Epigenetik. Das Epigenomprojekt. Stephan Beck 1, Kurt Berlin 2, Florian Eckhardt 2

Transkript

1 Das Epigenomprojekt Stephan Beck 1, Kurt Berlin 2, Florian Eckhardt 2 Epigenetik 1) Wellcome Trust Sanger Institute, Genome Campus Hinxton, Cambridge, UK 2) Epigenomics AG, Berlin, Deutschland Zusammenfassung Das Genomprojekt hat den genetischen Code des menschlichen Erbguts entschlüsselt, aber gibt uns wenig Informationen darüber, wann und in welchem Zelltyp (Gewebe) welcher Teil des Codes benötigt wird. Offensichtlich werden verschiedene Gene in verschiedenen Zelltypen zur Aufrechterhaltung der spezifischen Funktionen benötigt. Die Kontrolle, wie eine Zelle ihr spezifisches genetisches Programm ausführt, unterliegt nach letzten Erkenntnissen weitgehend einer epigenetischen Regulation. Durch (umkehrbare) chemische Modifizierungen auf der DNAund Proteinebene wird das Genom auf eine Weise epigenetisch markiert, so dass die Zelle, aktive von inaktiven Genen unterscheiden kann. Auf diese Art kann das gleiche Genom in viele verschiedene Epigenome modifiziert werden, spezifisch entsprechend Zelltyp, Alter, Geschlecht und anderen Parametern. Obwohl viele der Details noch unklar sind, zweifeln heute nur noch wenige an der Existenz eines epigenetischen Codes (zusätzlich zum genetischen Code) und an dessen generellen Bedeutung für die biologische and medizinische Forschung, insbesondere für die Krebsforschung. Folglich ist die volle Entschlüsselung des epigenetischen Codes das letztendliche Ziel des hier beschriebenen Epigenomprojekts. Im Zusammenhang mit der schon erwähnten Plastizität kann erwartet werden, dass das Epigenom die bisher fehlende Verbindung zwischen Genetik, Krankheit und Umwelt herstellen wird. Schlüsselworte Epigenom, epigenetischer Code, Biomarker, Krebs Summary Although the genome project has deciphered the genetic code, it tells us little about when and in which cell type (tissue) which part of the actual code is required. Obviously, different genes are required in different cell types for the upkeep of specific functions. The control on how a cell carries out its genetic programme is increasingly believed to involve epigenetic regulation. Genomes are marked by (reversible) chemical modifications on the DNA and protein level in a way that allows the cell to distinguish between active and inactive genes. In this way, the same genome is modified into many different epigenomes, specific for cell type, age, gender, and other parameters. Although many of the details are still unclear, few people doubt these days the existence of an epigenetic code (in addition to the genetic code) and its importance for biological and medical research, cancer research in particular. The full elucidation of the epigenetic code is therefore the ultimate aim of the epigenome project described here. In the context of the already mentioned plasticity it can be expected that the epigenome will provide the so far missing link between genetics, disease and the environment. Keywords Epigenome, epigenetic code, biomarker, cancer Einleitung Die häufigste und stabilste Form der epigenetischen Markierung ist die Methylierung der Kohlenstoff-5-Position an Cytosinbasen von Cytosin- Guanosin-Dinukleotiden (CpGs). Eine schnell wachsende Anzahl anderer epigenetischer Markierungen ist auch an Proteinen gefunden worden, im Besonderen an Histonen, die an der Verpackung und Struktur des Chromatins beteiligt sind. Die genaue Bedeutung all dieser zum Teil kurzlebigen Markierungen ist jedoch weitgehend noch unbekannt, daher ist ihre Analyse im gegenwärtigen Epigenomprojekt