Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin Clones AE1/AE3

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1 Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin Clones AE1/AE3 ENGLISH Code M3515 Intended use For In Vitro Diagnostic Use. Monoclonal mouse anti-human Cytokeratin, clones AE1/AE3 is intended for laboratory use to identify qualitatively by light microscopy two epitopes present on a majority of epithelial cytokeratins in acetone-fixed frozen and formalin-fixed, paraffin-embedded tissue using immunohistochemical (IHC) test methods. Positive results aid in the classification of normal and neoplastic tissue as epithelial in origin 1-3 and serve as an adjunct to conventional histopathology. The clinical interpretation of any positive staining or its absence should be complemented by morphological and histological studies with proper controls. Evaluations should be made within the context of the patient's clinical history and other diagnostic tests by a qualified individual. Summary and explanation Cytokeratins are a family of water-soluble proteins with molecular weights between kd that form the cytoskeleton of epithelial cells. At least 19 different cytokeratins have been identified and can be divided into two subfamilies. Subfamily A comprises relatively acidic cytokeratins (with a pi under 5.5) whereas members of subfamily B have a relatively basic pi of 6 or over. Refer to Dako s General Instructions for Immunohistochemical Staining or the detection system instructions of IHC procedures for: 1) Principle of Procedure, 2) Materials Required, Not Supplied, 3) Storage, 4) Specimen Preparation, 5) Staining Procedure, 6) Quality Control, 7) Troubleshooting, 8) Interpretation of Staining, 9) General Limitations. Reagent provided Monoclonal Mouse antibody provided in liquid form as tissue culture supernatant in 0.05 mol/l Tris-HCl, ph 7.2 and mol/l sodium azide. This product contains stabilizing protein. Clones: AE1/AE3 1,2 Isotype: IgG 1, kappa Mouse lgg concentration mg/l: See label on vial. M3515 may be used at a dilution of 1:50 when performing IHC using the EnVision, EnVision Doublestain or LSAB2 detection systems. These are guidelines only. Optimal antibody concentrations may vary depending on specimen and preparation method and should be determined by each individual laboratory. The protein concentration between lots may vary without influencing the optimal dilution. The titer of each individual lot is compared and adjusted to a reference lot to ensure a consistent immunohistochemical staining performance from lot-to-lot. Immunogen Human epidermal callus 1 Specificity AE1/AE3 is a cocktail of two monoclonal antibodies that were obtained by immunizing mice with human callus keratins. 2 AE1/AE3 has been shown to identify the majority of human cytokeratins and thus may be used as a tool for the positive IHC identification of cells of simple and stratified epithelial origin. 1,2,4 Antibody AE1 immunoreacts with an antigenic determinant present on most of the subfamily A cytokeratins, including cytokeratins with Moll's designation 4 10, 13, 14, and 19 (MWs of 56.5, 54', 50, 50', 48 and 40 kd, respectively) but not on Nos. 12, 17 and 18 (55, 47 and 45 kd). 4 Antibody AE3 reacts with an antigenic determinant shared by the subfamily B cytokeratins including Nos. 1 and 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8 (MWs of 65, 67, 64, 59, 58, 56, 54 and 52 kd, respectively). 5 Materials required, but not supplied Refer to Dako s General Instructions for Immunohistochemical Staining and/or the detection system instructions. Precautions 1. For professional users. 2. This product contains sodium azide (NaN 3), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations, though not classified as hazardous, NaN 3 may react with lead and copper plumbing to form highly explosive build-ups of metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent metal azide build-up in plumbing As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used. 4. Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin. 5. Unused reagents should be disposed of according to local, State, and Federal regulations. Storage Store at 2 8 C. Do not use after expiration date s tamped on vial. If reagents are stored under any conditions other than those specified, the conditions must be verified by the user. There are no obvious signs to indicate instability of this product. Therefore, positive and negative controls should be run simultaneously with patient specimens. If unexpected staining is observed which cannot be explained by variations in laboratory procedures and a problem with the antibody is suspected, contact Dako Technical Support. ( ) EFG_003 p. 1/7

