Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 2. Material 3. Methoden

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1 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1.1 Die Rolle der Abscisinsäure bei der Regulation der Stomatabewegung und der Genexpression Expression von Antikörpern und Antikörperfragmenten in Pflanzen Immunmodulation der Abscisinsäureaktivität in transgenen Tabakpflanzen "High-throughput"-Methoden zur Analyse der differentiellen Genexpression Offene Systeme zur Untersuchung der differentiellen Genexpression DNA-"Arrays" Zielstellung der Arbeit Material 2.1 Pflanzenmaterial Bakterienstämme und Phagen Vektoren und Primer Enzyme Pflanzenhormone und Antibiotika Antikörper und Konjugate DNA- und Proteinmarker Weitere Chemikalien und Kits Medien Puffer und weitere Lösungen Geräte und Software Spezielle Materialien Methoden 3.1 Normalisierung von anti-aba-scfv transgenen Pflanzen durch Behandlung mit Abscisinsäure Anzucht der Pflanzen und Behandlung mit Abscisinsäure Biochemische und physiologische Untersuchungen Nachweis des scfv-proteins mittels "Western blot" Bestimmung des Gesamt-ABA-Gehaltes Berechnung der theoretisch freien ABA 21

2 Gaswechselmessungen Molekularbiologische Standardprozeduren Cosmidbank TLC Isolation hochmolekularer genomischer DNA Herstellung und erste Charakterisierung der Cosmidbank Ordnen der Cosmidbank durch "Picking" und "Spotting" Prozessierung der Koloniefilter (Cosmide und Plasmide) Präparation der komplexen cdna Präparation epidermaler Fragmente GTC-RNA-Extraktion Reinigung der mrna Synthese der komplexen cdna Stomata cdna-bank TStP Herstellung der Stomata cdna-bank TStP Ordnen der cdna-bank durch "Picking" und "Spotting" cdna-plasmid-"arrays" für die "reversed Northern"-Analyse Hybridisierungen und Auswertung Hybridisierung der Kolonie- und Plasmid-Filter mit radioaktiv markierten Sonden Hybridisierung von Plasmidfiltern mit nichtradioaktiv markierten Sonden Qualitative und quantitative Auswertung der Images Ergebnisse 4.1 Normalisierung der anti-aba scfv transgenen Tabakpflanzen Die externe, langfristige Gabe von 50 µm ABA normalisiert den spezifischen Phänotyp der RA-Pflanzen Erstes Komplementationsexperiment Zweites Komplementationsexperiment Kurzzeitbehandlung der transgenen Pflanzen durch ABA-Gabe über die Blattstiele führt nicht zu einer Normalisierung Bei langzeitbehandelten RA-Pflanzen kann der Stomataschluß durch ABA-Gabe über die Blattstiele wieder induziert werden 41

3 4.1.4 In wasser- und ABA-behandelten RA-Pflanzen kann nahezu die gesamte Abscisinsäure vom Antikörper gebunden werden Molekulare Charakterisierung der anti-aba immunglobulintransgenen Tabakpflanzen Herstellung und erste Charakterisierung der Cosmidbank TLC Organellengenome und chromosomale rrna-gene in der Cosmidbank Komplexe Analyse der Genexpression in Wildtyp- und RA-Pflanzen mit Hilfe der Cosmidbank Charakterisierung des Expressionsmusters im Blatt Charakterisierung des Expressionsmusters in den epidermalen Fragmenten Herstellung und erste Charakterisierung der schließzellspezifischen cdna-bank Charakterisierung der geordneten schließzellspezifischen cdna-bank TStP Nutzung der geordneten cdna-bank TStP zur Identifizierung interessanter Cosmidklone und häufiger Transkripte in der cdna-bank Sequenzanalyse von 281 zufällig ausgewählten cdna-klonen der schließzellspezifischen cdna-bank Komplexe Analyse der Genexpression in Schließzellen von RA- und Wildtyppflanzen mittels der geordneten schließzellspezifischen cdna-bank Vergleich der Genexpression in Schließzellen und Blatt mittels der schließzellspezifischen cdna-bank Untersuchung des Einflusses der Langzeitbehandlung mit ABA auf die Genexpression in Schließzellen mit Hilfe der geordneten cdna-bank Die Morphologie der Schließzellen ist in den RA-Pflanzen verändert Diskussion 5.1 RA-Pflanzen weisen einen spezifischen, morphologisch und physiologisch veränderten Phänotyp auf Die Behinderung des Stomataschlusses in den RA-Pflanzen ist auf die Wirkung des anti-aba-einzelkettenantikörpers zurückzuführen Mechanismen der Modulation von ABA-Wirkungen durch das anti-aba scfv-protein In Hybridisierungsstudien mit radioaktiv markierten komplexen Proben können häufige und mittelhäufige Transkripte untersucht werden 89

4 5.5 Die durch Immunmodulation und Normalisierung erzielten Effekte lassen sich auf Transkriptionsebene in den voll entwickelten Pflanzen nicht erfassen Abscisinsäure ist für die Entwicklung funktionsfähiger Schließzellen notwendig Zusammenfassung Literaturverzeichnis 97

5 Abkürzungen ABA cis, trans-abscisinsäure Abb. Abbildung ADP Adenosindiphosphat Ai ABA-induzierbarer Klon Amp r Ampicillinresistenz ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin c a Cab CaMV cdna CIAP cfu Da DIG DK DTT DEPC DNA Kohlendioxidkonzentration Chlorophyll a/b-bindendes Protein "cauliflower mosaic virus", Blumenkohl-Mosaik-Virus "complementary" DNA, komplementäre DNA "calf intestinal alkaline phosphatase", alkalische Phosphatase "colony forming units", koloniebildende Einheiten Dalton Digoxigenin differentieller Klon Dithiothreitol Diethylpyrocarbonat Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ER endoplasmatisches Retikulum EST "expressed sequence tag" g Gramm, Erdbeschleunigung g L I KDEL LK M µ mikro MB Megabyte stomatäre Leitfähigkeit Lichtintensität Lysin-Asparaginsäure-Glutaminsäure-Leucin-Peptid Leitklon Molarität

6 min mrna MMLV n OD PBS PCR pfu RNA rpm rrna Rubisco scfv SDS Tab. T-DNA TEMED Tet r TLC Tris t-rna TSP TStP UE V V H V L Wo. YAC Minute "messenger", Boten-Ribonukleinsäure "Moloney Murine Leukemia Virus" nano optische Dichte "phosphate-buffered saline", phosphatgepufferte Kochsalzlösung "polymerase chain reaction", Polymerasekettenreaktion "plaque forming units", plaquebildende Einheiten Ribonukleinsäure Umdrehungen pro Minute ribosomale Ribonukleinsäure Ribulose-1,5-biphosphatcarboxylase "single chain variable fragment", Einzelkettenantikörper "sodium dodecyl sulfate", Natriumdodecylsulfat Tabelle Transfer-DNA N, N, N', N'-Tetramethylendiamin Tetracyclinresistenz "tobacco leaf cosmids", Tabakblatt-Cosmide (genomische Bank) Tris- hydroxymethylaminomethan Transfer-Ribonukleinsäure "total soluble protein", gesamtlösliches Protein "tobacco stomata phagemide", schließzellspezifische cdna-bank aus Tabak Untereinheit Volumen, Volumina bzw. Volt variabler Teil der schweren Antikörperkette variabler Teil der leichten Antikörperkette Woche "yeast artificial chromosome", künstliches Hefechromosom