7 HORMONE / VITAMINE. 7.1 Nachweis der Insulinwirkung im Blut
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- Benedikt Eberhardt
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1 7 HORMONE / VITAMINE Das Peptidhrmn Insulin wird in den β-zellen der Langerhans schen Inseln des Pankreas gebildet und bei hhem Blutgluksespiegel ausgeschüttet. Über den Blutkreislauf gelangt das Insulin zum Zielgewebe (Leber, Muskulatur, Fett) und erhöht die Glukseaufnahme in Muskelund Fettzellen indem es den Einbau vn GLUT4 Transprtern in die Zellmembran stimuliert. Durch eine insulininduzierte Enzymaktivierung werden darüber hinaus viele Stffwechselprzesse beschleunigt: Glyklyse, Glykgensynthese, Lipidsynthese und Pentsephsphatweg. Dagegen werden Glykgenlyse, Gluknegenese und Liplyse durch Insulin gehemmt. 7.1 Nachweis der Insulinwirkung im Blut Die Bestimmung der Glukseknzentratin im Blut ist für diabetische Menschen und Tiere lebensntwendig. Die Gluksemessung erflgt in Kapillarblut mittels eines Glukmeters aus den Fingerkuppen (Menschen) und wahlweise an Pften- der Ohrkapillaren (Hund und Katze). Abhängig vn der gemessenen Glukseknzentratin wird die Menge an zu verabreichendem Insulin berechnet. Versuchsprinzip: Das aufgetrpfte Blut wird über eine Kapillare im Teststreifen in eine Reaktinskammer angesgen. Diese enthält das Enzym Gluksexidase. Die Gluksexidase katalysiert unter Anwesenheit vn Luftsauerstff die Oxidatin vn Glukse (C 6 H 12 O 6 ) in Glucnlactn (C 6 H 10 O 6 ), wbei der freiwerdende Wasserstff mit dem Luftsauerstff zu Wasserstffperxid (H 2 O 2 ) reagiert. Bei Einführen des Teststreifens in das Glukmeter wird die Reaktinskammer über integrierte Elektrden mit einer Spannungsquelle verbunden und dadurch das entstandene Wasserstffperxid elektrlytisch xidiert. Die dabei freiwerdenden Elektrnen werden auf die Kathde übertragen und der Strmfluss wird amperimetrisch gemessen. Das chemische Signal wird smit in ein elektrisches Signal 43
2 umgewandelt und der Messwert rechnerisch interpretiert. Die Höhe des Messwertes ist smit prprtinal zur Glukseknzentratin. Versuchsdurchführung: Zur Bestimmung der Glukseknzentratin wird zunächst mit einer Lanzette bei einem freiwilligen, nüchternen Prbanden eine Fingerkuppe angestchen und ein Trpfen Blut mit dem entsprechenden Testplättchen aufgefangen. Das Messergebnis wird abgelesen und festgehalten. Anschließend nimmt der Prband Nahrung zu sich und die Messung wird nach dem ben beschriebenen Versuchsprinzip nach ca. 1-2 Stunden wiederhlt. Messwert 1: Messwert 2: In welchem Verhältnis hat sich die gemessene Glukseknzentratin verändert? 7.2 Insulinnachweis mittels Enzyme-linked Immunsrbent Assay (ELISA) Versuchsprinzip: Der hier verwendete ELISA ist ein Enzymimmunassay, der auf der Sandwichtechnik basiert. Die Reaktinskammern der Mikrtiterplatte sind mit einem mnklnalen Antikörper beschichtet, der gegen eine definierte Antikörper-Bindungsstelle des Insulin-Mleküls gerichtet ist. Die Prben werden in die beschichteten Kammern gegeben und mit einem Enzym- Knjugat inkubiert. Das Knjugat enthält einen anti-insulin-antikörper, der mit Bitin knjugiert ist. Das nicht gebundene Knjugat wird durch Waschen der Kammern entfernt. In einer zweiten Inkubatin bindet ein Streptavidin-Perxidase-Enzymkmplex an den bitinylierten anti-insulin-antikörper. Nach einem weiteren Waschschritt wird die Substratlösung zugegeben und die Farbentwicklung nach einer definierten Zeit gestppt. Die Intensität der gebildeten Farbe ist prprtinal der Insulin-Knzentratin in der Prbe. Die Extinktin wird bei 450 nm mit einem Mikrtiterplattenleser gemessen. 44
3 Der ELISA ist ein quantitatives Nachweisverfahren. Fragestellung: In unserem Versuch sll in 3 verschiedenen Prben eine unbekannte Insulin- Knzentratin mittels ELISA ermittelt werden. Bitte machen Sie sich die Entstehung der Werte der Insulinknzentratin in den Prben deutlich. Versuchsdurchführung: Jeder Lauf muss eine Standardkurve beinhalten. 1. Vn den 5 Standards mit den Knzentratinen 0 µu/ml, 6,25 µu/ml, 12,5 µu/ml, 25 µu/ml und 50 µu/ml werden je 25 µl in eine Kammer einer Mikrtiterplatte pipettiert 2. Vn den 3 zu analysierenden Prben werden ebenfalls je 25 µl in eine entsprechende Kammer der Mikrtiterplatte pipettiert 3. Fügen Sie je 25 µl Enzym-Knjugat hinzu, und schwenken Sie die Platte im Anschluss für 10 Sekunden vrsichtig vn Hand. Es ist sehr wichtig in diesem Schritt eine kmplette Durchmischung zu erreichen 4. Inkubieren Sie 30 min bei Raumtemperatur 5. Anschließend werden die Kammern entleert und Restflüssigkeit durch ausklpfen auf Papier entfernt. Dann werden die Kammern 3 mal mit je 300 µl Waschlösung gewaschen. Achtung: Die Sensitivität und Präzisin des Versuches wird erheblich durch die krrekte Durchführung des Waschschrittes beeinflusst. Erklären Sie warum! 6. Pipettieren Sie je 50 µl Enzymkmplex hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur 45