2 Specimen preparation Paraffin Sections AE1/AE3 can be used on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Tissue pretreatment for epitope enhancement is required. Either digestion using proteolytic enzymes or heat-induced epitope retrieval is effective. The following enzymes can be used for pretreatment of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: Proteinase K, RTU (code S3020), Pepsin (code S3002), or Proteolytic Enzyme, RTU (code S3007). Rinse thoroughly with distilled water and continue with the staining procedure of the detection system instructions. As an alternative to enzyme pretreatment, heat-induced epitope retrieval can be used. Heat-induced epitope retrieval involves immersion of tissue sections in a pre-heated buffer solution and maintaining heat, either in a water bath (95 99 C ), a steamer (95 99 C) or an autoclave (121 C). For greater adherence of tissue sections to glass slides, the use of Silanized Slides (code S3003) is recommended. Target Retrieval Solution (code S1700) or 10x Concentrate (code S1699) is recommended using a 20-minute heating protocol. After thermal treatment, allow the jar with buffer and slides to cool for 20 minutes at room temperature. Rinse well with buffer. Cryostat Sections and Cell Smears AE1/AE3 can be used for labelling acetone-fixed cryostat sections or fixed cell smears. Staining procedure Follow the procedure for the detection system selected. Staining interpretation The cellular staining pattern for AE1/AE3 is cytoplasmic. Product specific limitations 1. Extrafollicular reticulum cells of lymph nodes, tonsil and spleen have been shown to react with antibodies to cytokeratin The presence of cytokeratin 19 and possibly 8 has been confirmed in smooth muscle cells of the uterus Rare melanomas 9 and leiomyosarcomas 8 may stain positive. This finding is usually more pronounced on frozen tissue rather than formalin-fixed tissue. 10 Therefore; it is recommended that AE1/AE3 be used in a panel with HMB45 (when ruling out melanomas) and desmin (when ruling out leiomyosarcomas) as these latter antibodies lack specificity for epithelial cells. 4. False-positive staining of glial cells in tumors has been reported on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue when proteolytic pretreatment was employed. It was shown by immunocytochemical and biochemical methods that these cells and tumors do not express cytokeratins Pinkus et al. 12 stressed the importance of proteolytic digestion of formalin-fixed tissues to be stained with AE1/AE3. Photos of stained tissues depicted include the results when digestion with trypsin II was omitted, other trypsin enzymes were used and/or when suboptimal digestion techniques were applied. In the latter cases, only 2/12 epithelial neoplasms of various types exhibited optimal staining for cytokeratin. By reviewing conflicting cytokeratin immunoreactivities in earlier publications and comparing the same with their own, Pinkus et al. 12 considered many previously false-negative cases attributable to one or several of these short-comings. 6. From a comparison of AE1/AE3 with an anti-epithelial membrane antigen (EMA) antibody in an IHC study of 87 neoplasms, including 48 adenocarcinomas of various types, Pinkus et al. 13 concluded that the cytokeratin proteins in proteolytically treated formalin-fixed tissues and as stained by AE1/AE3 were more reliable markers in 33% of the cases of epithelial derived neoplasms than anti-ema. However, because EMA was positive and AE1/AE3 negative in 9% of the cases, it was recommended that AE1/AE3 and anti-ema be used as complementary reagents. 7. Although no false-positive staining was reported by Listrom and Dalton, 14 faint cytoplasmic staining was observed in 2/2 plasmacytomas, 2/4 melanomas and 2/7 lymphomas and considered to be the result of nonspecific background staining. Performance characteristics Normal Tissues Testing of 30 different normal tissues demonstrated positive staining in the cytoplasm of squamous and columnar epithelium of the cervix, colon, esophagus, skin, small intestine, stomach and tonsil. Other tissues that stained included glandular tissue (mammary, parathyroid, prostate sweat and thyroid), astrocyte, white matter of the cerebellum, glial filaments of the cerebrum, distal tubule and Bowman s capsule of the kidney, bile duct, pneumocytes, bronchi, mesothelium, interlobular duct of the pancreas, anterior pituitary cell, interlobular duct and acinar cells of the salivary gland, reticular cells and Hassall s bodies of the thymus, and endometrium and smooth muscle of the uterus. 15 Negative staining was noted for adrenal, bone marrow, heart, pericardium, peripheral nerve, skeletal muscle, spleen and testis. AE1/AE3 reacts with keratinized (56.5/65-67) and corneal (55/64) epidermis, stratified squamous epithelia of internal organs (51/59), stratified epithelia (50/58), hyperproliferative keratinocytes (48/56) and simple epithelia (45/52 and 46/54). The 40 kd keratin is present in most epithelia except adult epidermis. 