Ligandis. biomarker diagnostics. Quantitativer Western Liganden Blot zur Analyse biologisch aktiver IGF-Bindungsproteine

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1 Ligandis biomarker diagnostics Quantitativer Western Liganden Blot zur Analyse biologisch aktiver IGF-Bindungsproteine

2 Ausgründungsinitiative aus dem Leibniz-Institut für Nutztierbiologie Gefördert durch 2

3 Ligandis biomarker diagnostics CLOSING THE GAP BETWEEN SCIENCE AND APPLICATION Durch eine Weiterentwicklung des Western Liganden Blot ermöglicht Ligandis die quantitative und funktionale Analyse der IGF-Bindungsproteine. Wir liefern damit den entscheidenden Schritt IGF- Bindungsproteine als Biomarker zu entwickeln. Hier ein Zitat welches richtig Eindruck macht und jeden überzeugt. Prof. Dr. Friedrich Metzger 3

4 Funktionale IGFBP-Diagnostik THE CHALLENGE IN PROTEIN DIAGNOSTIC : THE PROTEOLYSIS OF THE IGFBP Ein wichtiger Bestandteil der natürlichen Kontrolle der biologischen Wirkung des IGF-Systems liegt in der proteolytischen Degradation von IGFBPs. Dieses Phänomen spielt eine aktive Rolle bei der Kontrolle der biologischen Aktivität von IGF-I/-II bei der Schwangerschaft, bei rheumatischen Erkrankungen oder bei Krebs. Der quantitative Western Liganden Blot nutzt zur spezifischen Bestimmung von intakten IGFBPs ihre natürlichen Liganden und weist somit nur biologisch aktive IGFBPs nach. Das Testverfahren wird derzeit dahingehend erweitert, dass nicht nur intaktes IGFBP ermittelt wird, sondern auch IGFPB-Fragmente als separater Parameter ausgegeben werden. Ein Monitoring der Relation von intakten zu fragmentierten Proteinen aller 6 IGFBPs, kann zu bahnbrechenden Erkenntnissen führen. Antikörper-basierte Testsysteme können falsch positive Daten liefern, wenn IGFBP-Fragmente vorliegen. Der natürliche Ligand dagegen bindet nur an intakte Bindungsproteine. 4

5 VERGLEICH ZWISCHEN FUNKTIONALEM UND IMMUN-DIAGNOSTISCHEM ASSAY Beim methodischen Vergleich identischer klinischer Humanproben aus einem endokrinologischen Labor, konnten grundlegende Unterschiede festgestellt werden. Während der ELISA signifikant erhöhte IGFBP-3 Konzentrationen im Serum von Schwangeren diagnostizierte, konnte mittels quantitativen Western Liganden Blot IGFBP-3 faktisch nicht nachgewiesen werden (Abbildung A). Es ist anzunehmen, dass die Antigene der IGFBP- 3 Fragmente für die erhöhten IGFBP-3 Werte der ELISA-Messung verantwortlich sind. Die Antikörper haben also IGFBP-Fragmente gebunden, die auf Grund ihrer niedrigen Affinität zu den IGFs, nicht mehr als IGF-Bindungsproteine definiert sind. Da IGFBP-Fragmente nicht nur im Serum von Schwangeren zu finden sind, sondern insbesondere auch eine Rolle bei der Entstehung von Krebs spielen, ist das ELISA Testverfahren, in diesen Indikationen fehleranfällig. Der quantitative Western Liganden Blot erfasst ausschließlich intakte IGFBPs, was durch das Fehlen der charakteristischen Doppelbande in der korrekten Höhe ( 45 kda) nachgewiesen ist. (Abbildung B). 5

6 Gesamte IGF-Bindungskapazität RELEVANT FOR SCIENCE AND PHARMACEUTICAL INDUSTRY HOHER INFORMATIONSGEHALT Bei der Analyse neuer Proben oder neuer Wirkstoffe können alle 6 IGFBPs verändert sein. Daher wäre es sinnvoll sich nicht auf einzelne IGFBPs im Voraus festzulegen sondern das gesamte IGF-Spektrum ins Visier zu nehmen. Statt 6 einzelner immundiagnostischer Verfahren besteht der quantitative Western Liganden Blot (qwlb) aus einer einzigen Analyse. Derzeitig werden in akademischen Publikationen überwiegend IGFBP-3 (51%), IGFBP-1 (22%) und IGFBP-2 (12%) betrachtet (Abbildung links). Aus Kostengründen werden aber meist nur ein bis zwei Bindungsproteine gleichzeitig untersucht. Wir bieten der akademischen, institutionellen und klinischen Forschung Analysen des gesamten IGF- Spektrums zu einem Bruchteil des Preises. Dadurch ist eine Vorfestlegung auf bestimmte IGFBPs nicht mehr notwendig und Veränderungen bei den nicht untersuchten IGFBPs bleiben nicht länger unentdeckt. IGFBP-5 7% IGFBP-4 5% IGFBP-3 51% IGFBP-6 3% IGFBP-1 22% IGFBP-2 12% Quelle: National Center for Biotechnology Information Kostengünstige Analyse und Überwachung aller IGF- Bindungsproteine und dadurch keine Limitierung auf nur ein bis zwei IGFBPs in akademischen und klinischen Studien. 6

