Automatisierte Bestimmung von Acrylamid in Wasser Sebastian Wierer (LCTech GmbH), Dr. Hans Rainer Wollseifen (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co.
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1 Automatisierte Bestimmung von Acrylamid in Wasser Sebastian Wierer (LCTech GmbH), Dr. Hans Rainer Wollseifen (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG) APPLIKATIONSNOTE Stand: Februar 2017, Version: 1.3
2 Inhalt 1 Einleitung Methodenentwicklung Chemikalien Probenmaterial Festphasenextraktion (manuell) Festphasenextraktion (automatisiert durch LCTech) Eluententausch Messung mittels LC-MS/MS Konfiguration FREESTYLE Verbrauchsmaterialien von Macherey & Nagel Ergebnisse Wiederfindungen (automatisiert mit FREESTYLE SPE) Chromatogramm Quellen Keywords: DIN ; Trinkwasserverordnung Deutschland, TrinkwV; Trinkwasserverordnung Österreich, TWV; United States National Primary Drinking Water Regulations (US NPDWR); US EPA Methode 8032A 2
3 1 Einleitung Flusswasser und Trinkwasser werden regelmäßig auf ihre Qualität überprüft. Im Zuge dieses Monitorings werden gemäß der DIN Proben genommen und auf Acrylamid mittels Festphasenextraktion überprüft. Aufgrund seines cancerogenen Potentials wurde Acrylamid in die Trinkwasserverordnung vom 21. Mai 2001 als neuer Parameter in die Stoffliste (Anlage 2, Teil I, lfd. Nr. 1) aufgenommen. Der Grenzwert hierfür wurde auf 0,1 μg/l festgelegt. Durch die Verwendung von Polyacrylamiden als Flockungshilfsmittel in der Trinkwasseraufbereitung, sowie in der Papierindustrie, besteht die Notwendigkeit auf Untersuchung. Desweiteren besteht prinzipiell immer die Möglichkeit des Herauslösens von Acrylamid mit Wasser, da bei der technischen Herstellung von Polyacrylamid Spuren des monomeren Acrylamids im Endprodukt zurückbleiben. Nachfolgend wird aufgezeigt, wie die Proben mittels Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE) sowohl manuell als auch automatisiert mit dem Robotiksystem FREESTYLE SPE für die nachfolgende Analytik vorbereitet werden. Aufgrund der Möglichkeit der Nutzung des Systems rund um die Uhr und der sequentiellen, unbeaufsichtigen Abarbeitung der Proben kann bei der automatisierten Bearbeitung ein sehr hoher Probendurchsatz realisiert werden. Der Anwender ist dadurch deutlich entlastet und ihm steht mehr Zeit für andere Aufgaben zur Verfügung. [1] 3
4 2 Methodenentwicklung 2.1 Chemikalien Wasser: Reinstwasser von Milli-Q Integral produziert Methanol (für SPE): for analysis, Merck Methanol (für LC-MS): ULC/MS Biosolve Natriumthiosulfat-Pentahydrat, p.a., Merck Ameisensäure 99 % ULC/MS Biosolve Acrylamid, 4 x krist. 99,9 % 2.2 Probenmaterial Es wird 1 ml eines methanolischen Acrylamidstandards (1μg/mL) und 1 ml einer wässrigen Natriumthiosulfat-Pentahydrat-Lösung (100 mg/ml) auf 1 L mit dest. Wasser aufgefüllt. Hiervon werden jeweils 100 ml pro Probe als Vorlage (n=6) verwendet. 2.3 Festphasenextraktion (manuell) SPE - Schritte Konditionieren Laden Waschen CHROMABOND Carbon A, 6 ml, 1000 mg 8 ml Methanol 8 ml Wasser Probenaufgabe bei 20 ml/min. 1 ml Wasser Trocknen 15 Minuten mit N 2 Elution 5 x 2 ml Methanol 4
5 2.4 Festphasenextraktion (automatisiert durch LCTech) FREESTYLE Robotiksystem Das FREESTYLE Robotiksystem ist ein System zur automatisierten Probenvorbereitung. Es besteht aus dem Grundbaustein des FREESTYLE BASIC, das mit verschiedenen Modulen, abhängig von den Anforderungen der Anwender, ausgestatten werden kann. Ausgerüstet mit dem SPE-Modul bearbeitet das FREESTYLE alle Methoden im Bereich der Festphasenextraktion. Durch die feste Verbindung der SPE-Säule mit dem Roboterarm lassen sich zum einen die Säulen an jeden Platz der Plattform bewegen. Darüber hinaus erlaubt sie aber auch eine kontrollierte Druckbeaufschlagung von bis zu 4 bar, die besonders wichtig ist bei Applikationen, bei denen Schwebstoffe die Säule blockieren können. Mit