Phenylalanyl-tRNA Synthease von Thermus thermophilus Untersuchung der phest Gene und Reinigung des überexprimierten Enzyms

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1 Research Collection Doctoral Thesis Phenylalanyl-tRNA Synthease von Thermus thermophilus Untersuchung der phest Gene und Reinigung des überexprimierten Enzyms Author(s): Keller, Barbara Publication Date: 1994 Permanent Link: Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library

2 Olsa ETH e^'2> Dlss, ETHNr Phenylalanyl-tRNA Synthetase von Thermus thermophilus: Untersuchung der phest Gene und Reinigung des überexprinnierten Enzyms ABHANDLUNG zur Erlangung des Titels DOKTORIN DER NATURWISSENSCHAFTEN der EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE ZÜRICH vorgelegt von BARBARA KELLER Dipl. Natw. ETH geboren am 20. Oktober 1965 von Brugg und Remigen (AG) Angenommen auf Antrag von Prof. Dr. H. Hennecke, Referent Prof. Dr. M, Aebl, Korreferent Zürich 1994

3 2 Kurzfassung Die Phenylalanyl-tRNA Synthetase (PheRS), eine Klasse II AminoacyltRNA Synthetase, katalysiert die kovalente Verknüpfung von Phe nylalanin mit der trnaphe. An der PheRS aus T. thermophilus sind seit längerem Kristallstrukturuntersuchungen Im Gange, doch war zu Be ginn dieser Arbeit weder die DNA Sequenz der für dieses Enzym kodie renden Gene noch die Aminosauresequenz des Enzyms bekannt. Diese Arbeit befasste sich deshalb mit der Klonierung und Sequenzie rung dieser Gene, deren Expression in E. coli und der nachfolgenden Reinigung des uberexprimierten Enzyms. Das phes Gen kodiert für die a-untereinheit der PheRS, phetfui die ß-Untereinheit. Mit Hilfe von Oligonukleotiden, welche unter Berück sichtigung des Kodongebrauchs in T. thermophilus gemäss konservier ter Regionen von phes in E, coli und Hefe (cytoplasmatisch und mito chondrial) konstruiert worden waren, konnten in Southern Blot Hybridi sierungen T. thermophilus Fragmente identifiziert werden, welche die phest Gene enthielten. Diese Gene wurden daraufhin klonlert und sequenziert und damit die Primarstruktur der T. thermophilus PheRS aufgeklart: phes mit 1.05 kb kodiert für 350 Aminosäuren; für die PheRS a-untereinheit resultiert damit eine molekulare Masse von 39.3 kda. Das paiergen ist 2.36 kb lang; mit 795 Aminosäuren hat die ß-Untereinheit eine molekulare Masse von 86.6 kda. Es wurden Plasmide konstruiert, welche die T. thermophilus phest Gene in E. coli exprimieren sollten. Obwohl die Expression grundsatz lich gelang, führten Schwierigkelten bei der Expression der ß-Untereinhelt dazu, dass bei der nachfolgenden Reinigung des uberexprimier ten Proteins keine allzu grosse Ausbeute erzielt werden konnte. Die Reinigung erfolgte in fünf Schritten: zuerst wurde mit dem Zell-Rohextrakt eine Ammoniumsulfatfallung durchgeführt, gefolgt von einer Hitzebehandlung, danach waren drei Saulenchromatographieschritte notwendig, hydrophobe Interaktionschromatographie, Gelfiltration und Anionenaustauschchromatographie. Durch Bestimmung der kine tischen Parameter der Aminoacylierungsreaktion für die drei Substrate Phenylalanin, trnaphe und ATP wurde die gereinigte 7", thermophilus PheRS charakterisiert. Die Komplementation einer temperatursensitiven E, coli Mutante (Mutation im phes Gen) mit den Expressionsplasmiden gelang nicht. Der Grund dafür konnte in der geringen Aktivität der T. thermophilus PheRS bei 37 C liegen.