nicht eingeschlossen und wird hier auch nicht weiter diskutiert (weiterführender Übersichtsartikel: Biel et al., 2005). Im Gegensatz dazu wurde die Methylierung von DNA schon vor über 50 Jahren beschrieben und die Entdeckung von CpG islands (Sequenzen reichhaltig an Cytosin-Guanosin-Dinukleotiden) offenbarte geeignete Zielsequenzen im Genom für Modelle der epigenetischen Modulation. Heute wissen wir, dass die DNA-Methylierung nicht nur eine wesentliche Rolle bei der Regulation der Genexpression und bei Phänomenen wie der Inaktivierung eines der beiden X-Chromosomen in weiblichen Säugern spielt, sondern auch bei der mütterlich/väterlich geprägten monoallelischen Genexpression (imprinting) und der Genomstabilität. Außerdem spielt sie eine wichtige Rolle bei der Ätiologie von vielen Krankheiten, besonders von Krebs. Diese Rolle wird schematisch durch Abbildung 1 veranschaulicht. Eine der vielen Ursachen der Krebsentstehung beruht auf 265

2 Abb 1 Vereinfachtes, schematisches Diagramm der Krebsentstehung durch Inaktivierung eines Tumor-Suppressor- Gens (TSG) durch Mutation oder Epimutation Gelbe Kugeln bedeuten Hypermethylierung und weisse Kugeln Hypomethylierung der TSG-Promotorregion. Der Blitz symbolisiert eine Stopcodon-Mutation, die zum einem verkürzten und daher funktionsunfähigen TSG-Genprodukt führt. Da menschliche Zellen diploid sind, können beide Mutationsarten in der gleichen Zelle vorkommen. der Inaktivierung von sogenannten Tumorsuppressorgenen (TSG). Ein solcher Phänotyp kann sowohl durch eine Mutation in der entsprechenden TSG-Sequenz als auch durch eine Epimutation (Methylierung) am TSG- Promotor induziert werden. Der erste Fall führt zu einem funktionsunfähigen Genprodukt und der zweite zur Unterdrückung der Transkription. Obwohl der resultierende Phänotyp (in diesem Fall Krebs) der gleiche für beide Mutationsarten ist, gibt es einen medizinisch relevanten Unterschied. Im Gegensatz zu Mutationen sind Epimutationen durch konventionelle Therapien wie Arzneimittel und vielleicht sogar Diät potenziell umkehrbar. Die Notwendigkeit, epigenetische Veränderungen (zusammen mit genetischen Veränderungen) im Krankheitskontext zu berücksichtigen, wird auch besonders deutlich durch den Befund von Krankheitsdiskordanz in Studien von eineiigen Zwillingen. Obwohl diese Zwillinge exakt identische Genome haben, entwickelt ein Zwilling die Krankheit, für die eine Diskordanz besteht (z.b. Schizophrenie), während der andere Zwilling keinerlei Krankheitssymptome zeigt. Bei der Schizophrenie handelt es sich um eine der ersten komplexen Krankheiten, für die schon frühzeitig erkannt wurde, dass auch nicht-genetische Faktoren eine wichtige Rolle spielen. Deshalb steht die Schizophrenie an prominenter Stelle für die Erforschung von Faktoren, die Krankheit, (Epi)genetik und Umwelt miteinander in Beziehung setzen (Petronis, 2004). Diesbezügliche Studien bestätigen die 266 Vermutung, dass epigenetische Veränderungen eine wesentliche Rolle bei der Ätiologie praktisch aller menschlicher Pathologien spielen. Aus diesem Grund wurde 1999 das Epigenomprojekt initiiert, mit dem Ziel, die Methylierung des menschlichen Genoms zu kartieren. Ein Aspekt des Epigenomprojekts, der in diesem Zusammenhang von besonderem (klinischem) Interesse ist, liegt in der Zielsetzung, epigenetische Biomarker zu identifizieren und zu validieren. Die Entwicklung solcher Biomarker soll maßgeblich dazu beitragen, die molekularen Grundlagen menschlicher Krankheiten besser zu verstehen und zu diagnostizieren. Die Entwicklung des Epigenomprojekts Bereitstellung von brauchbaren Methoden