4 7. Es flgt ein weiterer Waschschritt (siehe Schritt 5) 8. Fügen Sie 50 µl Substratlösung hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur 9. Stppen Sie die enzymatische Reaktin durch Zugabe vn je 50 µl Stpplösung 10. Bestimmen Sie die Optische Dichte bei 450 +/- 10 nm mit einem Mikrtiterplatten- Lesegerät innerhalb vn 10 Minuten nach Zugabe der Stpplösung Auswertung: 1. Ermitteln Sie eine Standardkurve durch Auftragen der Optischen Dichte (OD 450 ) jedes Standards gegen die angegebene Knzentratin des Standards (OD 450 = Y-Achse, Standard-Knzentratin = X-Achse) 2. Unter Verwendung der gemessenen OD 450 wird für jede Prbe die entsprechende Knzentratin auf der X-Achse ermittelt. Die Knzentratinen der Prben können direkt vn der Standardkurve abgelesen werden. Ermittelte Knzentratin der Prben: Der Hersteller des Testes gibt flgende Werte als physilgische Insulinknzentratinen im Blut an: 2 µu/ml bis 25 µu/ml. Der Messbereich des Tests liegt zwischen 1, µu/ml. Diskutieren Sie, b die ermittelte Knzentratin der Prben im physilgischen Bereich liegt bzw. was ein Wert außerhalb der physilgischen Knzentratin bedeuten könnte. 46
5 7.3 Charakterisierung und Trennung vn Vitaminen Vitamine sind rganische Verbindungen, die für lebenswichtige Funktinen (nicht Energiegewinnung!) essentiell sind, vm Organismus aber zum größten Teil nicht selbst synthetisiert werden können. Sie müssen deshalb mit der Nahrung zugeführt werden. Einige Vitamine können auch als Vrstufen (Prvitamine) aufgenmmen werden, die der Körper dann in die bilgisch aktive Frm umwandelt. Vitamine werden in zwei Klassen eingeteilt: - wasserlösliche Vitamine (z.b. Vitamin B 2 = Ribflavin, Vitamin C) - fettlösliche Vitamine: A, D, E, K (EDeKA) Vitamin C (Ascrbinsäure) ist ein Zuckerderivat, welches vn den meisten Spezies selbst gebildet werden kann. Eine Aufnahme aus der Nahrung ist abgesehen vm Menschen (Tagesbedarf mg), insbesndere beim Meerschweinchen (Tagesbedarf 10-15mg) swie bei Primaten (>1g) ntwendig. Vitamin C ist ein wichtiges Antixidans. Darüber hinaus ist es beteiligt an: Hydrxylierung vn Prlin (Kllagenbisynthese) Steriden Dpamin (zu Nradrenalin) Tryptphan (zu 5-Hydrxytryptphan) Umbau der Aminsäure Tryptphan zu Sertnin Bildung vn Gallensäuren Abbau cyclischer Aminsäuren Carnithinbisynthese Aufgabenstellung: Es sllen verschiedene Nahrungsquellen auf ihren Vitamin C-Gehalt untersucht werden: Apfel, Petersilie, rte Paprika und herkömmliche Vitamin C Trpfen für Meerschweinchen (Vitakraft). Aus den ben genannten Nahrungsquellen werden Prben entnmmen und mit zwei verschiedenen Verfahren der Vitamin C-Gehalt ermittelt. Erstellen Sie ein Kurzprtkll für die Extraktin des Vitamin C aus den verschiedenen Prben. 47
6 Versuchsdurchführung: A. Schnellnachweis: Quantfix -Teststäbchen Ascrbinsäure (M&N) zum Vitamin C- Nachweis Die Extrakte der entsprechenden Prben werden nacheinander auf die Teststäbchen getrpft. Anschließend erflgt der Abgleich mit der angegebenen Farbskala. B. Tillmans-Reagenz In einem Erlenmeyerklben wird 1 ml des zu untersuchenden Extraktes, bzw. Standards (1 mg/ml) vrgelegt. Dazu werden 9 ml Wasser pipettiert. Es wird bis zum Farbumschlag mit DCPIP titriert. Der Versuch ist zweimal durchzuführen. Aus den ermittelten Verbrauchsmengen an DCPIP wird der Mittelwert gebildet und anschließend die Knzentratin vn Vitamin C errechnet. Messwert Standard (1 mg/ml) in ml: Messwert 1 in ml: Messwert 2 in ml: Mittelwert in ml: Vitamin C-Gehalt: Ascrbinsäure (mg) = ä * *Verbrauchte ml = Mittelwert des verbrauchten DCPIP Vlumens pr Nahrungsquelle/Prbe Verbrauchte ml Ascrbinsäure-Standard = Mittelwert des verbrauchten DCPIP Vlumens bei der Titratin des Standards C. Berechnung der benötigten Tagesmenge des jeweiligen Futtermittels: Ergebnis in mg Teststäbchen Tillmanns Reagenz Literaturwerte Benötigte Tagesmenge (in g) Apfel Paprika, rt Petersilie Vitamin C Trpfen 48
7 Welche Angaben zur Vitamin C Knzentratin der untersuchten Nahrungsmittel finden sich in der Literatur? Diskutieren Sie b die unterstützende Gabe vn Vitamintrpfen beim Meerschweinchen sinnvll ist. 49
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