Bestimmung von Plasma-Cholesterin und Triglycerid-Spiegel

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1 Plasma-Lipoproteine und -Fette Bestimmung von Plasma-Cholesterin und Triglycerid-Spiegel Charakteristisch für Lipide sind eine niedrige Polarität und eine begrenzte Wasserlöslichkeit. Ihre Plasmakonzentration beträgt ca mg/100 ml. Sie sind dabei an ihre jeweils spezifischen Plasmatransportproteine gebunden. Lipoproteine werden aufgrund ihrer elektrophoretischen Eigenschaften in α (HDL), prä-β-(vldl) und β (LDL) und Chylomikronen unterteilt. Die Lipidkomponenten von Lipoproteine sind (i) Cholesterin (ungefähr 70% des Cholesterins liegt als Cholesterinester mit ungesättigten Fettsäuren vor, (ii) Triacylglycerole und (iii) Phospholipide. Fette werden im Blut in Form von Lipoproteine transportiert. Diese enthalten einen Kern aus Fetten (Triacylglycerole, Cholesterin und endogenen Lipide), der umhüllt ist von einer Schicht aus polaren Lipiden und poproteinen. Lipoproteine haben zwei Hauptfunktionen: (i) Solubilisation, das heißt, dass die ansonsten im Blut nicht lösbaren Fette mit Hilfe der Lipoproteine lösbar gemacht werden und (ii) Regulation des Lipidtransports in spezifische Zielzellen und Gewebe hinein und auch hinaus. Das Cholesterin (C7 H46, MG: ) ist ein amphipatisches Lipid, Komponente der Plasmalipoproteine und strukturelle Komponente der Plasmamembran der Zellen. Etwa die Hälfte des Cholesterins in unserem Körper wird selbst produziert, die andere Hälfte wird durch die Nahrung aufgenommen und resorbiert. Ein Teil des Cholesterins wird in die Gallenflüssigkeit ausgeschieden. Die Umwandlung von Cholesterin zu Gallensalz hilft, Fette zu lösen und zu verdauen. Der Transport von Cholesterin in VLDL zu den Geweben spielt eine wichtige Rolle bei der Membranbildung von Zellen und bei der Biosynthese von Steroidhormonen. Das usmaß der Biosyntheserate von endogenem Cholesterin hängt von der Wechselwirkung mit dem Cholesterin, welches durch die Nahrung aufgenommen wird, ab. Exogenes (über die Nahrung aufgenommenes) Fett wird im Darm hydrolysiert, absorbiert und dann in den Darm-Mukosazellen wieder synthetisiert. Die Lipide werden als Chylomikronen transportiert. Endogene Triglyceride werden in der Leber und in den Fettgewebezellen produziert und als VLDL transportiert. Statistische uswertungen zeigen ein nsteigen von Herz- und vaskulären Erkrankungen. Es gibt eine Beziehung zwischen der Erhöhung von einigen Plasmafettkomponenten und therosklerose. Hyper- und Dyslipoproteinämie spielen eine wichtige Rolle als Risikofaktor. Die Daten zeigen, dass (i) man bei 70% der Patienten mit arteriellen Verschlüssen eine Hyperlipoproteinämie findet, (ii) die Lipide, die man im Bindegewebe der rterienwände findet, stammen vom Plasmalipoproteinen, (iii) ca. 70% der Patienten, die eine primäre Hyperlipoproteinämie haben, leiden an Koronarsklerose und /oder Myokardinfarkten und (iv) es besteht eine Korrelation zwischen der Häufigkeit myokardialer Infarkte und der Reduktion der Plasmalipide unter Therapie der Hyperlipoproteinämie bzw. > 300 mg/ml Cholesterin konnten bestimmt werden bei 60% bzw. 5% der Patienten, die an einem Herzinfarkt starben. Zur Prognosebestimmung bezüglich eines Herzinfarktes bedarf es der Bestimmung von HDL- und LDL-Cholesterin. Je niedriger der HDL-Cholesterin-Spiegel ist, desto höher ist das Herzinfarktrisiko. Die

2 Bestimmung des HDL-Cholesterins ist wichtig für Patienten sowohl mit Hypercholesterinämie wie auch mit Hypertriglyceridämie. Bei erhöhten Triglycerid- Spiegeln und gleichzeitig erniedrigtem HDL-Cholesterin besteht ein hohes koronares Risiko. Normal Grenzbereich Bedenklich Normal Grenzbereich Bedenklich Gesamtcholesterin < > 40 < 5,16 5,17-6,0 > 6, Triglyceriden < > 00 < 1,70 1,70-,6 >,7 LDL-Cholesterin < > 190 <,57,58-4,8 >4,9 HDL-Cholesterin < <40 > 1,55 1,55-1,03 <1,03 [mg/dl) [mmol/l) Tabelle 1 zeigt den Zusammenhang zwischen Lipiden und Lipoproteinen sowie dem atherosklerotischen Risiko

