Hämoglobinbestimmung

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1 Hämoglobinbestimmung TEAS Themen Erythrozyten, Photometrie, Hämoglobin, Cyanhämoglobin, Oxyhämoglobin, Carboxyhämoglobin, Methämoglobin, Anämie. Prinzip Eine quantitative Hämoglobinbestimmung ist unerlässlich, um Anämien zu diagnostizieren. Dafür bestimmt man den Hämoglobingehalt in einem bestimmten Blutvolumen. In diesem Versuch wird dazu die Cyanmethämoglobin-Methode verwendet. Die Konzentration des Hämoglobins (Hb) im Vollblut wird nach Umwandlung in das stabile Cyanhämiglobin bestimmt. Cyanhämiglobin zeigt bei 540 nm eine für die Hämoglobinbestimmung geeignete Absorptionsbande. Material Studenten-Basis-Set 1 Mikroliterpipette µl Messpipette 10 ml, Teilung 0,1 ml Pipettierball Reagenzglas, d = 16 mm, l = 160 mm, Stück 1 Reagenzglasgestell Pipettenspitzen μl im Halter, 96 1 Stk Einweghandschuhe, M, Latex, 100 Stk Halbmikro-Küvetten Küvettenständer Einweg-Rührspatel, 500 Stk Becher, PP, 100 ml Laborausstattungs-Set 1 Photometer Chemikalien 1 Transformationslösung Reagenzien und n Hinweis: Die für diesen Versuch verwendeten Reagenzien und n sind im Anhang aufgelistet. Achtung! Die Transformationslösung enthält Cyanidverbindungen. Aktuelle Hinweise zu Risiken, Gefahren und Vorsichtsmaßnahmen entnehmen Sie dem Sicherheitsdatenblatt aus der Reagenzpackung. Beachten Sie stets die Vorbemerkungen, wenn Sie diesen Versuch durchführen. Abb. 1: P P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 1

2 TEAS Hämoglobinbestimmung Aufgabe Bestimmen Sie die Hämoglobinkonzentration einer Probe nach der Cyanmethämoglobin-Methode Durchführung Untersuchungsmaterial EDTA-Blut nach venöser Entnahme siehe dort. Vorgehen In ein beschriftetes Reagenzglas werden gemäß dem folgenden Pipetierschema 5 ml der Transformationslösung pipettiert, dann 20 µl Kontroll- bzw. Patientenprobe dazu pipettiert (Bild 2). Den Ansatz gut mischen und 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Pipettierschema 1 Reagenzienleerwert 3 Patientenprobe Transformationslösung Patientenprobe 2 5 ml 5 ml 5 ml 20 µl 20 µl Abb. 2: Pipettieren der Lösungen - Nach der Inkubationszeit Proben alle Ansätze in jeweils eine Küvette überführen - Reagenzienleerwert bestimmen: Küvette mit Probe 1, also nur Transformationslösung, in das Photometer stellen: Taste R drücken - dann die Extinktion der Kontrolle und der Probe (E P ) messen: Die entsprechende Küvette in die Messzelle stellen: Taste T drücken, Extinktion ablesen (Bild 3) Grundlagen Zur Diagnostik und Verlaufskontrolle von Anämien ist es unerlässlich, quantitative Hämoglobinbestimmungen durchzuführen. Dabei wird der Hämoglobingehalt in einem bestimmten Blutvolumen gemessen. Abb. 3: Ablesen der Extinktion Hämoglobinkonzentrationen unter 12 g/dl bei Frauen und 15.7 g/dl bei Männern kennzeichnen eine Anämie. Um die im Blut nebeneinander vorliegenden Hämoglobinverbindungen wie Hämoglobin (HbII), Oxyhämoglobin HbII-O 2 ), Hämiglobin (HbIII), eventuell auch Carboxyhämoglobin (HbII-CO) gemeinsam als Gesamthämoglobin photometrisch erfassen zu können, wird zunächst das gesamte Hämoglobin mit Kaliumhexacyanoferrat zu Methämoglobin oxidiert. Dieses reagiert mit Kaliumcyanid unter Bildung des stabilen Cyanhämoglobin-Komplexes, der ein breites und unkritisches Absorptionsmaximum bei 546 nm 2 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

3 Hämoglobinbestimmung TEAS besitzt. Die Extinktion ist dem Hämoglobingehalt des Blutes direkt proportional. Auswertung Da bei dieser Methode das Lambert-Beersche Gesetz Anwendung findet, wird die Konzentration direkt und ohne Standard mit der Extinktion un dem Faktor 36,8 berechnet. Der Faktor errechnet sich aus der Verdünnung der Probe und dem molaren Extinktionskoeffizienten. c Hb [g dl] = E Probe 36.8 Mit c Hb = Hämoglobinkonzentration und E= Extinktion. Nach den Richtlinien der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen soll die Abweichung vom vorgegebenen Sollwert des Kontrollergebnisses bei dieser Bestimmung nicht mehr als 4% betragen. Referenzwerte Die Hämoglobinkonzentration beträgt bei Männern im Durchschnitt zwischen 13.3 und 17.7 g/dl, bei Frauen zwischen 1.7 und 15.7 g/dl. Achtung: Die angegebenen Normalwerte beziehen sich auf die westeuropäische Bevölkerung! Hinweis Die Bestimmung des MCV-, MCH- und MCHC-Wertes sowie die Details zum kleinen Blutbild sind im Anhang von P erklärt. Fragen: - Was ist Methämoglobin? Oxidierstes Hämoglobin mit Eisen in der Oxidationsstufe +3 (Fe 3+ ) statt Welche Substanzen werden mit dieser Methode erfasst? Oxyhämoglobin, Methämoglobin (Hämiglobin) und das carboxilierte Hämoglobin - Nennen Sie Beispiele für angeborene und erworbene Anämien! erworben Verlustanämie: Akuter oder chronischer Blutverlust Eisenmangelanämie: Unzureichende Eisenzufuhr, erhöhter Eisenbedarf oder verlust, häufig, leicht zu behandeln Megaloblastische Anämie: Vitamin B12- und Folsäure-Mangel Aplastische Anämie: Knochenmarkschädigung, z.b. nach Chemotherapie angeboren Sichelzellanämie: Aminosäure-Austausch in Hämoglobin infolge Punktmutation im entsprechenden Gen Thalassämie: Kettenmangel Favismus: Mangel an Glucose-6-P-Dehydrogenase P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 3

4 TEAS Hämoglobinbestimmung 4 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

5 Hämoglobinbestimmung TEAS Protokoll Sie können Ihre Ergebnisse hier eintragen Extinktion c Hb [g/dl] Patientenprobe Fragen - Was ist Methämoglobin? - Welche Substanzen werden mit dieser Methode erfasst? - Nennen Sie Beispiele für angeborene und erworbene Anämien! P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 5

6 TEAS Hämoglobinbestimmung 6 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

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