und Techniken Um neue epigenetische Biomarker und Mechanismen zu entdecken, sollten im Rahmen des Epigenomprojekts systematisch alle regulatorischen Sequenzen der DNA einer Methylierungsanalyse unterzogen werden, einer DNA, die aus gesunden wie auch aus ausgewählten erkrankten Gewebetypen, einschliesslich Krebsgewebe, isoliert wurde. In Anbetracht der Anzahl von Geweben, Promotoren und anderen regulatorischen Sequenzen war es offensichtlich, dass das Epigenomprojekt automatisierte Hochdurchsatztechnologie benötigte. Zur Messung des Methylierungsgrades an individuellen CpG- Positionen wurde die Bisulfit-Methode gewählt, die als Goldstandard der Methylierungsanalyse angesehen wird, jedoch noch nie in dieser Grössenordnung angewendet wurde. In Gegenwart von Bisulfit werden chemisch nichtmethylierte Cytosinbasen in Uracil (und Thymin nach PCR) umgewandelt, während methylierte Cytosine unversehrt bleiben. Auf diese Weise kann der Methylierungsgrad mittels automatischer DNA-Sequenziermaschinen als das Verhältnis der Cytosin- und Thyminsignale ermittelt werden. Die Entwicklung und Integration dieser Technologie, der dazugehörigen Bioinformatik und einer öffentlichen Datenbank waren die ersten Errungenschaften des Epigenomprojekts. Testung der Pipeline anhand der MHG-Region auf Chromosom 6p Das nächste Ziel bestand darin, die neue Pipeline in einer Pilotstudie zu testen and zu validieren. Dafür wurde die MHC (Major Histocompatibility Complex)-Region auf dem kurzen Arm von Chromosom 6 gewählt. Gene aus dieser Region sind mit mehr Krankheiten assoziiert als irgendeine andere Region des Genoms. Die Analyse umfasste 253 Zielsequenzen in Promotoren, Exons und Introns von insgesamt 90 MHC-Genen in 31 individuellen Proben aus 7 Geweben (Fett, Gehirn, Brust, Leber, Lunge, Muskel und Prostata). Insgesamt wurde die Methylierung an über 1.3x10 5 CpG-Positionen gemessen, was für eine gründliche statistische Auswertung angemessen ist. Das Ergebnis bestätigte eine Bimodalität für einen Großteil (~90%) der Methylie-

3 A B Abb 2 Die Datenbank des Epigenomprojekts ( integriert epigenetische Methylierungsdaten mit genetischen Daten des Genomprojekts Gezeigt sind in diesem Fall ungefähr 50 CpG Positionen (Säulen) für zwei Zielsequenzen (rot markiert) des BAT8-Gens, die in 31 Proben (Reihen) aus 7 Geweben (Reihengruppen, von oben nach unten: Fett, Gehirn, Brust, Leber, Lunge, Muskel, Prostata) untersucht wurden. Verschiedene Methylierungen zwischen den zwei Zielsequenzen (A, B) und Geweben, zum Beispiel der Leber (markiert durch Pfeil), sind deutlich erkennbar. Epigenetik rungsmuster, was auch schon in früheren Studien von Lorincz und Mitarbeitern beobachtet worden war [ Lorincz et al. (2002)]. Da gekoppelte, d.h. nahe beieinanderliegende, CpG- Positionen meistens den gleichen Methylierungsgrad haben, bedeutet dies, dass solche Regionen meistens entweder hyper-methyliert oder hypomethyliert sind. Nur etwa 10% der untersuchten Zielsequenzen zeigten ein gemischtes Methylierungsmuster von ~50% Methylierung und wurden daher weiter auf imprinting untersucht. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel der erzeugten Daten für eines der MHC-Gene wie sie in der öffentlichen Datenbank zugänglich sind. Erste Ansätze bei der Entwicklung von Biomarkern In Bezug auf die Entwicklung neuer Biomarker wurden die Daten insbesondere im Hinblick auf signifikante Zusammenhänge zur Gewebespezifität und Genexpression untersucht. Ungefähr 10% der 253 Zielsequenzen zeigten im Vergleich gewebespezifische Methylierungsmuster und erlaubten damit zahlreiche Möglichkeiten für die Entwicklung von neuen Biomarkern. Ebenfalls konnte im Vergleich mit unabhängigen Genexpressionsdaten eine positive Korrelation zwischen Methylierung und Genaktivität demonstriert werden. Hypomethylierte Promotorsequenzen (2 kb upstream bis 0.5 kb downstream von ATG-Startcodon) korrelierten gut mit aktiven Genen und hypermethylierte Promotorsequenzen mit inaktiven Genen. Für Zielsequenzen, die außerhalb der oben definierten Promotorregion lagen, ergab sich keine Korrelation. Das Ergebnis dieser Analyse identifiziert Promotorregionen als primäre, aber sicher nicht als alleinige Zielsequenzen für die Entwicklung von methylierungsspezifischen Genexpressionsbiomarkern. Methylierungsanalyse von über 5000 Zielsequenzen auf vier Chromosomen (6, 13, 20 und 22) Nach der erfolgreichen Beendigung der Pilotstudie konzentriert sich das Epigenomprojekt nun auf die Methylierungsanalyse von über 5000 Zielsequenzen auf vier Chromosomen (6, 13, 20 und 22). Dieser Schritt erforderte eine 20-fache Erhöhung der Analysekapazität und die Implementierung zusätzlicher Parameter in das Studiendesign. Das erweiterte Design wird unter anderem die Analyse von alters- und geschlechtsabhängigen Effekten ermöglichen, welche in der Epigenetik eine massgebliche Rolle spielen können. Im Gegensatz zum Genomprojekt ist das Epigenomprojekt ein gutes Beispiel einer öffentlich-privaten Zusammenarbeit. Die Projektstruktur erlaubt es, die Kernkompetenzen der gegenwärtigen Partner, nämlich des Wellcome Trust Sanger Institutes (Hinxton, Großbritannien) und der Epigenomics AG (Berlin, Deutschland) in effizienter Weise zu nutzen. Die Epigenomics AG führt hierbei alle Arbeitsgänge vor der eigentlichen Bisulfitsequenzierung durch, wie beispielsweise die DNA-Bisulfitierung oder die PCR-Amplifikation. Für die anschließende Bisulfitsequenzierung nutzt das Sanger Institut seine, während des Humangenom-Projektes etablierte, Hochdurchsatz-Sequenzierpipeline. Alle PCR- und Sequenzierungsprozesse werden sowohl am Sanger Institut als auch bei der Epigenomics AG mit Barcodes kodiert und mit Hilfe eines Laborinformationssystems (LIMS) überwacht. Die Schnittstelle zwischen der Epigenomics AG und dem Sanger Institut, über welche sowohl die experimentellen PCR-Reaktionen als auch alle notwendigen Bio- Informationen (z.b. experimentelle Informationen) ausgetauscht werden, erlauben aufgrund ihrer offenen Architektur in Zukunft auch weitere Partner in dieses Konsortium aufzunehmen. Die nächste große Herausforderung für das Epigenomprojekt wird darin bestehen, auch die verbleibenden epigenetischen Markierungen (zum Beispiel die Histonmarkierungen) zu kartieren, um, zusammen mit der DNA-Methylierung, den vollständigen epigenetischen Code entschlüsseln zu können. Klinische Anwendungen Neben der Rolle für die Grundlagenforschung werden die im Epigenomprojekt gewonnenen Forschungsergebnisse zur Entwicklung neuer diagnostischer und pharmakodiagnostischer Methylierungsbiomarker beitragen. Veränderungen im Methylierungsmuster bestimmter Gene können sehr früh in der Entstehung von Krankheiten beobachtet werden und in einigen Fällen konnte bereits ein kausaler Zusammenhang zwischen der veränderten Methylierung im Promotor eines Gens und der Pathoge- 267