3,4 Abnormal Tissues In pathological tissues, Listrom and Dalton 14 tested clones AE1/AE3 on over 60 poorly differentiated epithelial neoplasms, lymphomas, melanomas and sarcomas. Except for staining of only 2/6 cases of small cell carcinoma and 3/5 transitional cell carcinoma, the study found all of 34 epithelial neoplasms to stain positively. When positive, AE1/AE3 stained transitional cell carcinomas only weakly and staining of the tumor cells was either diffusely cytoplasmic or perinuclear. Montag et al. 16 found AE1/AE3 to be a sensitive reagent for the differential diagnosis of diffuse malignant mesothelioma of the sarcomatoid (spindle-cell) type (positive in 30/30 cases) from other types of spindle cell neoplasms (0/49). When compared with anti-ema in a study of 87 neoplasms, including 48 adenocarcinomas of various types, Pinkus et al. 13 found AE1/AE3 to stain 33% of the cases more reliably than the anti-ema. Although 3/3 cases of chondroid chordoma and 1/8 cases of lymphoma were reactive with anti-ae1/ae3, no positive staining was observed among 25 non-epithelial neoplasms including 4 cases each of melanoma and glioblastoma. 14 No cytokeratin was detected in 8 cases of nonepithelial tumors, including melanoma, lymphoma, neurofibroma, and sarcoma when AE1/AE3 was used in the immunoblot technique. 17 However, it was recommended 14 that AE1/AE3 serve as a member of an antibody panel for the determination of cell lineage in cases of poorly differentiated small cell neoplasms. ( ) EFG_003 p. 2/7

3 FRANÇAIS Code M3515 Intérêt Pour diagnostic in vitro. Monoclonal mouse anti-human Cytokeratin, clone AE1/AE3 est destiné à être utilisé en laboratoire afin d identifier qualitativement par microscopie optique deux épitopes présents sur une majorité de cytokératines épithéliales dans les tissus inclus en paraffine, fixé à l'acétone, congelé et fixé au formol, ceci en utilisant les méthodes d analyse immunohistochimiques (IHC). Des résultats positifs facilitent la classification du tissu normal et néoplasique d origine épithéliale 1-3 et servent de complément à l histopathologie classique. L interprétation clinique de tout marquage positif ou de toute absence doit être complétée par des études morphologiques et histologiques à l aide de témoins appropriés. Les évaluations doivent être réalisées uniquement par un professionnel agréé dans le contexte de l'historique clinique du patient et d'autres examens. Résumé et explication Les cytokératines sont une famille de protéines solubles dans l eau de poids moléculaire allant de 40 à 70 kd formant le cytosquelette des cellules épithéliales. Au moins 19 cytokératines différentes ont été identifiées et peuvent être réparties en deux sous-familles. La sousfamille A comprend des cytokératines relativement acides (à un pl inférieur à 5,5) alors que les membres de la sous-famille B ont un pl relativement basique de 6 ou plus. Se référer aux Instructions générales de coloration immunohistochimique de Dako ou aux instructions du système de détection concernant les procédures IHC pour : 1) Principe de procédure, 2) Matériaux requis mais non fournis, 3) Conservation, 4) Préparation des échantillons, 5) Procédure de coloration, 6) Contrôle qualité, 7) Dépannage, 8) Interprétation de la coloration, 9) Limites générales. Réactif fourni Anticorps monoclonal de souris fourni sous forme liquide comme surnageant de culture tissulaire dans un tampon Tris-HCl à 0,05 mol/l, de ph 7,2, contenant de l'azide de sodium à 0,015 mol/l. Ce produit contient une protéine stabilisante. Clone: AE1/AE3 1,2 Isotype: IgG 1, kappa Concentration en lgg de souris mg/l: Voir l étiquette sur le flacon. M3515 peut être dilué à 1:50 lorsque l HC est accompli en utilisant EnVision, EnVision Doublestain ou LSAB 2 detection systems. Ces informations ne sont délivrées qu à titre indicatif. Les concentrations d anticorps optimales peuvent varier selon l échantillon et la méthode de préparation et doivent être déterminées par chaque laboratoire particulier. La concentration en protéines peut varier d un lot à l autre sans que cela influence la dilution optimale. Le titre de chaque lot est comparé et ajusté par rapport à un lot de référence pour assurer des performances de coloration immunohistochimiques cohérentes d un lot à l autre. Immunogène Cal épidermique humain 1 Spécificité AE1/AE3 est un cocktail de deux anticorps monoclonaux obtenus en immunisant des souris avec des kératines calleuses humaines. 2 AE1/AE3 a montré pouvoir identifier la majorité des cytokératines humaines et par conséquent, il peut servir d outil pour l'identification positive par IHC des cellules simples et stratifiées d'origine épithéliale. 1,2,4 L'anticorps AE1 montre une immunoréaction à un déterminant antigénique présent sur la plupart des cytokératines de sous-famille A, y compris les cytokératines numérotées selon la désignation de Moll par 4 10, 13, 14, 15, 16 et 19 (Poids moléculaire de 56.5, 54', 50, 50', 48 et 40 kd, respectivement) mais non pour les numéros : 12, 17 et 18 (55, 47 et 45 kd). 