For Performance Evaluation Only
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- Fritz Wolf
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1 For Performance Evaluation Only INSTRUCTIONS FOR USE BINDAZYME Human Anti-CCP2 IgG Enzyme Immunoassay Kit MK090.E Product manufactured by: The Binding Site Ltd, P.O. Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. Telephone: +44 (0) Fax: +44 (0) INTENDED USE This assay is designed for the in-vitro measurement of specific IgG autoantibodies against second generation cyclic citrullinated peptides (CCP2) in human serum. It is intended as an aid in the diagnosis of rheumatoid arthritis (RA), in conjunction with other clinical and serological findings. Sufficient materials are supplied to allow a maximum of 88 samples to be tested in single or 40 in duplicate, with a calibration curve and a positive and negative control yielding semi-quantitative results. If used as a screening assay, 93 samples in single or 45 in duplicate can be tested together with the cut-off, positive and negative control. This kit can be run either as a semi-quantitative assay, or as a screening assay using the cut-off control provided in place of the calibrators. 2 BACKGROUND Rheumatoid arthritis is a common autoimmune disease affecting 1-2% of the adult global population. It is a chronic, systemic, inflammatory disease that predominantly affects the synovial membranes of multiple joints in the body. The diagnosis of RA is made primarily on a series of clinical symptoms as defined by the American College of Rheumatology in The one serological test included in these criteria is a positive IgM rheumatoid factor (RF) result within the patients serum. However RF shows only moderate specificity for RA, as it is present in other autoimmune diseases, infections and in healthy individuals ( 2 ). A second RA-specific autoantibody is directed against filaggrin (filament-aggregating protein) in which approximately 20% of the arginine amino acids are converted to citrulline by the enzyme peptidyl-arginine deiminase (PAD) 3,4. Indeed, the citrullinated residues were shown to be the principle epitopes for the autoantibodies present in RA sera and first generation CCP tests were developed employing these peptides presented in a cyclical form 5. Modifications of these synthetic cyclic citrullinated peptides led to the introduction of a second generation of tests (CCP2) which showed improved sensitivity for RA 6. In general, anti-ccp2 autoantibodies appear extremely specific for RA (>95%) and demonstrate sensitivity in the region of 60-77% 7,8. Anti-CCP2 antibodies occur early in RA, this is particularly valuable in aiding diagnosis when clinical symptoms may not be easily distinguished from other conditions. An early diagnosis of RA and prompt commencement of appropriate treatment is particularly important if irreparable joint damage is to be prevented. Anti-CCP2 antibodies show good predictive potential, indeed the presence of anti-ccp2 antibodies has been shown to predict progression of patients diagnosed with undifferentiated arthritis to RA within the next few years 9. These antibodies also show good prognostic ability, to this end it has been shown that anti-ccp2 positive early RA patients developed more aggressive clinical disease and greater radiological damage in comparison with anti-ccp2 negative patients 10 and that anti-ccp2 antibody titer is related to disease severity PRINCIPLE OF THE ASSAY Microwells are pre-coated with highly purified synthetic CCP2. The calibrators, controls and diluted patient samples are added to the wells and autoantibodies recognising the CCP2 bind during the first incubation. After washing the wells to remove all unbound proteins, purified peroxidase labelled rabbit anti-human IgG (γ chain specific) conjugate is added. The conjugate binds to the captured human autoantibody and the excess unbound conjugate is removed by a further wash step. Bound conjugate is visualised with 3,3,5,5 tetramethylbenzidine (TMB) substrate which gives a blue reaction product, the intensity of which is proportional to the concentration of autoantibody in the sample. Phosphoric acid is added to each well to stop the reaction. This produces a yellow end point colour, which is read at 450nm. 4 PRECAUTIONS 4.1 WARNING All human sera supplied have been tested at donor level and found negative for Hepatitis B surface antigens and antibodies to HIV 1 and 2 and Hepatitis C virus. However, these tests cannot guarantee the absence of infectious agents. Proper handling and disposal methods should be established and only personnel qualified in handling of potentially infectious materials should be permitted to use this kit. Sodium azide may react with lead and copper plumbing to form explosive metal azides. On disposal of reagents flush with a large volume of water, to prevent azide build-up. The buffers and serum supplied in this kit contain various enzyme inhibitors as listed below. These should be handled with care. INHIBITOR Kathon Sodium Azide Proclin 300 Bromonitrodioxane Methylisothiazone CONCENTRATION 0.02% 0.099% 0.045% 0.002% 0.002% Proclin is a trademark of Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA Kathon is an irritant and may cause sensitisation by skin contact. The stop solution contains 3M phosphoric acid, which is an irritant. To avoid burns do not allow contact with skin and eyes. Reagent spills should be cleaned up appropriately, observing local and environmental regulations. 