4 Abb 3 Ergebnisse der Methylierungsmessungen von mehreren CpG-Positionen in insgesamt 12 Genen Farbliche Darstellung von Microarray-Daten, die die Hypermethylierung (rot) bzw. Hypomethylierung (grün) an jeder CpG-Position darstellen. Jede Säule entspricht einer Patientenprobe, jede Zeile einer CpG-Position. X-Achse A E, negative Kontrollen; F G, Darmkrebsproben. Y-Achse Gene 1 12 A Dickdarmgewebe, gesund B Dickdarmgewebe, entzündet C verschiedene Tumore (non colon) D periphäre Blutlymphozyten E anderes Gewebe, normal F Dickdarm, Polypen G Dickdarmkarzinom A B C D E F G nese gezeigt werden. So wird bei einer Reihe von Krebserkrankungen ein Allel eines Tumorsuppressorgens durch Methylierung inaktiviert, während das zweite Allel durch andere Mechanismen, wie beispielsweise Punktmutationen oder den Verlust einer gesamten chromosomalen Region, inaktiviert wird. Diese Methylierungsänderungen können zur molekularen Diagnostik zahlreicher Krankheiten, allen voran verschiedener Krebsarten, genutzt werden. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse einer methylierungsspezifischen Oligochiphybridisierung von 12 unterschiedlichen Genen in 7 unterschiedlichen Geweben. Der Methylierungszustand, erkennbar am farblichen Muster, ermöglicht eine Unterscheidung sowohl zwischen gesundem und Tumorgewebe des Dickdarms als auch zwischen Dickdarmkrebs und anderen Krebsarten. Andere Methylierungsmarker sind mit dem Ansprechen von Tumoren auf bestimmte Arzneimittel assoziiert. Dieses Phänomen nutzt man bei der Pharmakodiagnostik, in dem man versucht, durch Analyse des spezifischen DNA-Methylierungmusters eines Patienten die Wirkung (und Nebenwirkungen) eines Medikamentes vorherzusagen. 268 Das Epigenomprojekt wird zum einen die Anzahl der verfügbaren Methylierungsbiomarker vergrößern, zum anderen wird dieses Projekt dazu beitragen, die biologische Funktion differentiell methylierter Genomloci besser zu verstehen. Eine Reihe von Untersuchungen zeigt nämlich, dass die biologische Funktion der Methylierung nicht nur auf die Promotor-regulierte Expressionskontrolle beschränkt ist, sondern auch wesentliche Funktionen bei der Chromatinkondensation sowie bei der funktionellen Isolation einzelner chromosomaler Abschnitte besitzt. Im Epigenomprojekt werden daher nicht nur die Promotorregionen aller Gene, welche einer Bisulfit-Sequenzanalyse zugänglich sind, untersucht, sondern auch weitere genomische Loci mit regulatorischem Potential wie z. B. Bindungssequenzen von DNA-bindenden Proteinen. Hierdurch können Methylierungsmarker identifiziert werden, die eine biologische Funktion besitzen, bei denen jedoch keine einfache Korrelation der RNA-Expression mit der Promotormethylierung existiert. Die systematische Analyse der Methylierungsprofile der im Epigenomprojekt untersuchten gesunden und kranken Gewebetypen wird zeigen, ob im pathogenen Zustand gerade diejenigen Gene unterschiedlich methyliert sind, die auch in unterschiedlichen Entwicklungs- oder Differenzierungsstadien eine differentielle Methylierung aufweisen. Wie das folgende Beispiel zeigt, können mit Hilfe von Methylierungsbiomarkern pharmakodiagnostische Fragen beantwortet werden. Ziel des hier vorgestellten Tests ist es, eine Vorhersage zu treffen, ob eine Brustkrebspatientin nach der operativen Entfernung des Primärtumors durch eine hormonelle Therapie ausreichend behandelt ist, oder ob zusätzlich eine Chemotherapie veranlasst werden soll. Nach den derzeit gültigen Behandlungsrichtlinien wird allen Frauen, welche einen positiven Hormonrezeptorstatus haben und deren Lymphknoten noch nicht befallen sind, sowohl eine Chemotherapie als auch eine hormonelle Therapie empfohlen. Allerdings könnte einem großen Teil der Patientinnen die zusätzliche, aggressive Chemotherapie erspart bleiben, da diese unter einer ausschließlich endokrinen Therapie keine weiteren Tumore bilden. Ziel dieses Tests wird es sein, jene Frauen zu identifizieren, die mit einer endokrinen