4 L Anticorps AE3 montre une immunoréaction à un déterminant antigénique commun à la sous-famille des cytokératines B comprenant les numéros : 1 et 2, 3, 4, 5, 6, 7 et 8 (Poids moléculaire de 65, 67, 64, 59, 58, 56, 54 et 52 kd, respectivement). 5 Matériaux requis, mais non fournis Se référer aux Dako s Instructions Générales relatives à la procédure de Marquage Immunohistochimique et/ou aux instructions du système de détection. Précautions 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit contient de l azide de sodium (NaN 3), produit chimique hautement toxique dans sa forme pure. Aux concentrations du produit, bien que non classé comme dangereux, le NaN 3 peut réagir avec le cuivre et le plomb des canalisations pour former des azides métalliques hautement explosifs. Lors de l élimination, rincer abondamment à l eau pour éviter toute accumulation d azide métallique dans les canalisations Comme avec tout produit d origine biologique, respecter les procédures de manipulation appropriées. 4. Porter un vêtement de protection approprié pour éviter le contact avec les yeux et la peau. 5. Les réactifs non utilisés doivent être éliminés conformément aux réglementations locales et nationales. Conservation Conserver entre 2 et 8 C. Ne pas utiliser après la date de péremption imprimée sur le flacon. Si les réactifs sont conservés dans des conditions autres que celles indiquées, celles-ci doivent être validées par l utilisateur. Il n y a aucun signe évident indiquant l instabilité de ce produit. Par conséquent, les contrôles positifs et négatifs doivent être testés en même temps que des échantillons de patient. Si une coloration inattendue est observée, qui ne peut être expliquée par un changement des procédures du laboratoire, et en cas de suspicion d un problème lié à l anticorps, contacter l assistance technique de Dako. ( ) EFG_003 p. 3/7

4 Préparation de l échantillon Coupes en paraffine AE1/AE3 peut être utilisé sur des coupes de tissues incluses en paraffine, fixées au formol. Le prétraitement du tissu pour la restauration de l épitope est requis. La digestion utilisant les enzymes protéolytiques ou la restauration de l épitope par la chaleur sont toutes les deux efficaces. Les enzymes suivantes peuvent être utilisées dans le prétraitement des tissus inclus en paraffine, fixés au formol. Proteinase K, RTU (code S3020), Pepsin (code S3002), ou Proteolytic Enzyme, RTU (code S3007). Rincer minutieusement avec de l'eau distillée et poursuivre avec la procédure d'immunomarquage selon les instructions du système de détection. Comme alternative au prétraitement enzymatique, une restauration de l épitope par la chaleur peut être utilisé. La restauration de l épitope par la chaleur exige l immersion des coupes de tissus dans une solution tampon préchauffée et maintenue à température, soit dans un bainmarie (95 à 99 C), soit dans un four à vapeur (95 à 99 C), soit dans un autoclave (121 C). Pour une adhérence efficace des coupes de tissus aux lames de verre, l usage de Silanized Slides (code S3003) est requis. Target Retrieval Solution (code S1700) ou 10x Concentrate (code S1699) nécessite un protocole de chauffage de 20 minutes. Suite au traitement thermique, laisser refroidir la fiole avec tampon et lames pendant 20 minutes à température ambiante. Rincer parfaitement à l aide du tampon. Coupes Cryostat et Frottis Cellulaires AE1/AE3 peut être utilisé pour le marquage des coupes cryostat fixées à l acétone ou des frottis cellulaires fixés. Procédure d immunomarquage Suivre la procédure du système de détection choisi. L interprétation du marquage Le modèle de marquage cellulaire pour AE1/AE3 est cytoplasmique. Limites spécifiques du produit 1. Les Cellules réticulaires extrafolliculaires des ganglions lymphatiques, de l amygdale et de la rate ont montré une réaction aux anticorps à la cytokératine La présence de cytokératine 19 et probablement 8 a été confirmée sur les cellules du muscle lisse de l'utérus Des mélanomes rares 9 et léiomyosarcomes 8 peuvent être marqués positivement. Ce résultat est généralement plus prononcé sur le tissu congelé que sur le tissu fixé au formol. 10 Par conséquent, il est recommandé que AE1/AE3 soit utilisé dans un panel avec HMB45 (mélanomes exclus) et avec desmine (léiomyosarcomes exclus) étant donné que ces derniers anticorps manquent de spécificité pour les cellules épithéliales. 4. Un marquage faux-positif des cellules gliales dans les tumeurs a été observé sur tissu inclus en paraffine, fixé au formol lorsqu'un prétraitement protéolytique était utilisé. Il a été démontré par des méthodes immunocytochimiques et biochimiques que ces cellules et tumeurs n expriment pas de cytokératines Pinkus et Al. 12 ont souligné l importance de la digestion protéolytique des tissus fixés au formol à marquer au AE1/AE3. Des photos des tissus marqués présentent les résultats lorsque la digestion à la trypsine II était omise, lorsque d autres enzymes trypsine étaient utilisées et/ou lorsque des techniques de digestion sous-optimales étaient appliquées. Dans le dernier cas, seuls 2/12 des néoplasmes épithéliaux de types variés ont montré un marquage optimal à la cytokératine. En examinant les immunoréactivités contradictoires de la cytokératine dans les publications passées et en les comparant à la leur, Pinkus et Al 12 ont considéré plusieurs cas précédemment faux-négatifs comme attribuables à l une ou à plusieurs de ces imperfections. 