4.2 CAUTION This product should only be used by appropriately trained personnel. Strict adherence to the protocol is recommended. Any deviation may affect assay performance, and the results obtained. Pay attention to specific Notes and warnings throughout these Instructions for Use. Calibrator, control, conjugate and plate batch numbers are not interchangeable. Substitution of such components with batch numbers that differ from those that are provided in the kit could lead to inconsistent and inaccurate results. All strips must be taken from the same foil pouch. To avoid reagent contamination, only use new or clean plastic / glassware. Never return unused reagents to the bottles. Do not leave reagent bottles uncapped; any resulting evaporation or contamination will lead to inconsistent results. TMB substrate must not be exposed to light or water. Microbially contaminated, haemolysed or lipaemic serum and specimens containing particulate matter should not be used. Inaccurate sample dilution cannot be checked, as kit controls are ready to use. The use of calibrated pipettes and appropriate internal QC samples is recommended. The use of automated assay systems, sample dilutors and other automated equipment may lead to differences in results when compared to the manual procedure. It is the responsibility of any laboratory to fully validate the system, and ensure the results fall within the limits as defined in this insert and associated QC Certificate. All equipment used must be calibrated and maintained according to the manufacturer s instruction. 4.3 STORAGE AND STABILITY The kit should be stored at 2-8 C and should not be frozen. Inappropriate storage temperatures will affect the results. Diluted wash buffer can be stored at 2-8 C for a maximum of 4 weeks, and can be used direct from cold without affecting assay performance. The expiry date of the kit is shown on the outer label. 5 SAMPLE COLLECTION AND STORAGE Blood samples should be collected by venepuncture, allowed to clot naturally and the serum separated. The serum may be stored at 2-8 C for up to 7 days prior to assay 12, or for prolonged storage, aliquoted and stored at -20 C or below. Repeated thawing and freezing should be avoided. Serum samples should not be heat-inactivated, as this may give false positive results. 6 MATERIALS 6.1 MATERIALS SUPPLIED Instruction leaflet: Giving full assay details. QC Certificate: Indicating the expected performance of the batch. Coated Wells: 12 breakapart 8 well strips coated with CCP2 antigen. Each plate is packaged in a re-sealable foil bag containing one desiccant pouch. Type III Sample Diluent: 2 bottles containing 50mL of buffer for sample dilution. Coloured yellow, ready to use. Type III Wash Buffer: 1 bottle containing 50mL of a 20-fold concentrated buffer for washing the wells. CCP2 Calibrators: 6 bottles each containing 1.2mL of diluted human serum, with the following concentrations of anti-ccp2 autoantibody: 3000, 1000, 333.3, 111.1, 37 and 12.3 U/mL. Ready to use. CCP2 Cut-off Control: 1 bottle containing 1.2mL of diluted human serum. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use. CCP2 Positive Control: 1 bottle containing 1.2mL of diluted human serum. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use. CCP2 Negative Control: 1 bottle containing 1.2mL of diluted human serum. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use. CCP2 Conjugate: 1 bottle containing 12mL of purified peroxidase labelled antibody to human IgG. Coloured red. Ready to use. Insert code: E090.E, Version 2 October 2007, Page 1 of 7
2 TMB Substrate: 1 bottle containing 14mL TMB substrate. Ready to use. Stop Solution: 1 bottle containing 14mL of 3M phosphoric acid. Ready to use. 6.2 ADDITIONAL MATERIALS AND EQUIPMENT - not supplied Automatic microplate plate washer: This is recommended, however, plate washing can be performed manually. Plate reader: Capable of measuring optical densities at 450nm referenced on air. Distilled or deionised water: This should be of the highest quality available. Calibrated micropipettes: For dispensing 1000, 100 & 10µL. Multichannel pipette: Recommended for dispensing 100µL volumes of conjugate, substrate and stop solution. Glass/plastic tubes: For sample dilution. 7 ASSAY METHOD 7.1 PRE-ASSAY STEPS 1. Bring the kit to room temperature The kit is designed for room temperature operation (20-24 C). Remove the kit from storage and stand at room temperature for approximately 60 minutes. Wells must not be removed from the foil bag until they have reached room temperature. Note: The kits may be maintained at room temperature for up to 1 week. 2. Kit components Gently mix each kit component before use. 3. Wash buffer dilution Add 50mL of the wash buffer concentrate to 950mL of distilled water (1/20 dilution) into a clean container and mix. Note: Diluted wash buffer can be stored at 2-8 C for up to 4 weeks, therefore only dilute the appropriate amount. If the buffer shows any sign of microbial contamination or turns cloudy, discard and prepare a fresh solution. 4. Sample dilution Dilute 10µL of each sample with 1000µL of sample diluent (1:100) and mix well. Note: Diluted sample must be used within 8 hours. 