4 Kurzfassung 3 In einem weiteren Teil der Arbelt wurde das pheu Gen aus T. thermoprt//uskloniert und sequenziert, welches für ein Substrat der PheRS, die trnaphe, kodiert, Dieses Gen konnte wiederum durch Southern Blot Hybridisierungen mit für diesen Zweck hergestellten Oligonukleotiden identifiziert werden. Klonierung der pheu enthaltenden Fragmente in einen Vektor mit hoher Kopienzahl führte zu teilweiser Deletion dieser Fragmente, Das pheu Gen konnte schliesslich problemlos In einem Vektor mit kleiner Kopienzahl kloniert werden. Bei der Sequenzierung von pheu ergab sich eine Differenz in einem Nukleotid zur publizierten trnaphe Sequenz, welche durch Reinigung und Sequenzierung der trna bestimmt worden war. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Lage der phest und pheu Gene auf der T. thermophilus Chromosomenkarte bestimmt. pheu konnte dabei auf einem bisher nicht in der Karte vorhandenen, 950 bp grossen Hpa\ Fragment lokalisiert werden. Dadurch gelang es, pheu, als einziges Gen bisher, sehr präzise zu kartieren, wobei auch seine Orientierung auf der Karte festgelegt werden konnte. Die phest Gene kommen auf einen Sektor der Karte zu liegen, der noch von keinem Marker besetzt war.

5 4 ABSTRACT Phenylalanyl-tRNA synthetase (PheRS) Is a class II aminoacyl-trna synthetase which catalyses the covalent bonding of Phenylalanine to trnaphe. PheRS from T. thermophilus has for quite some time been the subject of X-ray crystallography studies, but at the beginning of this work, neither the DNA sequence of the genes coding for the enzyme nor the amino acld sequence of the enzyme itself were known. The topic of thls work, therefore, was the clonlng and sequencing of these genes, their expression in E. coli and purification of the overexpressed enzyme. The phes gene encodes the PheRS a-subunit, pftefencodes the ß- subunit. Using oligonucleotides adopted tothe T. thermophilus codon usage and derived from conserved phesregions in DNA of E coli and yeast (cytoplasmic and mitochondrial), phesr-containing fragments were identified in Southern blot hybridisations. Subsequently, the genes were cloned and sequenced, and the primary structure of PheRS was thus solved. The phes gene is 1.05 kb long, codes for 350 amino acids which result in a molecular mass of 39.3 kda for the PheRS a-subunlt. The phet gene with 2.36 kb codes for 795 amino acids; the ß-subunit, therefore, has a molecular mass of 86,6 kda. Plasmids for expression of the T. thermophilus phest genes in E. coli were constructed. While the expression of the genes was baslcally successfui, difficulties with the expression of the ß-subunit led to a low yield in the subsequent purification of the overexpressed protein. Purification of the protein was achieved in five steps: first, an ammonium sulphate precipitation was performed with the crude cell extract, followed by a heat treatment. Three column chromatography steps were necessary, which consisted of hydrophobic interaction chro matography, gelfiltratlon and anion exchange chromatography. Characterisation of the purified protein was accomplished by measuring its kinetlc Parameters for the three Substrates Phenylalanine, trnaphe and ATP in the aminoacylation reaction. The expression Plasmids were not able to complement a temperature sensitive E. coli mutant defectlve In the phes gene, This may be due to low activity of T. thermophilus PheRS at 37 C. In another part of this work, the pheu gene from T. thermophilus was cloned and sequenced. pheu codes for trnaphe, a Substrate of

6 ABSTRACT 5 PheRS. The gene could again be Identified by Southern blot hybridlsations, using oligonucleotides which were designed for this purpose. Cloning of fragments containing pheu in a high-copy vector led to partial deletion of these fragments. Cloning was finally achieved without problem in a low-copy vector. Sequencing of pheu revealed a difference in one nucieotide from the published trnaphe sequence, which had been determlned by purification and sequencing of the trna. In the last part of this work, phest and pheuv/eie mapped on the T. thermophilus physical chromosome map. pheu was located on a 950 bp Hpa\ fragment, not yet Included in the map. It was thus possible to determine the location of pheu very precisely on the genomic map, even Including its orientation. It is so far the only gene for which this has been possible. The phest genes mapped to a sector of the map, which was not yet occupied with a marker.