6. En comparant AE1/AE3 avec un anticorps de l antigène de la membrane anti-épithéliale (EMA) dans une étude IHC de 87 néoplasmes, comprenant 48 adénocarcinomes de types variés, Pinkus et Al. 13 ont conclu que les protéines de cytokératine dans les tissus à traitement protéolytique fixés au formol et marqués par AE1/AE3 étaient des marqueurs plus fiables dans 33% des cas de néoplasmes à dérivation épithéliale que les anti-ema. Cependant, comme dans 9% des cas, EMA était positif et AE1/AE3 était négatif, il est recommandé d utiliser AE1/AE3 et anti-ema comme réactifs complémentaires. 7. Bien qu aucun marquage faux-positif n ait été reporté par Listrom et Dalton, 14 un marquage cytoplasmique faible a été observé dans 2 cas sur 2 de plasmacytomes, 2 cas sur 4 de mélanomes et 2 cas sur 7 de lymphomes et ce marquage a été considéré comme étant le résultat d un marquage de fond non spécifique. Caractéristiques de la performances Tissus Normaux L analyse de 30 tissus normaux variés a montré un marquage positif dans le cytoplasme de l épithélium squameux prismatique du col de l utérus, du côlon, de l œsophage, de la peau, de l intestin grêle, de l estomac et de l amygdale. D autres tissus ayant été marqués comprenaient le tissu glandulaire (mammaire, parathyroïdien, de la prostate sudoripare et de la thyroïde), l astrocyte, la substance blanche du cervelet, les filaments gliaux du cerveau, les tubes distaux et la capsule de Bowman du rein, les canaux biliaires, les pneumocytes, les bronches, le mésothélium, le canal interlobulaire du pancréas, la cellule pituitaire antérieure, le canal interlobulaire et les cellules acineuses de la glande salivaire, les cellules réticulaires et les corpuscules de Hassall du thymus et l'endométrium et le muscle lisse de l'utérus. 15 Un marquage négatif a été observé dans la glande surrénale, la moelle osseuse, le cœur, le péricarde, le nerf périphérique, le muscle squelettique, la rate et les testicules. AE1/AE3 réagit avec l épiderme kératinisé (56,5/65 à 67) et cornéen (55 à 64), l épithélium squameux stratifié des viscères (51 à 59), l épithélium stratifié (50 à 58), les kératinocytes hyperprolifératifs (48 à 56) et l épithélium simple (45 à 52 et 46 et 54). La kératine 40 kd est présente dans la plupart des épithéliums à l'exception de l'épiderme adulte. 3,4 Tissus Anormaux Dans les tissus pathologiques, Listrom et Dalton 14 ont testé les clones AE1/AE3 sur plus de 60 néoplasmes épithéliaux faiblement différenciés, des lymphomes, des mélanomes et des sarcomes. A l exception du marquage de 2 sur 6 cas de carcinomes à petite cellule seulement et 3 sur 5 carcinomes à cellule de transition, l étude a montré que les 34 néoplasmes épithéliaux étaient tous marqués positivement. Lorsque positivf, AE1/AE3 a marqué seulement faiblement les carcinomes à cellules de transition et le marquage des cellules tumorales était soit cytoplasmique de facon diffuse, soit périnucléaire. Montag et Al. 16 ont trouvé que AE1/AE3 est un réactif sensible pour le diagnostic différentiel du mésothéliome malin diffus du type (cellule fusiforme) sarcomatoïde (positif dans 30 cas sur 30) par opposition aux autres types de néoplasmes à cellule fusiforme (0 cas sur 49). Lorsque comparé à l anti-ema dans une étude de 87 néoplasmes, y compris 48 adénocarcinomes de types variés, Pinkus et Al. 13 ont montré que AE1/AE3 marquait 33% des cas plus faiblement que l anti-ema. ( ) EFG_003 p. 4/7

5 Bien que 3 cas sur 3 de chondromes chondroïdes et 1 cas sur 8 de lymphomes ont montré une réaction à l anti-ae1/ae3, aucun marquage positif n a été observé parmi 25 des néoplasmes non épithéliaux y compris chacun des 4 cas de mélanomes et glioblastome. 14 Aucune cytokératine n a été détectée dans 8 cas de tumeurs non épithéliales, y compris le mélanome, le lymphome, le neurofibrome et le sarcome lorsque AE1/AE3 était utilisé dans la technique d immunotransfert. 17 Cependant, il a été recommandé 14 de se servir d AE1/AE3 comme membre d un panel d anticorps pour la détermination du lignage cellulaire dans des cas de néoplasmes à petite cellule faiblement différenciées. DEUTSCH Code M3515 Zweckbestimmung Zur Verwendung für In-vitro-Untersuchungen. Monoclonal Mouse Anti-human Cytokeratin, Klone AE1/AE3 ist zum Laborgebrauch für den qualitativen Nachweis zweier Epitope mittels Lichtmikroskopie und immunhistochemischer (IHC-) Testmethoden bestimmt, die auf der Mehrzahl von Epithelcytokeratinen in azetonfixierten gefrorenen und formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben vorkommen. Positive Ergebnisse unterstützen bei der Klassifikation gesunder und neoplastischer Gewebe, die ihrer Herkunft nach