5. Strip and frame handling Place the required number of wells in the strip holder. Position from well A1, filling columns from left to right across the plate. When handling the plate, squeeze the long edges of the frame to prevent the wells falling out. Note: Return unused wells to the foil bag immediately with the desiccant pouch and re-seal tightly to minimise exposure to moisture. Take care not to puncture or tear the foil bag, see below. WARNING: Exposure of wells to moisture or contamination by dust or other particulate matter will result in antigen degradation, leading to poor assay precision and potentially false results. 7.2 ASSAY METHOD Maintain the same dispensing sequence throughout the assay. 1. Sample addition Dispense 100µL of each calibrator (semi-quantitative assay) or cut-off control (screening assay), assay controls and diluted (1:100) sample into the appropriate wells of the plate provided. Note: Samples should be added as quickly as possible to the plate to minimise assay drift, and the timer started after the addition of the last sample. Incubate at room temperature for 30 minutes. 2. Washing The washing procedure is critical and requires special attention. An improperly washed plate will give inaccurate results, with poor precision and high backgrounds. After incubation remove the plate and wash wells 3 times with µL wash buffer per well. Wash the plate either by using an automatic plate washer or manually as indicated below. After the final automated wash, invert the plate and tap the wells dry on absorbent paper. Plates can be washed manually as follows: a. Flick out the contents of the plate into a sink. b. Tap the wells dry on absorbent paper. c. Fill each well with µL of wash buffer using a multichannel pipette. d. Gently shake the plate on a flat surface. e. Repeat a-d twice. f. Repeat a and b. 3. Conjugate addition Dispense 100µL of conjugate into each well, blot the top of the wells with a tissue to remove any splashes. Note: To avoid contamination, never return excess conjugate to the reagent bottle. Incubate at room temperature for 30 minutes. 4. Washing Repeat step Substrate (TMB) addition Dispense 100µL of TMB substrate into each well, blot the top of the wells with a tissue to remove any splashes. Note: To avoid contamination, never return excess TMB to the reagent bottle. Incubate at room temperature in the dark for 30 minutes. 6. Stopping Dispense 100µL of stop solution into each well. This causes a change in colour from blue to yellow. 7. Optical density measurement Read the optical density (OD) of each well at 450nm on a microplate reader, within 30 minutes of stopping the reaction. 8 RESULTS AND QUALITY CONTROL 8.1 SEMI-QUANTITATIVE / SCREENING ASSAYS 1. Quality control In order for an assay to be valid, all the following criteria must be met: Calibrators / cut-off control (as applicable) and positive and negative controls must be included in each run. The values / ODs obtained for the positive and negative controls should be in the ranges specified on the QC Certificate. Quantitative assay only - the curve shape should be similar to the calibration curve, shown on the QC Certificate. If the above criteria are not met, the assay is invalid and the test should be repeated. 2. Calculate mean optical densities (for assays run in duplicate only) For each calibrator, control and sample calculate the mean OD of the duplicate readings. The percentage coefficient of variation (% CV) for each duplicate OD should be less than 15%. 8.2 SCREENING ASSAY - CALCULATION OF RESULTS 1. Quality assessment of the optical densities The OD of the positive control should be greater than 0.6 and greater than the OD of the cut-off control. The OD of the negative control should be less than The OD of the cut-off control should be greater than that of the negative control but less than Results interpretation Using the cut off control, interpret the results according to the following table: RESULT INTERPRETATION ACTION OD equal to or greater than cut-off control Suspected of having anti-ccp2 autoantibodies Test in the semiquantitative assay OD less than cut-off control Negative Report as negative 8.3 SEMI-QUANTITATIVE ASSAY - CALCULATION OF RESULTS 1. Plot calibration curve The calibration curve can be plotted either automatically or manually as follows by plotting the anti-ccp2 autoantibody concentration on the log scale against the OD on the linear scale for each calibrator: Automatic - use appropriately validated software, and the curve fit that best fits the data. Manual - using log/linear graph paper, draw a smooth curve through the points (not a straight line or point to point). 2. Treatment of anomalous points If any one point does not lie on the curve, it can be removed. If the absence of this point means that the curve has a shape dissimilar to that of the sample calibration curve, or more than one point appears to be anomalous, then the assay should be repeated. 3. Calculation of the control values Read the level of the anti-ccp2 autoantibody in the controls directly from the calibration curve. The values should fall within the ranges given on the QC Certificate. 4. Calculation of autoantibody levels in diluted samples Read the level of the anti-ccp2 autoantibody in the diluted samples directly from the calibration curve. Note: The calibrator values have been adjusted by a factor of 100 to account for a 1:100 sample dilution, therefore no further conversion is required. 