dem FREESTYLE SPE lassen sich alle SPE Standard-Säulenformate (1, 3, 6, 8, 15 ml) aber auch Glassäulen von LCTech (bis 15 ml), automatisiert bearbeiten Bearbeitung mit FREESTYLE SPE Die manuelle Festphasenextraktion kann ganz leicht auf das Robotiksystem zur automatisierten Probenvorbereitung mit dem FREESTYLE SPE übertragen werden. Die einfach zu bedienende Software des Systems bietet einen Methodeneditor, der Methodenentwicklung auf dem System schnell und unkompliziert macht. Durch Drag & Drop lässt sich in Sekundenschnelle die Grobstruktur der Methode definieren. Durch Verschieben von Balken können Parameter wie z. B. Volumen und Geschwindigkeiten angegeben werden. 5
6 Folgende Schritte werden vom FREESTYLE vollautomatisiert durchgeführt: SPE-Schritte Konditionieren Konditionieren Laden Laden Trocknen Elution Trocknen vollautomatisiert 8 ml Methanol, 10 ml/min. 11 ml Wasser, 10 ml/min. 50 ml Probe, 10 ml/min. 50 ml Probe, 10 ml/min. 15 min., Stickstoff 10 ml Methanol/Acetonitril 1:1, 10 ml/min. 20 ml Luft, 20 ml/min Die genauen Parametereinstellungen der Methode am FREESTYLE sind im nachfolgenden Methodenreport dargestellt. Methodenreport 6
7 2.5 Eluententausch Das Eluat (von manueller und automatisierter Aufreinigung) wird in eine Rundküvette überführt (Nano Reaktionsgläser, AD: 16 mm, 20 St., Art.-Nr.: 91680). Es wird mit 1 ml Methanol nachgespült. Die Temperatur auf dem Thermoblock (Vario 4, Art.-Nr.: ) wird auf 40 C eingestellt. Unter leichtem Stickstoffstrom wird auf 1 ml Volumen eingeengt, überführt mit Wasser auf 1 ml Volumen aufgefüllt. Anschließend wird das Eluat inijziert. 2.6 Messung mittels LC-MS/MS Die nachfolgende Messung wurde auf einem Dionex Ultimate 3200 HPLC System in HPG Konfiguration mit einem AB Sciex API 3200 MS Detektor durchgeführt. Die folgende Konfiguration wurde dabei verwendet: Säule Eluent A Eluent B Gradient Flussrate Injektionsvolumen EC 150/3 NUCLEODUR C18 Gravity, 3 μm % Ameisensäure in Wasser % Ameisensäure in Methanol 10 % B auf 100% B (10 min.); 100% B auf 10% B (2 min.); 10% B (5 min. halten) 0,25 ml/min 10 μl Säulentemperatur 60 C MS/MS, AB Sciex API 3200 Ion source: Turbo Spray (ESI) Scan type: MRM Polarity: positive Curtain gas: 15 psig Detektion Ion spray voltage: 5000 V Temperature: 650 C Gas 1 (nebulizer): 60 psig Gas 2 (turbo gas): 50 psig CAD gas: 6 psig 7
8 2.7 Konfiguration FREESTYLE 1. FREESTYLE BASIC Bestellnr FREESTYLE SPE Bestellnr Rack für Lösungsmittelversorgung Bestellnr Greifring mit Klemmstreifen (3 ml) Bestellnr Kappen für 3 ml-säulen (wiederverwendbar) Bestellnr Probenrack für bis zu 18 SPE-Säulen Bestellnr Probenrack für 16 ml Flaschen Bestellnr Träger für Racks (100 mm) Bestellnr Probenrack für 60 ml Flaschen Bestellnr Träger für Racks (120 mm) Bestellnr Adapter für SPE-Säulen (wiederverwendbar) Bestellnr Gewindeflaschen (16 ml) Bestellnr. V Gewindeflaschen (60 ml) Bestellnr. F Verschlusskappe (60 ml) Bestellnr. V0024-SL 16. Septen (60 ml) Bestellnr. V0025-D 2.8 Verbrauchsmaterialien von MACHEREY-NAGEL 1. EC 150/3 NUCLEODUR C18 Gravity, 3 μm Bestellnr CHROMABOND Carbon A PP-Säulen, 6 ml, 1000 mg Bestellnr
9 3 Ergebnisse 3.1 Wiederfindungen (automatisiert mit FREESTYLE SPE) Analyt (n=6) Mittelwert (in %) RSD (in %) Acrylamid Chromatogramm Zusammenfassung Mit dem FREESTYLE SPE kann Acrylamid in Wasserproben mittels vollautomatisierter SPE zuverlässig und normkonform nach DIN mit hohen Wiederfindungen und hoher Reproduzierbarkeit bestimmt werden. Unbeaufsichtigt bearbeitet das System 24 Stunden an 7 Tagen / Woche die Proben. 9
10 4 Quellen [1] Validierungsdokument zur DIN , Bestimmung von Acrylamid -Verfahren mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und massenspektrometrischer Detektion (HPLC-MS/MS) 10
11 Kontakt LCTech GmbH Daimlerstraße Obertaufkirchen Deutschland Tel.: Fax: info@lctech.de 11
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