die normalen Hautfibroblasten bereits nach 30min ein Maximum von 18,0 Atm-Foci, die kontinuierlich bis auf 6,3 Foci nach 24h abnahmen. Im Gegensatz dazu trat bei den NBS-defizienten Zellen nach 30min nur 1,0 Atm-Foci auf. Des Weiteren ließ sich ein stetiger Anstieg auf 8,2 Atm-Foci nach 24h beobachten. 51
52 Aus diesen Ergebnissen kann man schlussfolgern, dass die Erkennung von DNA-Doppelstrangbrüchen durch das Ataxia-teleangiectasia mutated protein (Suzuki et al. 1999) in NBS -/- -Zellen wesentlich schlechter als in den normalen Hautfibroblasten und auch nur verzögert erfolgt. Die Erklärung hierfür liegt darin, dass Nbs, als Teil des Mre11/Rad50/Nbs1-Komplexes, als Upstream-Mediator für Atm wirkt. Es rekrutiert Atm beim Auftreten von DNA-Doppelstrangbrüchen und führt zur Aktivierung seiner Funktionen (Zhou et al. 2006). Bei den NBSdefizienten Zellen fehlt dieser Upstream-Mechanismus. Ähnliche Effekte ließen sich auch bei Bestrahlung in G 0 und in der späten Synthesephase nachweisen. Das Promyelozytische Leukämie Protein PML ist in viele zelluläre Prozesse involviert, beispielsweise beim Fortschreiten des Zellzyklus, beim Auftreten von DNA-Schäden, bei der DNA-Reparatur und bei der Apoptose (Dellaire et al. 2004). Diese zellulären Aktivitäten sind oft an das Vorhandensein von subnukleären Strukturen, den so genannten PML nuclear bodies gebunden (Reineke et al. 2009). Bei Bestrahlung in G 0 zeigten sich bei den NBS-defizienten Zellen nach 1h mit 32,0 Pml- Foci mehr als doppelt so viele Foci als bei den normalen Hautfibroblasten. Nach 24h ließ sich bei beiden Zelllinien ein Anstieg der Pml-Foci beobachten. Die normalen Hautfibroblasten, die in der frühen Synthesephase bestrahlt wurden, wiesen mit durchschnittlich 16,2 Pml-Foci relativ konstante Foci-Zahlen auf. Im Gegensatz dazu kam es bei den NBS-defizienten Zellen nach anfänglich ziemlich beständigen, aber deutlich höheren Foci-Werten zu einem Anstieg von 22,2 Pml-Foci nach 6h auf 29,3 Foci nach 24h. Auch bei Bestrahlung in der späten Synthesephase ließen sich bei den NBS -/- -Zellen deutlich höhere Pml-Foci-Zahlen als bei den normalen Hautfibroblasten und ein Anstieg nach 24h nachweisen. Besonders auffällig sind die deutlich höheren Foci-Zahlen und der Anstieg der Pml-Foci nach 24h bei den NBS-defizienten Zellen im Vergleich zu den normalen Hautfibroblasten. 52
53 Brca1 spielt eine wichtige Rolle in der Reparatur von DNA- Doppelstrangbrüchen durch die Homologe Rekombination. Es wird vermutet, dass der zellzyklusabhängige Komplex aus Brca1, CtlP und MRN die Aktivierung der DNA-Doppelstrangbruchreparatur durch die Homologe Rekombination in der S- und G 2 -Phase vermittelt (Chen et al. 2008). Bei Bestrahlung in der frühen Synthesephase ließ sich bei den normalen Hautfibroblasten ein Anstieg der Brca1-Foci von 7,3 nach 30min auf 12,7 nach 3h beobachten. Anschließend erfolgte ein kontinuierlicher Abfall auf 5,9 Brca1-Foci nach 24h. Im Gegensatz dazu zeigten die NBS-defizienten Zellen einen stetigen Abfall von 8,0 nach 30min auf 2,0 Brca1-Foci nach 24h. Während sich bei den normalen Hautfibroblasten trotz abnehmender Zahl von DNA- Doppelstrangbrüchen anfangs eine Zunahme der Brca1-Foci nachweisen ließ, wiesen die NBS-/-Zellen trotz unzureichender DNA- Doppelstrangbruchreparatur eine von Anfang an sinkende Zahl von Brca1-Foci auf. Ursächlich hierfür ist, dass die durch Bestrahlung ausgelöste Verbindung zwischen BRCA1, welches als Regler der DNA- Doppelstrangbruchreparatur gilt (Durant et al. 2005), und dem MRN- Komplex aufgrund des Fehlens von NBS1 nicht zustande kommt. Dadurch lässt sich auch die Hochregulation der Pml-Foci, welche Reparaturwerkstätten der Zelle darstellen, bei Bestrahlung in der frühen Synthesephase erklären. Die offensichtlich höhere Anzahl und der Anstieg der Pml-Foci bei den NBS-defizienten Zellen lässt sich als Antwort der Zelle auf die unzureichende DNA- Doppelstrangbruchreparatur durch die Proteine der Homologen Rekombination deuten. Da bei Bestrahlung in G 0 die Zahl der Brca1- Foci bei den normalen Hautfibroblasten einen ähnlichen Verlauf und zum Teil höhere Werte als bei Bestrahlung in der frühen Synthesephase zeigt, muss man daran denken, dass die Homologe Rekombination eventuell nicht nur in der S- und G 2 -Phase, sondern auch in anderen Phasen das Zellzyklus eine wichtige Rolle spielt. Bei Bestrahlung in G 0 kann man ebenfalls wieder deutlich niedrigere Brca1-Foci-Zahlen bei den NBS-/-Zellen beobachten. 53