3 Über der Bestimmung des Cholesterins, Cholesterinesters und Triglyceride Es soll die Konzentration von Gesamtcholesterin, HDL-Cholesterin und Triglyceriden bei normalen und kranken Personen bestimmt werden. Die Bestimmung der Gesamtcholesterin-konzentration im Serum Reaktionsprinzip Cholesterin-esterase Cholesterinester H Cholesterin Fettsäure Cholesterin H Cholesterinxidase Cholest 4 en 3 - on 4 H + phenol + amino antipyrin Peroxidase Quinoneimin + H Cholesterinester werden mit Hilfe von Cholesterin-esterasen in freies Cholesterin und Fettsäuren gespalten. Cholesterin wird mit Sauerstoff und Cholesterinoxidase zu Cholest- 4-en-3-on oxidiert. Das dabei entstandene Wasserstoffperoxyd bildet mit 4-mino-4- antipyrin und Phenol, katalysiert durch Peroxidase einen roten Farbstoff. Die bsorption bei 546 nm ist der Cholesterinkonzentration proportional. Lösungen / (Gesamt-Cholesterin) Reagenz Reagenz B Serum 50 mmol/l PIPES buffer ph = 6.9; 4 mmol/l phenol; 50 U/l cholesterol esterase; 50 U/l cholesterol oxidase; 1000 U/l peroxidase; 0.5 mmol/l amino 4-antipyrin;.5 mmol/l NaCl Cholesterin-Lösung; (5.17 mmol/l = 00 mg/100 ml) Blut 1 (Normal Bereich) Blut (Pathologischer Bereich) Reagenz 1000 l 1000 l 1000 l 1000 l Reagenz B (St. 5,17 mmol/l Chol) - 0 l - - Blut l - Blut l H 0 l Cholesterin n = 5.17 mmol/l, n = 00 mg/100 ml, n = g/l

4 Die Bestimmung der HDL-Cholesterin-konzentration im Serum Nachweis von HDL Cholesterin im Blut Chol.-HDL Fällungsreagenz 500 l 500 l Blut 1 50 l Blut 50 l Zentrifugierung: RPM 10 Min. Die VLDL- und LDL-Fraktion fällt im Beisein von Ca, Mg und Mn-Ionen und Polyanionen/sulfatierten Polyanionen (Chol.-HDL Fällungsreagenz) aus. Nach dem Zentrifugieren soll der HDL-Cholesterin-nteil aus dem Überstand bestimmt werden. Lösungen / (Gesamt-Cholesterin) Reagenz Reagenz C Serum 50 mmol/l PIPES buffer ph = 6.9; 4 mmol/l phenol; 50 U/l cholesterol esterase; 50 U/l cholesterol oxidase; 1000 U/l peroxidase; 0.5 mmol/l amino 4-antipyrin;.5 mmol/l NaCl HDL-Cholesterin-Lösung; (1,30 mmol/l = 50 mg/100 ml) Blut 1 (Normal Bereich) Blut (Pathologischer Bereich) Reagenz 1000 l 1000 l 1000 l 1000 l Reagenz C (St. 1.3 mmol/l HDL-Chol) - 0 l - - Überstand / Blut l - Überstand / Blut l H 0 l Cholesterin n = 1,30 mmol/l, n = 50 mg/100 ml

5 Die Bestimmung der Triglycerid-konzentration im Serum Reaktionsprinzip Lipoprotein-Lipase Triglyceride Fettsäuren Glycerin Glycerin kinase Glycerin TP Glycerin 3 Phosphate DP Glycerin Phosphate H Glycerin-3-Phosphate xidase Dihydroxi - cetonphosphate H Peroxidase mino 4 antipyrine ESPS rote Chinonederivative 4 H Mit Hilfe einer speziellen Lipase werden Triglyceride enzymatisch zu Glycerin und freien Fettsäuren hydrolysiert. Das Glycerin wird entsprechend folgendem Reaktionsschema weiter umgesetzt. Das gebildete Chinonderivative ist der Triglycerid - Konzentration proportional. Lösungen / (Triglyceride) Reagenz D Reagenz E Serum 50 mmol/l PIPES buffer ph = 7.5; 1 mmol/l N ethyl N sulfopropyl m anizidine (ESPS); 1100 U/l lipoprotein lipase; 800 U/l glycerol kinase; 3000 U/l glycerolphosphate oxidase; 350 U/l peroxidase; 0.7 mmol/l 4 amino antipyrine; 0.3 mmol/l TP Lösung (TG.8 mmol/l = 00 mg/100 ml) Blut 1 (Normal Bereich) Blut (Pathologischer Bereich) Reagenz D 1000 l 1000 l 1000 l 1000 l Reagenz E (St.,8 mmol/l TG) - 0 l - - Blut l - Blut l H 0 l Triglyceride n =,8 mmol/l, n = 00 mg/100 ml, n = g/l Formel für der [LDL-Cholesterin] nach Friedewald lautet [LDL-Cholesterin] = [Gesamt-Cholesterin] (HDL + [Triglyceride / 5]) Fragen 1) Erkläre die erhobenen Daten der Probe krank (Triglyceride, Gesamtcholesterin, HDL-Cholesterin und LDL-Cholesterin). ) Wie kann der Fettanteil des hyperlipoproteinämischen Plasmas verringert werden?