5. Assay calibration The assay is calibrated in U/mL against an arbitrary reference calibrator, as no internationally recognised reference preparation is currently available. 6. Limitations This kit is used to aid diagnosis only. A positive result suggests certain diseases that must be confirmed by clinical findings and other serological tests. The results obtained from this assay are not diagnostic proof of the presence or absence of disease. Not all RA patients are positive for CCP2 IgG antibodies. The assay performance characteristics have not been established for matrices other than human serum. 9 EXPECTED VALUES The normal range was determined on serum from 200 normal blood donors. Prior to calculating the mean and standard deviation (SD), one positive sample with a high anti-ccp2 value (300 U/mL), which tested positive in 3 alternative anti-ccp2 EIAs, was excluded. The upper limit of normal is expressed as the mean concentration: 3.03 U/mL + 5 SD and equates to 20.0 U/mL. The ranges are provided as a guide only. ELISA assays are very sensitive and capable of detecting small differences in sample populations. It is recommended that each laboratory determine its own normal range, based on the population, techniques and equipment employed. 10 REFERENCES RESULT INTERPRETATION < 20 Negative result 20 Positive result 1. Arnett, F.C., et al., The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, (3), Insert code: E090.E, Version 2 October 2007, Page 2 of 7
3 2. de Angelis, V. and P.L. Meroni, Rheumatoid Factors, in Autoantibodies, Y. Shoenfeld, M.E. Gershwin, and P.L. Meroni, Editors. 2007, Elsevier, B.V. Oxford van Venrooij, W.J. and G.J. Pruijn, Citrullination: a small change for a protein with great consequences for rheumatoid arthritis. Arthritis Res, (4), Schellekens, G.A., et al., Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest, (1), Schellekens, G.A., et al., The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide. Arthritis Rheum, (1), van Gaalen, F.A., et al., A comparison of the diagnostic accuracy and prognostic value of the first and second anti-cyclic citrullinated peptides (CCP1 and CCP2) autoantibody tests for rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis, (10), van Venrooij, W.J., et al., Autoantibodies to citrullinated antigens in (early) rheumatoid arthritis. Autoimmun Rev, (1), Coenen, D., et al., Technical and diagnostic performance of 6 assays for the measurement of citrullinated protein/peptide antibodies in the diagnosis of rheumatoid arthritis. Clin Chem, (3), van Gaalen, F.A., et al., Autoantibodies to cyclic citrullinated peptides predict progression to rheumatoid arthritis in patients with undifferentiated arthritis: a prospective cohort study. Arthritis Rheum, (3), Ronnelid, J., et al., Longitudinal analysis of citrullinated protein/peptide antibodies (anti-cp) during 5 year follow up in early rheumatoid arthritis: anti-cp status predicts worse disease activity and greater radiological progression. Ann Rheum Dis, (12), Berglin, E., et al., Radiological outcome in rheumatoid arthritis is predicted by presence of antibodies against cyclic citrullinated peptide before and at disease onset, and by IgA-RF at disease onset. Ann Rheum Dis, (4), Milford Ward, A., J. Sheldon, and G.D. Wild, eds. Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity. 3 ed. Vol , PRU Publications: Sheffield. 11 PLATE TEMPLATE Please see back of insert. Summary of procedure 1. Add 100µL of each calibrator, control and 1:100 diluted sample to the appropriate wells. Incubate for 30 minutes. Wash. 2. Add 100µL of conjugate to each well. Incubate for 30 minutes. Wash. 3. Add 100µL of substrate to each well. Incubate for 30 minutes. 4. Add 100µL of stop solution to each well. Measure the absorbance at 450nm. BINDAZYME is a registered trademark of The Binding Site Ltd. P.O. Box 11712, Birmingham B14 4ZB. England Insert code: E090.E, Version 2 October 2007, Page 3 of 7
4 Nur für Leistungsbewertungszwecke ARBEITSSANLEITUNG BINDAZYME TM Anti-CCP2 IgG Enzym-Immunoassay-Kit MK090.E Vertrieb in Deutschland und Österreich durch: The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straβe 2A D Schwetzingen, Deutschland Telefon: +49 (0) Fax: +49 (0) office@bindingsite.de Autoantikörper. Ungebundenes Konjugat wird durch einen weiteren Waschschritt entfernt. Das gebundene Konjugat wird mit Hilfe von 3,3,5,5 Tetramethylbenzidin (TMB) sichtbar gemacht. TMB ergibt ein blaues Reaktionsprodukt, dessen Intensität proportional zur Autoantikörper-Konzentration der Probe ist. Um die Reaktion zu stoppen, wird in jede Vertiefung Phosphorsäure pipettiert. Das gelbe Reaktionsprodukt wird bei 450nm gemessen. 4 WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN 4.1 WARNUNGEN Das Ausgangsmaterial zur Erstellung der Kalibratoren und Kontrollen stammt aus menschlichem Blut. Jede Einzelspende wurde bezüglich Antikörpern gegen Human-Immunschwäche-Virus (HIV 1 & 2), Hepatitis C-Virus und Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) untersucht und als negativ befunden. Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Ausschluss von Infektionsträgern. Deshalb sollten die Reagenzien als potentiell infektiös behandelt werden. Umgangs- und Entsorgungsmethoden sollten denen für potentiell infektiösem Material entsprechen und der Test nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden. Alle Puffer und Seren im Kit enthalten die unten aufgelisteten Enzym- Inhibitoren als Konservierungsmittel. Diese sollten mit der entsprechenden Vorsicht behandelt werden. 1 VERWENDUNGSZWECK Dieser Kit dient zur in-vitro Bestimmung spezifischer IgG-Autoantikörper gegen die zweite Generation cyclisch citrullinierter Peptide (CCP) in Humanserum. Dieser Test kann zusammen mit anderen serologischen und klinischen Befunden bei der Diagnosestellung von Rheumatoider Arthritis (RA) helfen. Der Kit enthält ausreichend Material, um maximal 40 Proben in Doppelbestimmung oder 88 Proben in Einzelbestimmung, sowie eine Kalibrationskurve, eine Positiv- und eine Negativkontrolle zu messen. Es werden semi-quantitative Ergebnisse erhalten. Der Kit kann auch als Screening-Test verwendet werden. Im Screening-Test können maximal 45 Proben in Doppelbestimmung oder 93 Proben in Einzelbestimmung, eine Cut-Off-Kontrolle und je eine Positiv- und eine Negativkontrolle gemessen werden. Dieser Test kann entweder als semi-quantitativer Test oder als Screening-Test verwendet werden, indem die Cut-Off-Kontrolle anstelle der Kalibrationskurve gemessen wird. 2 EINFÜHRUNG Rheumatoide Arthritis ist eine häufige Autoimmunerkrankung, von der 1-2% aller Erwachsenen weltweit betroffen sind. Es ist eine chronische, systemische, entzündliche Krankheit, die hauptsächlich die Synovialmembranen verschiedener Gelenke im Körper betrifft. Das American College of Rheumatology hat eine Reihe von vorwiegend klinischen Symptomen definiert, auf deren Grundlage die Diagnose von RA gestellt wird. Als einziger in den Kriterien enthaltener serologischer Test geht ein positives Ergebnis des Rheumafaktor IgM (RF) ein. Der RF weist jedoch nur eine mittlere Spezifität für RA auf und kann auch bei anderen Autoimmunkrankheiten, bei Infektionen und gesunden Individuen nachgewiesen werden 2. Ein zweiter RAspezifischer Antikörper bindet direkt an Filaggrin (filament-aggregating Protein) bei dem rund 20% der Aminosäure Arginin von dem Enzyme Peptidyl-Arginin- Deiminase (PAD) 3,4 in Citrullin umgewandelt wird. Es zeigte sich, dass die citrullinierten Proteinanteile die wichtigsten Epitope für die in dem RA-Serum vorkommenden Autoantikörper darstellen und die erste Generation von CCP Tests wurde mit Hilfe dieser Peptide in cyclischer Form entwickelt 5. Modifikationen an diesen synthetischen cyclisch citrullinierten Peptiden führte zur Einführung einer zweiten Generation von Tests (CCP2), die eine erhöhte Sensitivität für RA zeigten 6. Allgemein zeigen Anti-CCP2 Autoantikörper eine sehr hohe Spezifität für RA (>95%) und eine Sensitivität im Bereich zwischen 60-77% 7,8. Anti-CCP2 Antikörper entstehen in einer frühen Phase der RA und können bei der Diagnose einen wertvollen Hinweis liefern, wenn sich die klinischen Symptome noch nicht zweifelsfrei zuordnen lassen. Eine frühe Diagnose von RA und ein schneller Behandlungsbeginn sind sehr wichtig, wenn eine irreparable Schädigung der Gelenke verhindert werden soll. Anti-CCP2 Antikörper haben einen prädiktiven Wert, denn der Nachweis von Anti-CCP2 Antikörpern korrelierte mit einer Progression der Krankheit von einer undifferenzierten Arthritis in eine RA in den nächsten Jahren 9. Dieser Antikörper hat auch eine Bedeutung für die Prognose, denn es hat sich herausgestellt, dass RA Patienten, die in einer frühen Phase Anti- CCP2 positiv sind, eine aggressivere Erkrankung und größere radiologische Schäden entwickelten als Patienten, die im Vergleich Anti-CCP2 negativ waren 10. Zudem korrelierte der Anti-CCP2 Titer mit dem Schweregrad der Krankheit TESTPRINZIP Die Vertiefungen (Wells) der Mikrotiterplatten sind mit hochgereinigtem synthetischen CCP2 beschichtet. Die Kalibratoren, Kontrollen und verdünnten Patientenproben werden in den Vertiefungen inkubiert, so dass in diesem ersten Inkubationsschritt CCP2-Autoantikörper an das immobilisierte CCP2 binden können. Nach dem Waschen der Vertiefungen - um ungebundenes Protein zu entfernen - wird Peroxidase-markiertes Kaninchen anti-human-igg-konjugat (γ- Ketten spezifisch) zugegeben. Das Konjugat bindet an die gebundenen humanen INHIBITOR Kathon Natriumazid Proclin 300 Bromonitrodioxan Methylisothiazon KONZENTRATION 0,02% 0,099% 0,045% 0,002% 0,002% Proclin ist ein eingetragenes Warenzeichen der Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA Kathon wirkt reizend und kann bei Hautkontakt zu einer Sensibilisierung führen. Die Stopp-Lösung enthält 3M Phosphorsäure. Sie ist reizend, deshalb Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. Verschüttete Reagenzien entsprechend beseitigen, dabei sind ökologische und gesetzliche Bestimmung zu beachten. 