Epithelien sind, 1-3 und dienen als Ergänzung zur konventionellen Histopathologie. Die klinische Bewertung einer vorhandenen oder fehlenden positiven Färbung sollte durch morphologische und histologische Studien mit entsprechenden Kontrollen ergänzt werden. Die Interpretation muss unter Berücksichtigung der klinischen Anamnese des Patienten und im Kontext weiterer diagnostischer Verfahren durch einen erfahrenen Pathologen erfolgen. Zusammenfassung und Erläuterung Cytokeratine sind eine Familie wasserlöslicher Proteine mit Molekulargewichten zwischen kd, die das Zytoskelett der Epithelzellen bilden. Mindestens 19 unterschiedliche Cytokeratine sind bis heute identifiziert worden und können in zwei Unterfamilien unterteilt werden. Unterfamilie A besteht aus relativ sauren Cytokeratinen (mit einem pi unter 5,5), wogegen die Mitglieder der Unterfamilie B einen relativ basischen pi von 6 oder mehr haben. Folgende Angaben bitte den Allgemeinen Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung von Dako bzw. den Anweisungen des Detektionssystems für IHC-Verfahren entnehmen: 1) Verfahrensprinzipien, 2) Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Materialien, 3) Aufbewahrung, 4) Vorbereitung der Probe, 5) Färbeverfahren, 6) Qualitätskontrolle, 7) Fehlerbehebung, 8) Auswertung der Färbung, 9) Allgemeine Beschränkungen. Geliefertes Reagenz Monoklonaler Maus-Antikörper in flüssiger Form als Gewebekulturüberstand in 0,05 mol/l Tris-HCI-Puffer, ph 7,2 und 0,015 mol/l Natriumazid. Dieses Produkt enthält ein Stabilisatorprotein. Klon: AE1/AE3 1,2 Isotyp: IgG 1, kappa Maus IgG-Konzentration mg/l: Siehe Produktetikett. M3515 kann bei der Durchführung von IHC-Tests unter Verwendung der Nachweissysteme EnVision, EnVision Doublestain oder LSAB 2 bei einer Verdünnung von 1:50 benutzt werden. Hierbei handelt es sich lediglich um Richtlinien. Die optimalen Antikörperkonzentrationen schwanken je nach Probe und Methode der Probenvorbereitung und sollten von jedem einzelnen Labor bestimmt werden. Die Proteinkonzentration kann bei den Chargen verschieden ausfallen, ohne die optimale Verdünnung zu beeinflussen. Der Titer wird bei jeder einzelnen Charge angeglichen, um vergleichbare immunhistochemische Färbeergebnisse zwischen den Chargen mit einer Referenzcharge zu gewährleisten. Immunogen Humaner epidermaler Kallus 1 Spezifität AE1/AE3 ist ein Cocktail aus zwei monoklonalen Antikörpern, die aus der Immunisierung von Mäusen mit humanen Kalluskeratinen gewonnen wurden. 2 AE1/AE3 weist die Mehrzahl humaner Cytokeratine nach und kann daher als Werkzeug für den positiven IHC-Nachweis von Zellen verwendet werden, deren Herkunft in einfachen und stratifizierten Epithelien liegt. 1,2,4 Antikörper AE1 zeigt eine Immunreaktion mit einer antigenen Determinante, die auf den meisten Cytokeratinen der Subfamilie A vorkommt, einschließlich Cytokeratinen mit der Mollschen Bezeichnung 4 10, 13, 14, 15, 16 und 19 (MG 56,5, 54', 50, 50', 48 bzw. 40 kd), jedoch nicht auf den Nummern 12, 17 und 18 (MG 55, 47 bzw. 45 kd). 4 Antikörper AE3 reagiert mit einer antigenen Determinante, die den Cytokeratinen der Subfamilie B gemeinsam ist, einschließlich der Nummern 1 und 2, 3, 4, 5, 6, 7 und 8 (MG 65, 67, 64, 59, 58, 56, 54 bzw. 52 kd). 5 Zusätzlich benötigte Reagenzien und Zubehör (außerhalb des Lieferumfangs) Siehe Allgemeine Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung von Dako und/oder Anweisungen des Detektionssystems. Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur für Fachpersonal bestimmt. 2. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN 3), eine in reiner Form äußerst giftige Chemikalie. Ansammlungen von NaN 3 können auch in Konzentrationen, die nicht als gefährlich klassifiziert sind, mit Blei- und Kupferabflussrohren reagieren und hochexplosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung stets mit viel Wasser nachspülen, um Azidansammlungen in den Leitungen vorzubeugen Wie alle Produkte biologischen Ursprungs müssen auch diese entsprechend gehandhabt werden. 4. Entsprechende Schutzkleidung tragen, um Augen- und Hautkontakt zu vermeiden. 5. Nicht verwendete Lösung ist entsprechend örtlichen, bundesstaatlichen und staatlichen Richtlinien zu entsorgen. ( ) EFG_003 p. 5/7