54 Die Cyclin-abhängige Kinase 2 (Cdk2) gehört zur Familie der Serin- /Threonin-Kinasen. Lange Zeit wurde Cdk2 als Hauptregulator des S- Phasen-Beginns angesehen. Verschiedene Studien deckten allerdings die Entbehrlichkeit von Cdk2 bei der S-Phasen-Einleitung und der Progression des Zellzyklus auf. Nichtsdestotrotz deuten neuere Belege daraufhin, dass Cdk2 in zellzyklusunabhängige Prozesse wie die DNA- Reparatur involviert ist (Satyanarayana et al. 2009). CyclinE bindet an Cdk2 und aktiviert die Cyclin-abhängige Kinase (Aleem et al. 2004). Es wird vermutet, dass die Dysregulation des CyclinE/Cdk2-Komplexes zur Tumorentstehung beiträgt (Gladden et al. 2003). Bei Bestrahlung in G 0 ließen sich bei den normalen Hautfibroblasten deutlich höhere Werte an Cdk2- und CyclinE-Foci als bei den NBS -/- -Zellen nachweisen. Im Rahmen einer begrenzten Anzahl an Studien wurde bekannt, dass Cdk2 für eine ordnungsgemäße DNA-Reparatur notwendig ist. Wie genau Cdk2 die DNA-Reparatur beeinflusst, ist noch unklar. Es wird angenommen, dass Cdk2 als upstream-mechanismus in den DNA- Reparaturwegen wirkt und in die Aktivierung von DNA- Reparaturproteinen eingebunden ist (Satyanarayana and Kaldis 2009). NBS1 scheint für die Wirksamkeit von Cdk2 bei der DNA-Reparatur eine Rolle zu spielen. Die Zahlen der Cdk2- und CyclinE-Foci bei Bestrahlung in der frühen und späten Synthesephase weisen ebenfalls darauf hin. Die Gene der RAD52-Gruppe (RAD50, RAD51, RAD52, RDH54/TID1, RAD55, RAD57, RAD59, MRE11, XRS2) nehmen eine zentrale Stellung im Prozess der Homologen Rekombination ein. Aufgrund ihres Bedürfnisses, die durch Bestrahlung verursachten DNA-Schäden in Saccharomyces cerevisiae zu reparieren, wurden viele von ihnen identifiziert (Symington 2002). Mutationen in RAD52 führen zu ernsten Defekten in der genetischen Rekombination und in der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (Benson et al. 1998). Bei Bestrahlung in der frühen Synthesephase konnte man bei den normalen Hautfibroblasten 54
55 wesentlich mehr Rad52-Foci beobachten als bei den NBS -/- -Zellen. Während bei den Hautfibroblasten nach 12h ein Maximum von 22,8 Foci auftrat, zeigten die NBS-defizienten Zellen bereits nach 3h einen Höchstwert von 5,9 Rad52-Foci. Nach 24h ließen sich bei den normalen Hautfibroblasten nur noch 2,3 Foci, bei den NBS-defizienten Zellen 5,0 Rad52-Foci nachweisen. Auffällig ist, dass die NBS-/-Zellen bis auf den 24h-Wert durchweg niedrigere Rad52-Foci-Zahlen aufwiesen als die normalen Hautfibroblasten. Das gilt auch bei Bestrahlung der Zellen in G 0 und in der späten Synthesephase. Dies weist auf ungenügende und mit Verspätung einsetzende DNA-Doppelstrangbruchreparatur durch die Proteine der Homologen Rekombination bei den NBS-defizienten Zellen hin und lässt vermuten, dass NBS1 eine wichtige Stellung innerhalb der Signalwege der DNA-Doppelstrangbruchreparatur einnimmt. Das Auftreten der Rad52-Foci bei Bestrahlung in G 0 deutet außerdem daraufhin, dass die Homologe Rekombination nicht nur in der S- und G 2 -Phase, sondern auch in anderen Phasen des Zellzyklus eine Rolle spielt. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass NBS1 eine zentrale Position in der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch die Homologe Rekombination einnimmt (Abbildung 27). Seine Funktion in den verschiedenen Signalkaskaden der DNA-Reparatur muss weiterhin Gegenstand der heutigen Forschung sein. Des Weiteren kann man festhalten, dass NBS-defiziente Zellen versuchen, der unzureichenden und verzögerten Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch die Proteine der Homologen Rekombination mit Hilfe anderer Mechanismen, beispielsweise der Hochregulation der Pml-Foci, entgegenzuwirken. Außerdem muss die Aussage, dass die DNA- Doppelstrangbruchreparatur vor allem in der S- und G 2 -Phase durch die Homologe Rekombination erfolgt, überdacht werden, da die Proteine der Homologen Rekombination auch bei Bestrahlung in anderen Phasen des Zellzyklus eine wichtige Rolle zu spielen scheinen. 55
56 Abbildung 27: NBS1 im Mittelpunkt der DNA-Doppelstrangbruchreparatur 56
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