4.2 VORSICHTSMAßNAHMEN Dieser Test sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal durchgeführt werden. Testdurchführung strikt nach Arbeitsanleitung. Jegliche Abweichung kann die Testqualität und Ergebnisse beeinflussen. Beachten Sie die spezifischen Hinweise und Warnungen in dieser Arbeitsanleitung. Die Chargen von Kalibrator, Kontrollen, Konjugat und Mikrotiterstreifen sind nicht austauschbar. Wird eine dieser Komponenten durch eine andere Charge, die nicht in dem gelieferten Kit enthalten ist, ersetzt, kann es zu inkonsistenten und inakkuraten Ergebnissen kommen. Alle Mikrotiterstreifen müssen aus demselben Folienbeutel entnommen werden. Zur Vermeidung von Kontaminationen der Reagenzien immer saubere Plastik- oder Glasgefäße verwenden. Niemals unbenutztes Reagenz in die Flaschen zurückgeben. Reagenzienflaschen nicht für längere Zeit offen stehen lassen. Die daraus resultierende Verdunstung oder Verunreinigung führt zu widersprüchlichen Ergebnissen. TMB darf weder mit Licht noch mit Wasser in Berührung kommen! Die Verwendung von mikrobiell oder mit Partikeln verunreinigter, hämolytischer oder lipämischer Seren vermeiden. Falsche Probenverdünnungen können nicht erkannt werden, da die Kit- Kontrollen gebrauchsfertig sind. Es wird empfohlen, kalibrierte Pipetten und geeignete interne Kontrollen zu verwenden. Die Verwendung von ELISA-Automaten, Pipettierautomaten oder anderen automatisierten Geräten kann im Vergleich zur manuellen Testdurchführung zu abweichenden Ergebnissen führen. Jedes Labor muss das System vollständig validieren und sicherstellen, dass die Ergebnisse innerhalb der im QC-Zertifikat angegebenen Spezifikationen liegen. Das QC-Zertifikat ist dieser Arbeitsanleitung beigefügt. Die verwendeten Geräte und Pipetten müssen gemäß der Herstellerangaben kalibriert und gewartet werden. 4.3 LAGERUNG UND STABILITÄT Den Kit bei 2-8 C lagern, nicht einfrieren. Lagerung bei falscher Temperatur beeinflusst die Ergebnisse. Der verdünnte Waschpuffer ist in einem sauberen Gefäß bei 2-8 o C bis maximal 4 Wochen haltbar. Er kann sowohl kalt (2-8 C) als auch warm (Raumtemperatur) verwendet werden, ohne dass die Ergebnisse dadurch beeinflusst werden. Die Haltbarkeit des Kits wird auf dem Außenetikett angegeben. 5 PROBENENTNAHME UND -VORBEREITUNG Blutproben über Venenpunktur sammeln und auf natürliche Weise gerinnen lassen. Serum vom Gerinnsel trennen. Insert code: E090.E, Version 2 October 2007, Page 4 of 7
5 Die Seren können bei 2-8 C bis zu 7 Tage vor dem Test gelagert werden 12. Für eine längere Lagerung empfiehlt es sich, die Seren unverdünnt und aliquotiert bei mindestens -20 C einzufrieren. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben vermeiden. Serumproben nicht hitzeinaktivieren, dies kann zu falsch-positiven Ergebnissen führen. 6 MATERIALIEN 6.1 GELIEFERTE MATERIALIEN Arbeitsanleitung: mit genauen Angaben zur Testdurchführung. QC-Zertifikat: mit Angabe der Leistungsdaten der Charge. Coated Well: 12 Mikrotiterstreifen mit 8 vereinzelbaren Vertiefungen, die mit CCP2 Antigen beschichtet sind. Die Streifen sind in einem wiederverschließbaren Folienbeutel, der ein Trockenmittel enthält, verpackt. Type III Sample Diluent: (Probendiluens Typ III): 2 Flaschen mit je 50mL gebrauchsfertigem Puffer zur Probenverdünnung. Farbcodierung: gelb. Type III Wash Buffer (20x Concentrate): 1 Flasche mit 50mL eines 20-fach konzentrierten Puffers zum Waschen der Vertiefungen. CCP2 Calibrators: 6 Flaschen mit je 1,2mL verdünntem Humanserum mit den folgenden Konzentrationen an anti-ccp2-autoantikörpern: 3000; 1000; 333; 111; 37; 12,3 IU/mL. CCP2 Cut-off Control: 1 Flasche mit 1,2mL vorverdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben. CCP2 Positive Control (CCP2-Positivkontrolle): 1 Flasche mit 1,2mL vorverdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben. CCP2 Negative Control (CCP2-Negativkontrolle): 1 Flasche mit 1,2mL vorverdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben. CCP2 Conjugate (CCP2-Konjugat): 1 Flasche mit 12mL gereinigtem, Peroxidasemarkiertem Antikörper gegen Human-IgG. Farbcodierung: rot. TMB Substrate (TMB-Substrat): 1 Flasche mit 14mL TMB-Lösung. Stop Solution (Stopp-Lösung): 1 Flasche mit 14mL 3M Phosphorsäure. 6.2 BENÖTIGTE, NICHT IM KIT ENTHALTENE MATERIALIEN Automatisches Mikrotiterplatten-Waschgerät: ist empfehlenswert, aber die Platten können auch manuell gewaschen werden. Mikrotiterplatten-Reader: Messung der optischen Dichte in den Vertiefungen bei 450nm. Destilliertes Wasser: Es sollte von höchster Qualität und frei von Metallionen sein. Kalibrierte Micropipetten: zum Pipettieren von 1000, 100 & 10µL. Mehrkanal-Pipette: zum Pipettieren von Volumina von 100µL. Glas-oder Plastikgefäße: zur Probenverdünnung. 7 TESTDURCHFÜHRUNG 7.1 TESTVORBEREITUNG 1. Kit auf Raumtemperatur erwärmen: Die optimale Temperatur für die Testdurchführung liegt bei C. Den Kit nach Entnahme aus dem Kühlschrank ca. 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Die Wells dürfen erst nach Errreichen der Raumtemperatur aus dem Folienbeutel entnommen werden. Hinweis: Der Kit kann bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur gelagert werden. 2. Kit-Komponenten Jede Kit-Komponente vor Gebrauch kurz schütteln. 3. Waschpuffer (20fach-Konzentrat) verdünnen: Dazu 50mL Waschpuffer-Konzentrat und 950mL destilliertes Wasser (1/20- Verdünnung) in ein sauberes Gefäß geben und mischen. Es können auch entsprechend kleinere Volumina verdünnt werden. HINWEIS: Der verdünnte Puffer ist bei 2-8 C bis zu 4 Wochen haltbar; deshalb nur die benötigte Menge verdünnen. Sollte der Puffer Zeichen von mikrobieller Verunreinigung zeigen oder wolkig erscheinen, verwerfen sie die Lösung und setzen Sie eine frische Verdünnung an. 4. Verdünnung der Proben 10µL jeder Probe mit 1000µL Probendiluens verdünnen (1:100) und gut mischen. Hinweis: Die verdünnten Proben müssen innerhalb von 8 h gemessen werden. 