6 Aufbewahrung Bei 2 8 C aufbewahren. Nach Ablauf des auf dem Flä schchen aufgedruckten Verfallsdatums nicht mehr verwenden. Werden die Reagenzien nicht entsprechend den angegebenen Bedingungen aufbewahrt, müssen die Bedingungen vom Anwender geprüft werden. Es gibt keine offensichtlichen Anzeichen für eine eventuelle Produktinstabilität. Positiv- und Negativkontrollen sollten daher zur gleichen Zeit wie die Patientenproben getestet werden. Falls es zu einer unerwarteten Färbung kommt, die sich nicht durch Unterschiede bei Laborverfahren erklären lässt und auf ein Problem mit dem Antikörper hindeutet, ist der technische Kundendienst von Dako zu verständigen. Probenvorbereitung Paraffinschnitte AE1/AE3 kann auf formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten genutzt werden. Zur Epitopverstärkung ist eine Gewebevorbehandlung erforderlich. Zu diesem Zweck hat sich entweder eine Verdauung mittels proteolytischer Enzyme oder hitzeinduziertes Epitope-Retrieval als wirksam erwiesen. Die folgenden Enzyme können für die Vorbehandlung formalinfixierter, paraffineingebetteter Gewebe verwandt werden: Proteinase K, RTU (Kode S3020), Pepsin (Kode S3002), oder Proteolytisches Enzym, RTU (Kode S3007). Gründlich mit destilliertem Wasser spülen und mit der Färbeprozedur gemäß der Anleitung für das Nachweissystem fortfahren. Als Alternative zur Enzymvorbehandlung kann das hitze-induzierte Epitope-Retrieval angewandt werden. Das hitze-induzierte Epitope- Retrieval verlangt das Eintauchen der Gewebeschnitte in eine vorgeheizte Pufferlösung und gleichbleibende Hitze, entweder im Wasserbad (95 99 C) oder im Dampfgarer (95 99 C) oder im Au toklav (121 C). Um eine bessere Haftung der Gewebe schnitte an den Glasobjektträgern zu erzielen, wird der Gebrauch von silanisierten Objektträgern (Silanized Slides, Kode S3003) empfohlen. Unter Anwendung eines 20-minütigen Aufheizverfahrens wird Target Retrieval Solution (Kode S1700) oder Zehnfach-Konzentrat (Kode S1699) empfohlen. Nach der Hitzebehandlung muss das Gefäß mit dem Puffer und den Objektträgern 20 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen. Mit dem Puffer gut spülen. Kryomikrotomschnitte und Zellabstriche AE1/AE3 kann zur Markierung azetonfixierter Kryomikrotomschnitte oder fixierter Zellabstriche verwendet werden. Färbeprozedur Folgen Sie der Prozedur für das ausgewählte Nachweissystem. Bewertung der Färbung Das zelluläre Färbemuster für AE1/AE3 ist zytoplasmatisch. Produktspezifische Beschränkungen 1. Extrafollikuläre Retikulumzellen von Lymphknoten, Tonsillen und Milz reagieren nachweislich mit den Antikörpern zu Zytokeratin Zytokeratin 19 und möglicherweise Zytokeratin 8 wurden in den glatten Muskelzellen des Uterus nachgewiesen Seltene Melanome 9 und Leiomyosarkome 8 könnten eine positive Färbung hervorrufen. Dieses Vorkommen ist gewöhnlich ausgeprägter auf gefrorenem Gewebe als auf formalinfixiertem Gewebe. 10 Daher wird die Verwendung von AE1/AE3 in einem Panel mit HMB45 (bei Ausschluss von Melanomen) und Desmin (bei Ausschluss von Leiomyosarkomen) empfohlen, da diese Antikörper keine Spezifität für Epithelzellen aufweisen. 4. Eine falsch-positive Färbung von Gliazellen in Tumoren wurde auf formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe bei einer proteolytischen Vorbehandlung beschrieben. Immunzytochemische und biochemische Methoden haben gezeigt, dass diese Zellen und Tumoren keine Cytokeratine exprimieren Pinkus et al. 12 hoben die Bedeutung einer proteolytischen Verdauung formalinfixierter Gewebe hervor, die mit AE1/AE3 gefärbt werden sollen. Fotos gefärbter Gewebe zeigen die Resultate, falls die Verdauung mit Trypsin II ausgelassen wurde, andere Trypsinenzyme verwendet und/oder keine optimalen Verdauungstechniken angewandt wurden. In letzteren Fällen zeigten nur 2/12 Epithelneoplasmen unterschiedlicher Typen eine optimale Färbung für Zytokeratin. Durch ihre Überprüfung widersprüchlicher Cytokeratin- Immunreaktivitäten in früheren Veröffentlichungen im Vergleich zu ihren eigenen Reaktivitäten konnten Pinkus et al. 12 viele zuvor aufgetretene falsch-negative Fälle einem oder mehreren dieser Mängel zuordnen. 6. Anhand eines Vergleichs zwischen AE1/AE3 und einem antiepithelialen Membranantigen-(Anti-EMA-)-Antikörper in einer IHC-Studie von 87 Neoplasmen, einschließlich 48 Adenokarzinomen unterschiedlicher Typen, kamen Pinkus et al. 13 zu der Schlussfolgerung, dass die Cytokeratinproteine in proteolytisch behandelten, formalinfixierten Geweben, die von AE1/AE3 gefärbt wurden, in 33% der Fälle im Vergleich zu Anti-EMA die zuverlässigeren Marker epithelabgeleiteter Neoplasmen waren. Da jedoch in 9% aller Fälle EMA positiv und AE1/AE3 negativ reagierten, wurde empfohlen, AE1/AE3 und Anti-EMA als komplementäre Reagenzien einzusetzen. 7. Obwohl von Listrom und Dalton 14 keine falsch-positive Färbung berichtet wurde, konnte eine schwache zytoplasmatische Färbung in 2/2 Plasmazytomen, 2/4 Melanomen und 2/7 Lymphomen beobachtet werden, die als Resultat einer unspezifischen Hintergrundfärbung betrachtet wurde. Leistungs-eigenschaften Normalgewebe Tests von 30 unterschiedlichen Normalgeweben zeigten eine positive Färbung im Zytoplasma von Platten- und Zylinderepithel von Cervix, Kolon, Ösophagus, Haut, Dünndarm, Magen und Tonsillen. Andere färbende Gewebe umfassten Drüsengewebe (Mamma, Parathyroidea, Prostataschweißdrüsen und Thyroidea), Astrozyten, weiße Substanz des Cerebellum, Gliafilamente des Cerebrum, distale Nierentubuli und Bowman-Kapseln der Niere, Gallenkanal, Pneumozyten, Bronchien, Mesothel, interlobularer Pankreaskanal, vordere Hyphophysenzellen, interlobularer Kanal und azinöse Zellen der Speicheldrüsen, retikuläre Zellen und Hassall-Körperchen des Thymus, Endometrium und glatter Muskel des Uterus. 15 Eine negative Färbung wurde für Nebennieren, Knochenmark, Herz, Perikard, periphere Nerven, Skelettmuskel, Milz und Hoden beobachtet. AE1/AE3 reagiert mit keratinisierter (56,5/65-67) und Kornealepidermis (55/64), geschichtetem Plattenepithel der inneren Organe (51/59), Schichtepithel (50/58), hyperproliferativen Keratinozyten (48/56) und einfachem Epithel (45/52 und 46/54). Das 40-kD-Keratin kommt in den meisten Epithelien mit Ausnahme der adulten Epidermis vor. 3,4 ( ) EFG_003 p. 6/7