Therapie ausreichend therapiert sind und die von einer zusätzlichen Chemotherapie nicht wesentlich profitieren werden. Mehreren Arbeitsgruppen gelang es Methylierungsbiomarker zu identifizieren, die es erlauben, Patientinnen hinsichtlich ihrer Prognose zu klassifizieren [Maier et. al. (2004), Widschwendter et al. (2004)]. In einer Studie wurde das Methylierungsmuster von ca. 120 Kandidatengenen bei über 100 Brustkrebsproben untersucht [Maier et. al. (2004)]. Die verwendeten Proben wurden in den 90er Jahren von Patientinnen entnommen, welche nur mit der damals üblichen Tamoxifen-Therapie (ohne Chemotherapie) behandelt wurden. Das Ergebnis zeigte, dass die Messung des Methylierungsgrades eines Gens ausreichte, um eine Gruppe von Patientinnen mit sehr guter Prognose zu identifizieren. Der Marker beinhaltet Informationen über das Rückfallrisiko, welche unabhängig sind von Lymphknotenbefall oder Tumorgröße, d.h. durch die Methylierungsmessung werden wertvolle zusätzliche Informationen gewonnen. In einer weiteren,

5 unabhängigen Studie konnte die signifikante Korrelation dieses Methylierungsbiomarkers anhand des klinischen Verlaufs bestätigt werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass es mit Hilfe der Methylierungsanalyse eines einzigen Gens möglich ist, den Krankheitsverlauf von Tamoxifen-behandelten Brustkrebspatientinnen ausreichend sicher vorherzusagen und Patientinnen zu identifizieren, welche durch Tamoxifen ausreichend behandelt worden sind und denen eine zusätzliche Chemotherapie erspart werden kann. Szyf M. DNA methylation and demethylation as targets for anticancer therapy. Biochemistry (Mosc) May;70(5): Widschwendter M, Siegmund KD, Muller HM, Fiegl H, Marth C, Muller-Holzner E, Jones PA, Laird PW. Association of breast cancer DNA methylation profiles with hormone receptor status and response to tamoxifen. Cancer Res Jun 1;64(11): Korrespondenzadresse Stephan Beck, PhD Immunogenomics Laboratory Wellcome Trust Sanger Institute Genome Campus Hinxton, Cambridge CB10 1SA, UK Tel Fax Danksagung F.E. bedankt sich bei R.Wasserkort und C. Lofton-Day für zahlreiche Diskussionen. Literatur Beck S, Olek A (eds). The Epigenome: Molecular Hide and Seek. Wiley-VCH Publisher 2003, ISBN Biel M, Wascholowski V, Giannis A. Epigenetik - ein Epizentrum der Genregulation: Histone und histonmodifizierende Enzyme. Angewandte Chemie : Eckhardt F, Beck S, Gut IG, Berlin K. Future potential of the Human Epigenome Project. Expert Rev Mol Diagn Sep;4(5): Holliday R. DNA methylation and epigenotypes. Biochemistry (Mosc) (5): Lorincz MC, Schubeler D, Hutchinson SR, Dikkerson DR, Groudine M. DNA methylation density influences the stability of an epigenetic imprint and Dnmt3a/b-independent de novo methylation. Mol Cell Biol : Maier S, Nimmrich I, Marx A, Eppenberger- Castori S, Jaenicke F, Paradiso A, Spyratos F, Foekens J, Schmitt M, Harbeck N. DNA methylation profile predicts risk of recurrence in tamoxifen-treated, node-negative breast cancer patients. Journal of Clinical Oncology 2004 ASCO Annual Meeting Proceedings 2004 July:525 (14S). Murrell A, Rakyan VK, Beck S. From genome to epigenome. Hum Mol Genet Apr 15;14 Spec No 1:R3-R10. Petronis A. The origin of schizophrenia: genetic thesis, epigenetic antithesis, and resolving synthesis. Biol Psychiatry May 15;55(10): Rakyan VK, Hildmann T, Novik KL, Lewin J, Tost J, Cox AV, Andrews TD, Howe KL, Otto T, Olek A, Fischer J, Gut IG, Berlin K, Beck S. DNA methylation profiling of the human major histocompatibility complex: a pilot study for the human epigenome project. PLoS Biol Dec;2 (12): e