5. Umgang mit Streifen und Rahmen Die benötigte Anzahl Wells aus dem Folienbeutel entnehmen und in den Rahmen setzen. Dabei von Position A1 ausgehend die Spalten von links nach rechts auffüllen. Achten Sie darauf, die langen Seiten des Rahmens zusammenzudrücken, damit die Wells nicht herausfallen können. Hinweis: Um die Kontaktzeit mit der Luftfeuchtigkeit zu minimieren die nicht verwendeten Wells sofort in den wiederverschließbaren Folienbeutel mit dem Trockenmittel geben und gut verschließen. Darauf achten, dass der Folienbeutel nicht beschädigt wird. ACHTUNG: Kontakt mit Feuchtigkeit oder Verunreinigung durch Staub oder anderen Partikeln kann einen Antigen-Abbau verursachen. Daraus resultiert eine schlechte Präzision und potentiell falsche Ergebnisse. 7.2 TESTDURCHFÜHRUNG Alle Reagenzien in der gleichen Reihenfolge pipettieren. 1. Pipettieren der Kalibratoren, Kontrolle und Proben 100µL von jedem Kalibrator (Semi-Quantitativer Test) oder der Cutt-off Kontrolle (Screening Test), jeder Kontrolle und verdünnten (1:100) Proben in das dafür laut Plattenschema vorgesehene Well pipettieren. HINWEIS: Die Proben müssen so schnell wie möglich pipettiert werden um eine Assay-Drift zu vermeiden; die Inkubationszeit läuft ab Zugabe der letzten Probe. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 2. Waschen der Platte Sorgfältiges Waschen der Wells ist wichtig für eine hohe Präzision und genaue Testergebnisse. Bei nicht korrekt gewaschenen Wells können ungenaue Ergebnisse mit schlechter Präzision und hohem Hintergrund auftreten. Nach der Inkubation die Wells dreimal mit µL Waschpuffer waschen. Das Waschen kann mit einem automatischen Platten- Waschgerät oder manuell erfolgen. Nach dem letzten Waschschritt die Wells durch leichtes Klopfen auf eine absorbierende Unterlage (z.b. Papiertücher) trocknen. Manuelles Waschen: a. Den Inhalt der Wells in den Ausguss schütten, dabei die langen Seiten des Rahmens zusammendrücken. b. Die Wells auf einer absorbierenden Unterlage (z. B. Papiertücher) leicht ausklopfen. c µL Waschpuffer in der Arbeitskonzentration mit einer Mehrkanalpipette in die Wells pipettieren. d. Die Mikrotiterplatte auf einer flachen Unterlage stehend leicht schütteln e. Zweimaliges Wiederholen der Schritte a bis d. f. Die Wells wie unter a und b entleeren. 3. Pipettieren des Konjugats 100µL Konjugat in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier abtrocknen um Spritzer zu entfernen. Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges Konjugat in die Konjugat-Flasche zurückgeben. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 4. Waschen der Platte Siehe Abschnitt Pipettieren von Substrat (TMB) Nach dem Waschen 100µL TMB in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier abtrocknen um Spritzer zu entfernen. Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges TMB in die TMB-Flasche zurückgeben. 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. 6. Reaktionsende 100µL Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren. Die Farbe schlägt von blau nach gelb um. 7. Farbmessung Die optische Dichte (OD) bei 450nm in jedem Well mit einem Mikrotiterplatten-Reader innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stopp-Lösung bestimmen. 8 ERGEBNISSE UND QUALITÄTSKONTROLLE 8.1 SEMI-QUANTITATIVER / SCREENING-TEST 1. Qualitätskontrolle Nur, wenn alle nachfolgend aufgeführten Kriterien erfüllt sind, ist der Test gültig. Kalibratoren/Cut-Off-Kontrolle (je nach Methode) und Positiv- und Negativkontrolle müssen bei jedem Testansatz mitgeführt werden. Die Ergebnisse/OD s der Kontrollen müssen in dem angegebenen Wertebereich (siehe QC-Zertifikat) liegen. Gilt nur für den quantitativen Test: Die berechnete Kalibrationskurve sollte der auf dem QC-Zertifikat abgebildeten Kalibrationskurve ähnlich sein. Sind die oben aufgeführten Kriterien nicht erfüllt, ist der Test ungültig und sollte wiederholt werden. 2. Berechnung der mittleren optischen Dichte (nur bei Doppelbestimmung): Für jeden Kalibrator und jede Kontrolle und Probe die mittlere optischen Dichte (OD) der Doppelbestimmungen berechnen. Der Variationskoeffizient (%VK) der Doppelbestimmungen sollte jeweils unter 15% liegen. 8.2 SCREENING-TEST - INTERPRETATION DER ERGEBNISSE 1. Qualitätskriterien für die Optische Dichte (OD) Die OD der Positivkontrolle sollte größer als 0,6 und größer als die OD der Cut-Off-Kontrolle sein. Die OD der Negativkontrolle sollte kleiner als 0,25 sein. Die OD der Cut-Off-Kontrolle sollte größer als die der Negativkontrolle sein, aber kleiner als 0,5. Insert code: E090.E, Version 2 October 2007, Page 5 of 7