7 Anomale Gewebe In pathologischen Geweben testeten Listrom und Dalton 14 die Klone AE1/AE3 auf mehr als 60 schwach differenzierten Epithelneoplasmen, Lymphomen, Melanomen und Sarkomen. Mit Ausnahme der Färbung von nur 2/6 kleinzelligen Karzinomen und 3/5 Übergangszellkarzinomen ergab die Studie, dass alle 34 Epithelneoplasmen eine positive Färbereaktion zeigten. Bei einer positiven Reaktion färbte AE1/AE3 Übergangszellkarzinome nur schwach, und die Färbung der Tumorzellen war entweder diffus zytoplasmatisch oder perinuklear. Montag et al. 16 entdeckten, dass AE1/AE3 ein empfindsames Reagenz für die Differentialdiagnose zwischen diffusen malignen Mesotheliomen des sarkomatoiden (Spindelzell-) Typs (positiv in 30/30 Fällen) und anderen Typen von Spindelzellneoplasmen (0/49) war. Beim Vergleich mit Anti-EMA in einer Studie von 87 Neoplasmen, einschließlich 48 Adenokarzinomen unterschiedlicher Typen, entdeckten Pinkus et al., 13 dass AE1/AE3 in 33% der Fälle zuverlässiger färbte als Anti-EMA. Obwohl 3/3 chondroiden Chordomen und 1/8 Lymphomen mit Anti-AE1/AE3 reagierten, wurde bei 25 Nichtepithelneoplasmen, einschließlich je 4 Fällen von Melanomen und Glioblastomen, keine positive Färbung beobachtet. 14 Bei der Verwendung von AE1/AE3 in der Immunblotting-Technik wurde in keinem von 8 Fällen von Nichtepitheltumoren, einschließlich Melanom, Lymphom, Neurofibrom und Sarkom, Cytokeratin gefunden. 17 Es wurde jedoch empfohlen, 14 AE1/AE3 als Mitglied eines Antikörper-Panels für den Nachweis von Zelllinien in Fällen schwach differenzierter kleinzelliger Neoplasmen einzusetzen. References Références Literatur 1. Tseng SCG, Jarvinen MJ, Nelson WG, Huang JW, Woodcock-Mitchell J, Sun TTl. Correlation of specific keratins with different types of epithelial differentiation: Monoclonal antibody studies. Cell 1982;30(2): Woodcock-Mitchell J, Eichner R, Nelson WG, Sun TT. Immunolocalization of keratin polypeptides in human epidermis using monoclonal antibodies. J Cell Biol 1982;95(2 Pt 1): Moll R, Franke WW, Schiller Dl. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell 1982;31(1): Sun T-T, Eichner R, Schermer A, Cooper D, Nelson WG, Weiss RA. Classification, expression and possible mechanisms of evolution of mammalian epithelial keratins: A unifying model. In: Levine A, Topp W, Vande Woude G, Watson JD (eds.). Cancer cells 1 the transformed phenotype. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Eichner R, Bonitz P, Sun T-T. Classification of epidermal keratins according to their immunoreactivity, isoelectric point and mode of expression. J Cell Biol 1984;98(4): Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ No , Current 13. August 16, Franke WW, Moll R. Cytoskeletal components of lymphoid organs. Differentiation 1987;36(2): Gown AM, Boyd HC, Chang Y, Ferguson M, Reichler B, Tippens D. Smooth muscle cells can express cytokeratins of simple epithelium. Amer J Pathol 1988;132(2): Zarbo RJ, Gown AM, Nagle RB, Visscher DW, Crissman JD. Anomalous cytokeratin expression in malignant melanoma: One- and twodimensional western blot analysis and immunohistochemical survey of 100 melanomas. Mod Pathol 1990;3(4): Brown DC, Theaker JM, Banks PM, Gatter KC, Mason DY. Cytokeratin expression in smooth muscle and smooth muscle tumors. Histopathol 1987;11(5): Bacchi CA, Zarbo RJ, Jiang JJ, Gown AM. Do glioma cells express cytokeratin? Appl Immunohistochem 1995;3(1): Pinkus GS, O Connor EM, Etheridge CL, Corson JM. Optimal immunoreactivity of keratin proteins in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue requires preliminary trypsinization. J Histochem Cytochem 1985(5);33: Pinkus GS, Etheridge CL, O Connor EM. Are keratin proteins a better tumor marker than epithelial membrane antigen? Amer J Clin Pathol 1986;85(3): Listrom MB, Dalton LW. Comparison of keratin monoclonal antibodies MAK-6, AE1:AE3 and CAM-5.2. Amer J Clin Pathol 1987;88(3): Report of Normal Tissue Immunohistochemical testing using DAKO Mouse Anti-Human Cytokeratin, Clone AE1/AE3. DAKO Corp June Montag AG, Pinkus GS, Corson JM. Keratin protein immunoreactivity of sarcomatoid and mixed types of diffuse malignant mesothelioma: An immunoperoxidase study of 30 cases. Hum Pathol 1988;19(3): Nelson WG, Battifora H, Santana H and Sun T-T. Specific keratins as molecular markers for neoplasms with a stratified epithelial origin. Canc Res 1984;44(4): Edition 03/10 ( ) EFG_003 p. 7/7

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