7 Ein Liganden Blot für alle Vertebraten HIGH PERFORMANCE IN CLINICAL RESEARCH Der Nachweis der IGF-Bindungsproteine erfolgt nicht wie bisher durch Antikörper, sondern durch den natürlichen Liganden. Dieser erkennt im Gegensatz zum Antikörper die Bindungsproteine verschiedener Spezies (von der Maus bis zum Menschen), so dass mit diesem Assay sowohl Proben von Tiermodellen als auch Patientienproben gemessen werden können. Diese Eigenschaften prädestinieren die Methode für den Einsatz in der präklinischen und klinischen Forschung, da hier neben Untersuchungen beim Menschen auch mehrere Tiermodelle zum Einsatz kommen. 7

8 Monitoring der IGF-Bindungsproteine T I M E R E S O L V E D A N A L Y S I S O F I G F B P Das Monitoring unterschiedlicher IGFBPs vor und nach einem bestimmten Ereignis. Der quantitative Western Liganden Blot ist geeignet für die Überwachung aller IGFBP und deren Veränderung im zeitlichen Verlauf, da er die Werte aller IGFBPs ermittelt und bereits kleinste Veränderungen in biologischen Proben aufzeigt. Diese Eigenschaften prädestinieren den qwlb für die Beurteilung von Therapieeffekten nach einer medikamentösen Behandlung. In einem Referenzprojekt mit der F. Hoffmann-La Roche AG, konnte der Biomarkerwert eindrucksvoll bewiesen werden. ung von Therapieverläufen nach einer medikamentösen Behandlung. 8

9 Prozessoptimierung und Qualitätsmanagement HIGH THROUGHPUT - BEST PERFORMANCE Ligandis hat den quantitativen Western Liganden Blot entwickelt und dabei die Prozessabläufe optimiert, so dass der Probendurchsatz auf ein hohes Niveau angehoben werden konnte. Unsere innovative Dienstleistung beinhaltet somit nicht nur funktionale und quantitative Analysen der IGF-Bindungsproteine, sondern bewältigt auch hohe Durchsatzzahlen, um die Bearbeitung von größeren Patientenkollektiven zeitnah zu gewährleisten. Dabei werden höchste Qualitätsstandards verwendet. Typischer Verlauf einer Standardkurve für humane IGF-Bindungsproteine.n Therapieverläufen nach einer medikamentösen Behandlung. 9

10 Publikationen Molecular, physiological, and motor performance defects in DMSXL mice carrying >1,000 CTG repeats from the human DM1 locus. Huguet A, Medja F, Nicole A, Vignaud A, Guiraud-Dogan C, Ferry A, Decostre V, Hogrel JY, Metzger F, Hoeflich A, Baraibar M, Gomes-Pereira M, Puymirat J, Bassez G, Furling D, Munnich A, Gourdon G. PLoS Genet Nov;8(11):e doi: /journal.pgen Epub 2012 Nov 29. Functional improvement in mouse models of familial amyotrophic lateral sclerosis by PEGylated insulin-like growth factor I treatment depends on disease severity. Saenger S, Holtmann B, Nilges MR, Schroeder S, Hoeflich A, Kletzl H, Spooren W, Ostrowitzki S, Hanania T, Sendtner M, Metzger F. Amyotroph Lateral Scler Sep;13(5): doi: / Therapeutic potential of PEGylated insulin-like growth factor I for skeletal muscle disease evaluated in two murine models of muscular dystrophy. Gehrig SM, van der Poel C, Hoeflich A, Naim T, Lynch GS, Metzger F. Growth Horm IGF Res Apr;22(2): Serum IGF-I is not a reliable pharmacodynamic marker of exogenous growth hormone activity in mice. Bielohuby M, Schaab M, Kummann M, Sawitzky M, Gebhardt R, Binder G, Frystyk J, Bjerre M, Hoeflich A, Kratzsch J, Bidlingmaier M. Endocrinology Dec;152(12): Separation of fast from slow anabolism by site-specific PEGylation of insulin-like growth factor I. Metzger F, Sajid W, Saenger S, Staudenmaier C, van der Poel C, Sobottka B, Schuler A, Sawitzky M, Poirier R, Tuerck D, Schick E, Schaubmar A, Hesse F, Amrein K, Loetscher H, Lynch GS, Hoeflich A, De Meyts P, Schoenfeld HJ. J Biol Chem Jun 3;286(22): Genome-wide search for loci controlling serum IGF binding protein levels of mice. Brockmann GA, Haley CS, Wolf E, Karle S, Kratzsch J, Renne U, Schwerin M, Hoeflich A. FASEB J Apr;15(6):

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12 Kontaktinformationen Leibniz-Institut für Nutztierbiologie Projektgruppe Ligandis Wilhelm-Stahl-Allee Dummerstorf Mecklenburg-Vorpommern Projektleitung Dr. Christine Höflich hoeflich.christine@fbn-dummerstorf.de