6 2. Interpretation der Ergebnisse Bei Verwendung der Cut-Off-Kontrolle sind die Ergebnisse wie in der folgenden Tabelle angegeben zu interpretieren: ERGEBNISSE INTERPRETATION AKTION OD größer oder gleich Cut-Off-Kontrolle OD kleiner Cut-Off- Kontrolle Verdacht auf das Vorkommen von Anti-CCP2 Autoantikörpern Negativ Im semi-quantitativen Test messen falls genaue Konz. benötigt wird Befund: Negativ 8.3 SEMI-QUANTITATIVE BESTIMMUNG - BERECHNUNG DER ERGEBNISSE 1. Erstellen der Kalibrationskurve Die Kalibrationskurve kann entweder automatisch oder manuell erstellt werden. Dazu wird die Anti-CCP2 Autoantikörper-Konzentration auf der logarithmischen Skala gegen die OD-Werte auf der linearen Skala für jeden Kalibrator aufgetragen. Automatisch: Geeignete, validierte Software verwenden. Kalkulationsmodus verwenden, der am besten zu den Daten passt. Manuell: Halblogarithmisches Millimeterpapier verwenden, eine Ausgleichskurve durch die Punkte legen (keine Gerade oder Punkt-zu-Punkt-Verbindung). 2. Umgang mit abweichenden Kalibrationspunkten Liegt ein Messpunkt nicht auf der Kalibrationskurve, so kann er weggelassen werden. Der Test sollte wiederholt werden, wenn die daraus resultierende Kalibrationskurve deutlich von der im QC-Zertifikat angegebenen Kurvenform abweicht oder wenn mehrere Kalibrationspunkte zu starke Abweichungen aufweisen. 3. Berechnung der Autoantikörper-Konzentrationen der Kontrollen Die Anti-CCP2 Autoantikörper-Konzentrationen der Kontrollen direkt aus der Kalibrationskurve ablesen. Die Werte sollten in dem im QC-Zertifikat angegeben Bereich liegen 4. Berechnung der Autoantikörper-Konzentrationen der verdünnten Proben Die Anti-CCP2 Autoantikörper-Konzentrationen der Proben direkt aus der Kalibrationskurve ablesen. Hinweis: Die Standardprobenverdünnung von 1:100 ist in der Kalibrationskurve bereits berücksichtigt. Es sind keine weiteren Korrekturen nötig. 7. van Venrooij, W.J., et al., Autoantibodies to citrullinated antigens in (early) rheumatoid arthritis. Autoimmun Rev, (1), Coenen, D., et al., Technical and diagnostic performance of 6 assays for the measurement of citrullinated protein/peptide antibodies in the diagnosis of rheumatoid arthritis. Clin Chem, (3), van Gaalen, F.A., et al., Autoantibodies to cyclic citrullinated peptides predict progression to rheumatoid arthritis in patients with undifferentiated arthritis: a prospective cohort study. Arthritis Rheum, (3), Ronnelid, J., et al., Longitudinal analysis of citrullinated protein/peptide antibodies (anti-cp) during 5 year follow up in early rheumatoid arthritis: anti-cp status predicts worse disease activity and greater radiological progression. Ann Rheum Dis, (12), Berglin, E., et al., Radiological outcome in rheumatoid arthritis is predicted by presence of antibodies against cyclic citrullinated peptide before and at disease onset, and by IgA-RF at disease onset. Ann Rheum Dis, (4), Milford Ward, A., J. Sheldon, and G.D. Wild, eds. Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity. 3 ed. Vol , PRU Publications: Sheffield. 11 PLATTENSCHEMA Siehe Ende der Arbeitsanleitung. KURZARBEITSANLEITUNG µL von jedem Kalibrator und jeder Kontrolle und 1:100 verdünnten Proben in das entsprechende Well pipettieren. 30 Minuten inkubieren. Waschen µL Konjugat in jedes Well geben. 30 Minuten inkubieren. Waschen µL Substrat in jedes Well geben. 30 Minuten im Dunkeln inkubieren µL Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren. Absorption bei 450nm messen. 5. Kalibration des Test Der Kit ist gegen eine interne, willkürliche Referenzpräparation kalibriert, da kein anerkannter internationaler Standard verfügbar ist. Die Angaben sind in U/mL. 6. Grenzen des Tests Dieser Testkit dient nur zur Unterstützung der Diagnose. Ein positives Ergebnis muss durch den klinischen Befund und andere serologische Untersuchungen bestätigt werden. Die Testergebnisse können nicht als diagnostischer Beweis für das Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein einer Krankheit verwendet werden. Nicht in allen RA Patienten können Anti-CCP2 IgG-Antikörper nachgewiesen werden. Die Leistungsdaten für diesen Test sind nur für Humanserum etabliert worden. BINDAZYME ist ein eingetragenes Warenzeichen von The Binding Site Ltd., UK. P.O. Box 11712, Birmingham B14 4ZB. England 9 ERWARTETE WERTE Der Normalbereich wurde anhand von 200 Seren von normalen Blutspendern ermittelt. Bevor der Mittelwert und die Standartabweichung (SD) berechnet wurden, wurde eine positive Probe mit einem sehr hohen Anti-CCP2 Wert (300 U/mL) ausgeschlossen. Das positive Ergebnis dieser Probe konnte mit 3 alternativen Anti-CCP2 ELISAs bestätigt werden. Die obere Grenze des Normalbereichs wird angegeben als die Durchschnittskonzentration: 3.03 U/mL + 5 SD und entspricht 20.0 U/mL. Die unten angegebenen Werte dienen nur zur Orientierung. ELISAs sind sehr sensitiv und in der Lage kleine Unterschiede in der Probenpopulation festzustellen. Daher wird empfohlen, dass jedes Labor auf der Basis der lokalen Population und der verwendeten Geräte und Techniken seinen eigenen Normalbereich ermittelt. INTERPRETATION < 20 Negativ 20 Positiv 10 REFERENZEN 1. Arnett, F.C., et al., The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, (3), de Angelis, V. and P.L. Meroni, Rheumatoid Factors, in Autoantibodies, Y. Shoenfeld, M.E. Gershwin, and P.L. Meroni, Editors. 2007, Elsevier, B.V. Oxford van Venrooij, W.J. and G.J. Pruijn, Citrullination: a small change for a protein with great consequences for rheumatoid arthritis. Arthritis Res, (4), Schellekens, G.A., et al., Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest, (1), Schellekens, G.A., et al., The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide. Arthritis Rheum, (1), van Gaalen, F.A., et al., A comparison of the diagnostic accuracy and prognostic value of the first and second anti-cyclic citrullinated peptides (CCP1 and CCP2) autoantibody tests for rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis, (10), Insert code: E090.E, Version 2 October 2007, Page 6 of 7
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